石鳳垚,李文慧,趙紅宇,王 陽,莊瑞雪,芮 榮,劇世強

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院, 南京 210095)

近年來，因江、河、湖泊等水體富營養(yǎng)化日益加重所導致的藍藻水華(cyanobacteria bloom)頻繁爆發(fā)已引起公眾的廣泛關(guān)注，尤其是由富營養(yǎng)化水體中藍藻所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物-微囊藻毒素(microcystins, MCs)，分布范圍廣，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且毒性作用強，可對動物及人類健康造成嚴重威脅[1-4]。MCs極易溶于水，耐熱且化學性質(zhì)穩(wěn)定，現(xiàn)有手段很難將其從飲用水源中去除[5]。MCs可通過受污染的飲用水、水產(chǎn)品、農(nóng)作物及飼料等途徑進入動物機體，并通過食物鏈累積效應使動物機體積累更高濃度的MCs，對機體肝、腎、生殖、神經(jīng)等組織器官產(chǎn)生毒性作用[6-8]。在目前已知的200多種MCs異構(gòu)體中[4]，微囊藻毒素-LR (MC-LR)是分布最廣，且毒性作用最強的一種微囊藻毒素[9-11]。已有研究表明，MC-LR對動物肝、腎等多種組織器官均具有明顯的毒性損傷作用[12-15]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，動物性腺也是MC-LR重要的靶器官之一[13,16]，MC-LR不僅可以在肝、腎等多種組織中積聚，也會在動物的性腺中積累，并產(chǎn)生毒性損傷，影響動物的生殖功能[17-20]。研究表明，長期接觸MC-LR會導致雄性小鼠精子數(shù)量減少、活力降低，并使血清睪酮水平明顯下降[21]；可引起大鼠睪丸間質(zhì)細胞活性氧(ROS)激增，致使細胞發(fā)生凋亡[22]。在對雌性動物的研究中發(fā)現(xiàn)，MC-LR可導致小鼠卵巢內(nèi)高質(zhì)量卵泡數(shù)量減少、血清激素水平紊亂，并導致發(fā)情周期異常[23]；還可使中國倉鼠卵巢顆粒細胞發(fā)生氧化應激，破壞細胞骨架，致使細胞周期阻滯，并最終誘導細胞凋亡[24-25]。這些結(jié)果初步揭示了MC-LR對動物生殖也具有潛在的毒性作用。

本試驗以體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細胞為研究對象，通過免疫熒光結(jié)合激光共聚焦成像等技術(shù)分析不同濃度MC-LR對豬卵母細胞成熟過程中細胞骨架、氧化應激以及早期凋亡的影響，探究MC-LR對動物卵母細胞的毒性損傷作用，為后續(xù)進一步研究MC-LR的生殖毒性作用及其機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

微囊藻毒素-LR (MC-LR)購自普瑞邦生物工程有限公司；TCM 199購自Gibico公司；鼠抗α-tubulin-FITC單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司；活性氧(ROS)試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒購自南京建成生物有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司。其他試劑若無特殊標注均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.2 豬卵母細胞培養(yǎng)與處理

豬卵巢樣品購自南京元潤食品有限公司屠宰場，置于37 ℃生理鹽水中，2 h內(nèi)運至實驗室。選取卵巢上直徑約為3～6 mm的卵泡，抽取其中的卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes, COCs)，在體視顯微鏡下挑撿胞質(zhì)均勻、且包被3層以上卵丘細胞的COCs。根據(jù)試驗設(shè)計，將所收集的COCs隨機分為4組，分別置于已添加不同濃度MC-LR (0、20、40和60 μg·mL-1)的TCM199培養(yǎng)液中進行體外成熟培養(yǎng)。在體外成熟培養(yǎng)44 h后收集COCs，經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶消化，去除卵丘細胞后，分別進行第一極體(first polar body，PbⅠ)鏡檢、免疫熒光染色及RT-qPCR等檢測。

1.3 間接免疫熒光染色

將所收集的卵母細胞樣品，用4%多聚甲醛室溫固定1 h后轉(zhuǎn)入1% 的TritonX-100中于飽和濕度的濕盒中室溫通透8 h，再用1%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)于濕盒中室溫封閉1 h， 之后與異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的抗α-tubulin-FITC抗體(1∶200)在室溫孵育2 h，最后用10 μg·mL-1的Hoechst33342避光染色15 min后進行封片，置于激光共聚焦熒光顯微鏡下進行觀察分析。

