β-受體激動(dòng)劑的性質(zhì)及其殘留量測(cè)定時(shí)的關(guān)鍵點(diǎn)

周迎春 華向美 李單單

1.河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)服務(wù)中心 河南漯河 462300 2.漯河海關(guān) 河南漯河 462300

在國(guó)家相關(guān)監(jiān)管部門的重點(diǎn)監(jiān)管下，“瘦肉精”違禁添加到動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中的情況得到了有效控制，但是在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，仍有不法養(yǎng)殖者在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中非法使用β-受體激動(dòng)劑[1]，特別是在監(jiān)管難度較大的牛、羊養(yǎng)殖屠宰銷售環(huán)節(jié)，β-受體激動(dòng)劑的使用現(xiàn)象較嚴(yán)重[2]。2017年，“315晚會(huì)”中對(duì)違法使用“瘦肉精”進(jìn)行了點(diǎn)名報(bào)道。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在《2017年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全專項(xiàng)整治方案》中提出了“瘦肉精”專項(xiàng)整治行動(dòng)[3]。2021年央視“315晚會(huì)”曝光青縣“瘦肉精”羊肉問(wèn)題，再次將β-受體激動(dòng)劑推向了輿論高潮，引發(fā)人們對(duì)食品安全的恐慌。除了一些已知的β-激動(dòng)劑如CLB、RAC、SAL的濫用，新合成的β-受體激動(dòng)劑化合物，雖然具有不同的結(jié)構(gòu)，但是仍表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)再分配活性，如齊帕特羅、西布特羅、馬布特羅等。β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定，需要科學(xué)準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)作為保障。熟悉β-受體激動(dòng)劑的性質(zhì)及其檢測(cè)時(shí)的關(guān)鍵點(diǎn)是建立相應(yīng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)，也是實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)管的關(guān)鍵所在。

1 β-受體激動(dòng)劑的性質(zhì)

β-受體激動(dòng)劑俗稱“瘦肉精”，它的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為苯乙醇胺，具有典型芳香基團(tuán)、β-羥基和脂肪族氮的一類合成化合物，其功能與腎上腺素和去甲腎上腺素功能類似。β-受體激動(dòng)劑包括β1-激動(dòng)劑、β2-激動(dòng)劑和β3-激動(dòng)劑。根據(jù)苯環(huán)上取代基的差異，β-受體激動(dòng)劑又可分為苯胺型、苯酚型、鹵取代型3種類型。當(dāng)苯環(huán)上的取代基中具有氨基時(shí)，為苯胺型，例如CLB；當(dāng)苯環(huán)上的取代基具有羥基時(shí)，為苯酚型，例如SAL和RAC。由于酚羥基具有弱酸性，因此β-受體激動(dòng)劑在負(fù)離子模式下也具有一定響應(yīng)，但它們正離子模式下的響應(yīng)更好。當(dāng)苯環(huán)上的取代基僅有鹵元素時(shí)，為鹵取代型，例如馬布特羅。

β-受體激動(dòng)劑化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，加熱到172℃時(shí)才分解，因此，一般燒煮加熱方法不能將其破壞。β-激動(dòng)劑的物理和化學(xué)性質(zhì)相似，大多數(shù)β-激動(dòng)劑為白色結(jié)晶顆?；蚍勰?，無(wú)臭且苦[4]。SAL，分子式C13H21NO3，分子量239.3100，呈粉末狀，白色、基本無(wú)味，在乙醇中可快速溶解，微溶于水，熔點(diǎn)為154～158℃[5]。CLB，分子式C12H18Cl2N2O，分子量277.1000，為白色結(jié)晶固體，無(wú)臭，溶于水、乙醇，微溶于丙酮[6]。CLB經(jīng)人體吸收后，可導(dǎo)致血液中K+含量下降，從而使機(jī)體出現(xiàn)心律失常、急性中毒現(xiàn)象，搶救不及時(shí)甚至?xí)鹚劳鯷7]。RAC，分子式C18H23NO3，分子量301.3801，多以鹽酸鹽的形式存在，在丙酮中稍溶，可溶于水、乙醇[8]。西馬特羅(Cimaterol)，分子式C12H17N3O，分子量219.2800。齊帕特羅(Zilpaterol)，分子式C14H19N3O2，分子量261.3200。馬布特羅(Mabuterol)，分子式C13H18ClF3N2O，分子量310.7500。

