朱 峰，譚家亮，吳 江，楊 茹，畢 昊，夏劍波

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022 2廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)外科，廣州 510510 3湖北省陽(yáng)新縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，陽(yáng)新 435200 4武漢血液中心輸血研究所，武漢 430030 5華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北省婦幼保健院檢驗(yàn)科，武漢 430070

朊病毒病(Prion disease)是由朊病毒感染引起的神經(jīng)退行性疾病。朊病毒是正常的朊蛋白(PrPC)發(fā)生構(gòu)象變化后形成具有部分蛋白酶K(proteinase K，PK)抗性的異常朊蛋白(PrPSc)粒子，主要侵襲人類(lèi)和動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，致死率為100%。在動(dòng)物中，最常見(jiàn)的朊病毒病包括羊的瘙癢病(scrapie)、牛的海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease，CWD)。人類(lèi)朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、致死性家族性失眠(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)、庫(kù)魯病(Kuru disease)和gerstmann-strausler-scheinker綜合征(GSS)[1]。人類(lèi)朊病毒病可以分為散發(fā)性、家族性及獲得性。食用朊病毒感染的牛肉可獲得變異型CJD(variant CJD，vCJD)。vCJD已證實(shí)可通過(guò)輸血在人群間傳播[2]。朊病毒病可以跨物種傳播，并可在人群間傳播，因此對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成很大危害，朊病毒病的診斷對(duì)保障公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

根據(jù)“唯蛋白質(zhì)”假說(shuō)，朊病毒曾被認(rèn)為是不含核酸的感染性病原體，有別于細(xì)菌、病毒和真菌等。所有形式的朊病毒疾病都有一個(gè)共同的致病機(jī)制，即宿主編碼的正常PrPC轉(zhuǎn)化為致病性PrPSc。PrPSc具有不溶性、致病性和傳染性的特點(diǎn)。構(gòu)象變化后形成的β-折疊結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是賦予PrPSc抗蛋白酶特性的原因，并導(dǎo)致各種構(gòu)象的PrPSc的形成，它們統(tǒng)稱(chēng)為朊病毒株。迄今為止，許多針對(duì)朊蛋白的抗體已被研制以用于診斷，然而，它們大多數(shù)缺乏對(duì)PrPSc識(shí)別的特異性，不能區(qū)分PrPC和PrPSc，限制了其應(yīng)用，因此有待研發(fā)能特異性結(jié)合PrPSc的分子，以提升PrPSc的檢測(cè)水平[3]。值得注意的是，在研究核酸對(duì)朊病毒構(gòu)象轉(zhuǎn)換作用時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Ff絲狀噬菌體的基因5蛋白(G5P)，能特異性地結(jié)合PrPSc[4]，顯示出G5P在朊病毒病的研究與診斷方面的應(yīng)用潛力。野生型G5P廣泛存在于細(xì)菌中，但含量較低且不易收集。本研究利用基因克隆技術(shù)表達(dá)純化重組G5P，并分析其檢測(cè)PrPSc的能力，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒E.coliDH5α菌株、E.coliBL21(DE3)菌株購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。質(zhì)粒pET-28a-c(+)由協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 腦組織 非CJD人腦組織塊通過(guò)在湖北省陽(yáng)新縣婦幼保健院行流產(chǎn)的死胎嬰兒獲得。散發(fā)性克雅氏病(sporadic Creutzfeldt-Jakob disease，sCJD)患者腦組織塊由廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)外科饋贈(zèng)。非CJD及sCJD人腦組織塊冷凍儲(chǔ)存于-80℃冰箱。sCJD的診斷依據(jù)《神經(jīng)病學(xué)》(第7版)(人民衛(wèi)生出版社出版)提供的朊病毒的疑似診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)患者臨床表現(xiàn)及顱腦MRI、腦電圖、肌電圖等各項(xiàng)檢查結(jié)果，臨床診斷疑為sCJD。經(jīng)患者家屬同意，采集腦組織塊，經(jīng)PrPSc的蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot，WB)檢測(cè)確診。本研究遵照中國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)和湖北省陽(yáng)新縣婦幼保健院臨床項(xiàng)目機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的指導(dǎo)文件，經(jīng)湖北省陽(yáng)新縣婦幼保健院人類(lèi)研究機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 主要試劑和儀器 限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ、EcoRⅠ及T4連接酶購(gòu)自日本Toyobo公司。普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。PfuDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。His-Tag蛋白純化柱(Proteinlso Ni-NTA Resin)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。磁珠(Dynabeads? M-280 Tosylactivated)購(gòu)自北京思爾成生物技術(shù)有限公司。朊蛋白的鼠抗人單抗3F4購(gòu)自Prioncs AC公司(瑞士)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的綿羊抗鼠二抗購(gòu)自Amersham-Pharmacia公司(美國(guó))。蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自Merck公司。ECL Kit購(gòu)自Perkin-Elmer公司。蛋白酶K購(gòu)自Sigma公司。其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑盒生化試劑均購(gòu)自國(guó)藥有限公司。主要儀器包括PCR擴(kuò)增儀(日本，BIO-Rad 10213型)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器制造廠，DYY-8C型)，蛋白電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY-SCZ2+)，核酸蛋白微量分析儀(ND2000)，凝膠成像分析儀(北京市六一儀器制造廠，WD-9413B型)，電熱恒溫水浴箱(北京，HH-W21-C 8600型)，臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭，TGL-16B)，超聲波破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 重組子pET-28a-c(+)-G5P的構(gòu)建