1.4 卵母細胞內(nèi)ROS水平檢測

試驗前用TCM 199成熟培養(yǎng)液將DCFH-DA稀釋成10 μmol·L-1工作液，置于培養(yǎng)箱中平衡30 min。 將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中清洗3次后置于工作液中，于培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。 孵育完成并經(jīng)PBS清洗3次后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。

1.5 卵母細胞內(nèi)谷胱甘肽含量測定

將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中洗3次，再移入含1 mL PBS的離心管中，按照谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒說明書介紹的方法對各組卵母細胞GSH-Px酶活力進行測定。

1.6 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測

將去除卵丘細胞的卵母細胞移入PBS中清洗3次， 按照Annexin V-FITC凋亡檢測盒說明書介紹的方法，將卵母細胞置于含5% Annexin-V-FITC的PBS緩沖液中，在37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育10 min，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察分析。

1.7 氧化應激和凋亡相關(guān)基因RT-qPCR測定

每組收集100枚卵母細胞樣品，按 Trizol 試劑盒說明書提取細胞總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按照TB Green qPCR試劑盒說明書檢測 mRNA 的表達水平，反應產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線檢測特異性。用 2-ΔΔCT法計算各基因mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences used for real-time PCR

1.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 MC-LR對豬卵母細胞體外成熟的影響

卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度MC-LR(0、20、40、60 μg·mL-1)對豬卵母細胞PbⅠ排出影響的試驗結(jié)果見圖1。隨著MC-LR毒素濃度增加，卵母細胞PbⅠ排出率呈明顯的下降趨勢，并具有劑量依賴性。與對照組(73.20%)相比，20 μg·mL-1MC-LR試驗組的PbⅠ排出率(69.59%)略有下降，并無顯著差異(P>0.05)；當MC-LR作用濃度分別達到40 和60 μg·mL-1時，卵母細胞PbⅠ排出率分別極顯著下降至59.96% (P<0.01)與51.64% (P<0.001)。 這一研究結(jié)果表明，當MC-LR作用濃度達到40 μg·mL-1及以上時，豬卵母細胞PbⅠ排出受到極顯著抑制，導致卵母細胞成熟進程受阻。

A. MC-LR處理導致豬卵母細胞第一極體(PbⅠ)排出失敗; B. MC-LR處理導致卵母細胞PbⅠ排出率顯著下降：n表示卵母細胞樣本數(shù)。**.P<0.01, ***.P<0.001。下圖同A. Oocytes failed to extrude the first polar bodies (PbI) after MC-LR treatment; B. The PbI extrusion rate was significantly reduced after MC-LR treatment: n. Sample number. **. P<0.01, ***. P<0.001. The same as below圖1 MC-LR對豬卵母細胞體外成熟的影響Fig.1 Effect of MC-LR on the maturation in vitro of porcine oocytes

2.2 MC-LR對豬卵母細胞紡錘體結(jié)構(gòu)的影響

為探究MC-LR抑制豬卵母細胞PbⅠ排出的原因，本研究采用間接免疫熒光染色與激光共聚焦成像技術(shù)檢查并分析了MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細胞紡錘體及染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與動態(tài)分布的變化情況。由圖2A可見，經(jīng)44 h體外成熟培養(yǎng)，對照組卵母細胞的微管蛋白α-tubulin組裝成典型的紡錘體結(jié)構(gòu)，且染色體整齊排列在赤道板上；而處理組卵母細胞的微管蛋白α-tubulin分布紊亂，紡錘體結(jié)構(gòu)異常，染色體也隨之無規(guī)律排列。由圖2B可見，與對照組(25.13%)相比，MC-LR處理組的紡錘體異常率極顯著升高(62.52%，P<0.001)。這一結(jié)果提示，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的毒性損傷作用。

A. MC-LR處理導致豬卵母細胞紡錘體結(jié)構(gòu)異常(綠色:紡錘體; 藍色:染色體); B. MC-LR處理導致卵母細胞錘體結(jié)構(gòu)異常率顯著升高A. MC-LR treatment resulted in abnormal spindle structure of porcine oocytes (Green: Spindle; Blue: Chromosome); B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in spindle structure abnormality rate of porcine oocytes圖2 MC-LR對豬卵母細胞紡錘體結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of MC-LR treatment on the spindle structure of porcine oocytes