2 β-受體激動(dòng)劑的作用及危害

β-受體激動(dòng)劑在臨床醫(yī)學(xué)中一般用作于治療哮喘藥物，該類物質(zhì)以超過(guò)治療劑量5～10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時(shí)，具有顯著的“營(yíng)養(yǎng)再分配效應(yīng)”，可促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積、脂肪分解并有效抑制脂肪沉積[9]，從而顯著降低脂肪含量、促進(jìn)肌肉纖維的生長(zhǎng)[10]、提高瘦肉率[11]和飼料轉(zhuǎn)化率[12]，但是β-激動(dòng)劑是一種非法的飼料添加劑。

β-受體激動(dòng)劑化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在動(dòng)物組織中不易被分解，因此可通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)逐漸積累，對(duì)人體健康有害[13]：可導(dǎo)致急性中毒，引起肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭暈、頭疼、惡心、嘔吐、心跳加速甚至心臟驟停致昏迷死亡等癥狀[14，15]，會(huì)導(dǎo)致染色體畸變的可能，誘發(fā)惡性腫瘤，特別是對(duì)高血壓、心臟病、青光眼、糖尿病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[16]。

3 各國(guó)對(duì)β-受體激動(dòng)劑的禁用情況

為了食品安全，1996年，歐盟96/22/EC令禁止將β-受體激動(dòng)劑用于食用動(dòng)物養(yǎng)殖中[17]；中國(guó)農(nóng)業(yè)部1997年發(fā)文禁止將“瘦肉精”使用在飼料和畜牧生產(chǎn)中；自2009年12月9日起，我國(guó)商務(wù)部禁止進(jìn)出口萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)與克倫特羅(Clenbuterol，CLB)；農(nóng)業(yè)部第176號(hào)[18]、第193號(hào)[19]和235號(hào)[20]公告明確將CLB、沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)、RAC、西馬特羅及其鹽類、酯類列為可食品動(dòng)物禁用的獸藥化合物清單，并規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出該類藥物；我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1519號(hào)禁止多種β-受體激動(dòng)劑在動(dòng)物飼料和飲用水中使用[21]；2011年國(guó)家食品安全委員會(huì)規(guī)定了16種禁用β-受體激動(dòng)劑的品種[22]。我國(guó)《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于印發(fā)茄果類蔬菜等58種無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)目錄的通知》(農(nóng)辦質(zhì)[2015]4號(hào))中規(guī)定牲畜的可食組織中的CLB、RAC和SAL是禁止檢出的。

由于肝臟、腎臟中的β-受體激動(dòng)劑殘留量較大且中國(guó)、俄羅斯和歐盟對(duì)內(nèi)臟的攝入量相對(duì)較多，因此他們均出臺(tái)了一系列法律法規(guī)，禁止在飼料中添加SAL、CLB、RAC等β-受體激動(dòng)劑[23]。美國(guó)、加拿大、日本等國(guó)家規(guī)定了殘留標(biāo)準(zhǔn)，但并沒(méi)有禁止使用“瘦肉精”[24，25]，包括美國(guó)在內(nèi)的其他22個(gè)國(guó)家，將RAC批準(zhǔn)用于豬、牛和火雞的動(dòng)物養(yǎng)殖，此外齊帕特羅被批準(zhǔn)用于南非和墨西哥的動(dòng)物養(yǎng)殖[26]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)規(guī)定，RAC在肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的最大殘留限量(MRL)分別為10、40、90和10μg/kg[27]。世界衛(wèi)生組織(WTO)和美國(guó)食品藥品管理局(FDA)以及國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)推薦CLB的MRL為：脂肪和肌肉中為0.2μg/kg。此外，歐洲立法提出了馬和牛肝臟中CLB的MRL為0.5μg/kg[28]，同樣，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.192-2003動(dòng)物性食品中克倫特羅檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)限(LOD)也定為0.5μg/kg[29]。日本與國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)推薦的豬、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL相同，均為10μg/kg，而澳大利亞對(duì)豬、牛脂肪和肌肉中RAC的MRL規(guī)定分別為：200μg/kg、50μg/kg[30]。此外，中國(guó)和歐盟普遍禁止所有化合物用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，并發(fā)布了大量法規(guī)來(lái)監(jiān)測(cè)和控制非法使用β-激動(dòng)劑作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑[31]。可見(jiàn)，制定科學(xué)準(zhǔn)確的β-激動(dòng)劑殘留量檢測(cè)方法也是應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易壁壘的有效措施。

4 β-受體激動(dòng)劑殘留量測(cè)定時(shí)的關(guān)鍵點(diǎn)