2.3 MC-LR誘導豬卵母細胞氧化應激的檢測

為進一步研究MC-LR處理導致豬卵母細胞成熟失敗的原因，利用熒光探針DCFH-DA檢測了MC-LR (60 μg·mL-1)處理后卵母細胞ROS水平的變化情況，結(jié)果見圖3。MC-LR處理組卵母細胞的ROS平均熒光強度極顯著高于對照組(P<0.01)。

A.MC-LR 處理導致卵母細胞ROS水平升高；B．MC-LR 處理導致卵母細胞ROS平均熒光強度顯著升高A.MC-LR treatment resulted in higher ROS levels in oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the average fluorescence intensity of ROS in oocytes圖3 MC-LR對豬卵母細胞ROS水平的影響Fig.3 Effect of MC-LR treatment on ROS levels in porcine oocytes

在檢測卵母細胞ROS水平基礎(chǔ)上，為進一步研究MC-LR處理對豬卵母細胞氧化應激的影響，檢測分析了MC-LR作用對卵母細胞GSH-Px活力及抗氧化相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達的影響，結(jié)果如圖4A所示，MC-LR處理組卵母細胞GSH-Px活力極顯著降低(P<0.01)；從圖4B可知，MC-LR處理組卵母細胞，除SOD2無明顯變化外，SOD1、CAT和GSH-Px的mRNA水平均極顯著下降(P<0.01)。說明，MC-LR處理導致豬卵母細胞在體外成熟過程中產(chǎn)生了明顯的氧化應激，且卵母細胞的抗氧化能力顯著下降。

A.MC-LR處理導致卵母細胞GSH-Px活力顯著降低；B．MC-LR處理對卵母細胞氧化應激相關(guān)基因表達的影響A.MC-LR treatment resulted in lower GSH-Px levels in oocytes; B. Effect of MC-LR treatment on the expression of oxidative stress related genes in oocytes圖4 MC-LR對豬卵母細胞GSH-Px活力及抗氧化相關(guān)基因表達的影響Fig.4 Effect of MC-LR treatment on GSH-Px activity and mRNA expression of oxidative stress related genes in porcine oocytes

2.4 MC-LR引發(fā)豬卵母細胞凋亡的檢測

因氧化應激與細胞凋亡密切相關(guān)，在檢測卵母細胞氧化應激的基礎(chǔ)上，進一步通過Annexin-V染色檢測MC-LR(60 μg·mL-1)處理后卵母細胞早期凋亡情況，結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，MC-LR 處理后卵母細胞發(fā)生早期凋亡的細胞比率從28.53%極顯著升高至59.35%(P<0.01)。

A.MC-LR 處理誘導了卵母細胞早期凋亡；B.MC-LR 處理導致卵母細胞凋亡率顯著升高A.MC-LR treatment induced the early apoptosis of oocytes; B. MC-LR treatment resulted in a significant increase in the apoptosis rate of oocytes圖5 MC-LR對豬卵母細胞早期凋亡的影響Fig.5 Effect of MC-LR treatment on the early-stage apoptosis of porcine oocytes

為進一步研究MC-LR處理對豬卵母細胞凋亡的影響，應用RT-qPCR技術(shù)分析了MC-LR處理后卵母細胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl2 的mRNA表達，結(jié)果如圖6所示，MC-LR處理后，BaxmRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)，Bcl2 mRNA的表達極顯著下調(diào)(P<0.001)，Bax/Bcl2的比值極顯著升高(P<0.001)。

圖6 MC-LR對豬卵母細胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig.6 Effect of MC-LR treatment on the mRNA expression of early apoptosis related genes in porcine oocytes

3 討 論

MC-LR是所有微囊藻毒素中毒性最強的一類環(huán)狀七肽，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分布廣泛，可通過飲用水或受污染的食物進入動物體內(nèi)，對多種組織器官產(chǎn)生毒性作用。已有研究表明，MC-LR可在卵巢中積累并產(chǎn)生生殖毒性[23]，誘導顆粒細胞氧化應激，促進卵泡閉鎖，致使小鼠不育[24-25]。MC-LR甚至還可以通過胎盤屏障影響胎兒肝、腎及大腦等組織器官的形成和發(fā)育[26-28]。這些結(jié)果表明，MC-LR對雌性動物的生殖發(fā)育具有潛在的毒性作用，但MC-LR是否會對哺乳動物卵母細胞產(chǎn)生毒性作用目前尚不明確。本研究以體外成熟培養(yǎng)的豬卵母細胞為研究模型，探討了不同濃度MC-LR對豬卵母細胞的毒性損傷作用，結(jié)果表明，MC-LR可顯著抑制豬卵母細胞成熟，其毒性作用機制與誘導紡錘體結(jié)構(gòu)損傷、引發(fā)氧化應激與早期細胞凋亡密切相關(guān)。

本研究首先發(fā)現(xiàn)，MC-LR對豬卵母細胞體外成熟具有明顯的抑制作用，并具有劑量依賴性，當以40 μg·mL-1以上MC-LR處理豬卵母細胞時，其第一極體排出率會顯著下降。在動物卵母細胞減數(shù)分裂過程中，紡錘體的正確組裝與動態(tài)分布對于染色體的精確分離與極體的順利排出等生物學事件起著至關(guān)重要的作用[29]。因此，本研究進一步通過激光共聚焦掃描技術(shù)對卵母細胞的紡錘體等亞細胞結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC-LR作用后卵母細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重缺陷，并伴隨同源染色體分離的異常，導致卵母細胞第一極體排出失敗。這一結(jié)果提示，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的毒性損傷作用。已有的研究結(jié)果也證實，MC-LR可對其他多種細胞模型的細胞骨架結(jié)構(gòu)造成損傷[30-31]，F(xiàn)range?等[32]在兔胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，用10 μmol·L-1的MC-LR處理胚胎細胞24 h，即可導致細胞的紡錘體微管在細胞核周圍發(fā)生塌陷并重組，Chen等[33]以雄性大鼠為研究模型，進一步從基因轉(zhuǎn)錄水平研究發(fā)現(xiàn)，MC-LR可破壞睪丸組織細胞骨架相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性。這些研究結(jié)果表明，MC-LR可通過破壞細胞的紡錘體微管系統(tǒng)對細胞產(chǎn)生毒性損傷。在本研究中，MC-LR使卵母細胞紡錘體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，進而影響了同源染色體精確分離，最終導致卵母細胞第一極體無法排出。

已有研究表明，MC-LR的毒性作用機制主要是通過產(chǎn)生過量的ROS來誘導氧化應激，導致細胞功能障礙，引發(fā)細胞凋亡[34-35]。哺乳動物的卵母細胞和胚胎對ROS十分敏感，在卵母細胞減數(shù)分裂、胚胎發(fā)育及細胞死亡等生理過程中，ROS發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它和抗氧化劑之間的動態(tài)平衡確保了卵母細胞及胚胎正常發(fā)育[36-37]。為進一步驗證MC-LR對豬卵母細胞的毒性作用機制是否與氧化損傷有關(guān)，本研究對MC-LR處理后卵母細胞的ROS水平及抗氧化相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-Px的表達進行了檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵母細胞的ROS水平顯著增加，提示MC-LR處理導致卵母細胞發(fā)生了明顯的氧化應激反應，與此同時，部分抗氧化酶基因(SOD1、CAT和GSH-Px)表達水平也明顯下調(diào)，進一步說明MC-LR作用44 h后，卵母細胞的抗氧化能力已顯著下降。因此推測，MC-LR誘導豬卵母細胞發(fā)生氧化應激，并破壞了細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，導致卵母細胞發(fā)生氧化損傷。細胞的氧化損傷與凋亡密切相關(guān)，高水平的ROS會通過改變線粒體通透性破壞線粒體動力學，引起線粒體功能障礙，導致由線粒體介導的細胞凋亡[38-41]。本試驗通過Annexin-V染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MC-LR處理的卵母細胞早期凋亡率顯著增加，RT-qPCR結(jié)果也顯示，凋亡相關(guān)基因Bax轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，Bcl2轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，Bax/Bcl2比值顯著升高。因此推測，MC-LR通過誘導豬卵母細胞氧化應激，進一步導致細胞發(fā)生早期凋亡。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果證明，MC-LR對豬卵母細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)具有明顯的損傷作用，致使第一極體無法排出，最終導致卵母細胞成熟失??；MC-LR對豬卵母細胞的毒性損傷作用機制與誘導氧化損傷及細胞凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果為深入探討MC-LR對哺乳動物卵母細胞的毒性作用及其機制提供了試驗依據(jù)。