4.1 酶解提取

β-受體激動(dòng)劑的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)上均有烷羥基或羥基，在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過(guò)程中，它們大部分都與硫酸或葡萄糖醛酸發(fā)生作用，生成β-葡萄糖醛酸結(jié)合物和氧化產(chǎn)物[32]，這些代謝產(chǎn)物不易溶于有機(jī)試劑，但易溶于水[33]，因此樣品的前處理一般采用先水解使目標(biāo)化合物游離出來(lái)，再提取富集目標(biāo)化合物。水解常采用酶水解和酸水解2種。酸水解以使用無(wú)機(jī)酸為主，但無(wú)機(jī)酸的作用強(qiáng)度往往較大，不易準(zhǔn)確控制反應(yīng)過(guò)程。β-葡萄糖醛苷酶進(jìn)行水解處理過(guò)程中，一般不會(huì)破壞待測(cè)物β-受體激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)，重現(xiàn)性好，有利于提高方法的回收率[34]。

β-葡萄糖醛酸甙酶/芳香硫酸酯酶酶解有助于充分釋放組織中的β-受體激動(dòng)劑，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。苯胺型β-受體激動(dòng)劑的結(jié)構(gòu)軛合反應(yīng)率及蛋白結(jié)合率較低，如CLB。苯酚型β-受體激動(dòng)劑的軛合代謝過(guò)程較強(qiáng)，苯環(huán)上羥基是結(jié)合的位點(diǎn)，形成葡萄糖醛苷代謝物，如SAL在組織和排泄物中主要以硫酸軛合物、葡萄糖醛酸軛化物形式存在。RAC在組織和排泄物中也主要以葡萄糖醛酸軛化物形式存在。在酸性環(huán)境下，苯胺型β-受體激動(dòng)劑很容易由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，所以只測(cè)定CLB時(shí)，可以省去酶解步驟；SAL和RAC等苯酚型β-受體激動(dòng)劑軛合代謝過(guò)程較強(qiáng)與蛋白結(jié)合率高，所以這類β-受體激動(dòng)劑殘留量測(cè)定時(shí)是需要酶解的。石靜飛[35](2014)在前期研究基礎(chǔ)上優(yōu)化檢測(cè)方法，利用β-葡萄糖醛酸酶酶解樣品，酶解液經(jīng)5%氨水乙酸乙酯超聲提取，通過(guò)MCX固相萃取柱凈化，從而建立了一種沙丁胺醇、齊帕特羅、萊克多巴胺、克侖特羅、苯乙醇胺A共計(jì)5種β-受體激動(dòng)劑殘留量的檢測(cè)方法，測(cè)定對(duì)象主要有豬和山羊的肝臟、肌肉、脂肪、肺臟、大小腸、尿液、糞便和毛發(fā)等11種組織，該方法能夠滿足確證方法學(xué)要求。該研究表明，脂肪組織中SAL不酶解會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果。

目前動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 21313-2007、GB/T 22286-2008、SN/T 1924-2011及農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008，以上4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均采用37℃下避光酶解16h的方式把結(jié)合態(tài)的β-受體激動(dòng)劑釋放出來(lái)。有研究表明：40℃避光水浴酶解2h后，測(cè)得CLB、SAL、RAC的回收率、提取率、和精密度也均能滿足實(shí)驗(yàn)要求，可見(jiàn)通過(guò)優(yōu)化酶解溫度、酶解時(shí)間，可以有效縮短實(shí)驗(yàn)室前處理時(shí)間，提高了檢測(cè)效率[36]。

樣品中的基質(zhì)成分可以增強(qiáng)或抑制被分析物的響應(yīng)，高效的樣品制備可在一定程度上減弱基質(zhì)效應(yīng)。同位素內(nèi)標(biāo)使用簡(jiǎn)便，可有效提高回收率和檢測(cè)準(zhǔn)確度。常用的同位素內(nèi)標(biāo)包括氘代同位素內(nèi)標(biāo)和碳同位素內(nèi)標(biāo)，β-受體激動(dòng)劑殘留量檢測(cè)時(shí)一般用氘代同位素內(nèi)標(biāo)。

4.2 凈化和濃縮

適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚砜蓽p少干擾和避免可能的基質(zhì)效應(yīng)[37]。β-激動(dòng)劑在游離狀態(tài)下可溶于大多數(shù)有機(jī)極性溶劑和弱酸性或弱堿性的無(wú)機(jī)溶劑中[38]。鹽酸CLB為強(qiáng)極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙醇和水，微溶于丙酮，不溶于乙醚。這些鹽不具有非極性結(jié)構(gòu)，因此不溶于疏水溶液，其在疏水溶液中的不溶性可用于提取純物質(zhì)[39]。正己烷作為疏水溶劑，去除脂肪方便、快捷，因此采用正己烷對(duì)β-受體激動(dòng)劑提取液進(jìn)行除脂。

眾所周知，樣品前處理是痕量殘留特別是非法藥品殘留分析中的一個(gè)重要步驟。由于實(shí)際樣品中目標(biāo)分析物的微量濃度和食品基質(zhì)的復(fù)雜性[40]，食用脂肪中β-激動(dòng)劑藥物的測(cè)定是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。液液萃取，固相萃取(SPE)、微萃取和分子印跡聚合物萃取或上述樣品制備方法的集成程序，用于對(duì)復(fù)雜樣品的清理，以減少樣品基質(zhì)干擾[41]，具有重現(xiàn)性好、回收高等優(yōu)勢(shì)[42]。MCX小柱可有效吸附混合型陽(yáng)離子以及堿性物質(zhì)，而MAX小柱對(duì)混合型陰離子以及酸性物質(zhì)具有更高的吸附力[43]，因此，可選用MCX固相萃取小柱對(duì)樣液進(jìn)行凈化。

洗脫階段是利用MCX固相萃取小柱凈化的關(guān)鍵步驟，一般情況下β-受體激動(dòng)劑多使用氨化有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫。由于CLB、SAL、RAC等β-受體激動(dòng)劑的分子結(jié)構(gòu)中都存在氨基和羥基，屬于酸堿兩性基團(tuán)，因此在選擇洗脫液時(shí)，常用氨化甲醇或用異丙醇等帶羥基的試劑，如氨化甲醇、氨化乙酸乙酯等。

真空水浴抽干耗時(shí)較長(zhǎng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)較氮吹耗時(shí)短，但易損失、純化程度不高[35]，因此采用氮吹進(jìn)行濃縮更有利于β-受體激動(dòng)劑殘留量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

4.3 儀器條件

基于HPLC、GC-MS、LC-MS或LC-MS/MS、毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)和免疫分析法(EIA)的多種分析方法均可用于檢測(cè)β-激動(dòng)劑。在這些方法中，LC-MS/MS方法被認(rèn)為是目前檢測(cè)食品中多種獸藥最合適的技術(shù)，對(duì)定量測(cè)定的靈敏度和選擇性最高，提供了明確的識(shí)別和可靠的確認(rèn)，已發(fā)展成為主要的分析方法[44]。

動(dòng)物體內(nèi)β-激動(dòng)劑及其產(chǎn)品檢測(cè)的確證方法主要采用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)。在確認(rèn)目的的框架內(nèi)，質(zhì)譜法是歐洲立法考慮到的唯一分析技術(shù)。GC-MS可用于β-激動(dòng)劑的定量和定性分析，但由于β-激動(dòng)劑的極性強(qiáng)，衍生過(guò)程復(fù)雜，使用液相色譜(LC)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)已被公認(rèn)為β-激動(dòng)劑的檢測(cè)技術(shù)。LC-MS/MS結(jié)合了LC的分析分離功能以及MS的鑒定及解析結(jié)構(gòu)[45]，有著準(zhǔn)確度高、專屬性好、精密度高、靈敏度高等明顯優(yōu)勢(shì)[46]。

迄今為止，已有大量基于LC-MS/MS的分析方法用于檢測(cè)不同樣品基質(zhì)中的β-激動(dòng)劑[27]。如現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4817-2017中就是采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對(duì)進(jìn)出口食用動(dòng)物中CLB、SAL、RAC殘留量的測(cè)定[47]。LC-MS/MS分析中常用的質(zhì)譜離子源是電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)，APCI適合分析中等極性及弱極性的化合物，ESI用于大分子或極性的化合物，β-受體激動(dòng)劑屬于強(qiáng)極性化合物，因此本標(biāo)準(zhǔn)采用了ESI源作為離子源進(jìn)行檢測(cè)[48]。依據(jù)β-受體激動(dòng)劑屬于堿性物質(zhì)，選用正離子模式進(jìn)行分析測(cè)定。

5 小結(jié)

β-受體激動(dòng)劑作為一類物質(zhì)，具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在實(shí)際檢測(cè)中，將β-受體激動(dòng)劑從樣品組織中有效游離出來(lái)，實(shí)現(xiàn)β-受體激動(dòng)劑的高效富集及凈化，保證儀器檢測(cè)的準(zhǔn)確性是β-受體激動(dòng)劑殘留量測(cè)定時(shí)的關(guān)鍵步驟，決定著檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性。