參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法構(gòu)建重組子。G5P基因由武漢光谷創(chuàng)贏生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司根據(jù)GenBank提供的G5P的基因信息(Accession No.J02450)合成。為了提高G5P重組蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)，G5P基因中的原稀有密碼子改為偏好密碼子。同時(shí)在G5P基因的5′和3′端分別引入XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，具體基因序列信息如圖1所示。合成的目的基因和質(zhì)粒pET-28a-c(+)，分別用EcoRⅠ和XhoⅠ于37℃水浴雙酶切4 h，各自回收后，將酶切回收的目的基因和質(zhì)粒用T4 DNA連接酶于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)10 h。連接產(chǎn)物即重組子轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，利用菌落PCR(特異引物P1：CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT，P2：ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG)和酶切鑒定法(EcoRⅠ和XhoⅠ)進(jìn)行重組子的初步驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行核酸序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相符的重組子命名為pET-28a-c(+)-G5P。

1.3 重組G5P蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的最適條件進(jìn)行。將質(zhì)粒pET-28a-c(+)-G5P轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落接種到含卡那霉素(50 μg/mL)的2 mL LB培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。次日取菌液50 μL接種到100 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。第3日將菌液全部移至1 L含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至菌液A600=0.5～0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，37℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集菌液。于4 ℃、8000 r/min離心20 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用1/10的裂解液(NaH2PO420 mmo1/L、NaCl 0.5 mol/L、1 % Triton X-100，pH7.4)重懸，超聲波破碎，4 ℃、12000 r/min離心20 min，收集上清液，加入終濃度為5 μg/mL的DNase和RNase，30℃水浴30 min。使用Ni+-NTA瓊脂糖層析柱純化上清液中的目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠的構(gòu)建

重組G5P蛋白與磁珠的偶聯(lián)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1 mg純化的重組G5P蛋白與4 mL(約8×109個(gè))P-甲苯磺酰基團(tuán)修飾的磁珠溶于1 mL PBS，37℃孵育過(guò)夜。重組G5P蛋白偶聯(lián)修飾后的磁珠重懸于含0.1 %牛血清白蛋白的BSA溶液，37℃孵育過(guò)夜，以封閉磁珠上未被重組G5P蛋白偶聯(lián)的P-甲苯磺酰基團(tuán)位點(diǎn)。

1.5 腦勻漿液的制備

將50 mg的非CJD及sCJD患者腦組織塊溶于5 mL裂解液(100 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，0.5% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，10 mmol/L Tris·HCl，pH 7.5)，用研磨器研磨成組織勻漿粗液，4℃、10000 r/min離心4 min，取上清備用。

1.6 重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠對(duì)腦勻漿液的捕獲實(shí)驗(yàn)

將10 μL非CJD或sCJD患者腦組織勻漿液與重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠(約8×107個(gè)磁珠)一起混合于1 mL結(jié)合液(含3% Tween-20，3% NP-40的PBS，pH 7.5)，室溫，持續(xù)振搖過(guò)夜。用磁力將磁珠吸附于管側(cè)壁，棄上清以除去未與重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠結(jié)合的物質(zhì)。用清洗液(含2% Tween-20，2% NP-40的PBS，pH 7.5)清洗磁珠3次后，將重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠重懸于Western blot的上樣液(3% SDS，2 mmol/L EDTA，10 % glycerol，50 mmol/L Tris，pH 6.8)以進(jìn)行朊蛋白的Western blot檢測(cè)。

1.7 朊蛋白的Western blot檢測(cè)

按照Western blot常規(guī)方法進(jìn)行。分離膠濃度為15%，蛋白電泳條件為電壓120 V，30 min，然后150 V，60 min。轉(zhuǎn)膜條件為恒流0.35 A，2 h。一抗為朊蛋白的鼠抗人單抗3F4(1∶50000)，二抗為羊抗鼠多克隆抗體(1∶3000)，ECL顯影。

1.8 蛋白酶K水解

為了區(qū)分PrPC和PrPSc，在含有朊蛋白的溶液中加入終濃度為50 μg/mL的蛋白酶K，在42℃條件下，混合振蕩70 min后，加入終濃度為1 mmol/L PMSF終止反應(yīng)。水解后的樣本進(jìn)行朊蛋白的Western blot檢測(cè)。PrPC被蛋白酶K完全水解，Western blot檢測(cè)無(wú)條帶顯示。PrPSc的空間變化隱蔽了部分蛋白酶K的作用位點(diǎn)，殘存未被水解的肽段，Western blot檢測(cè)有條帶顯示。

2 結(jié)果

2.1 pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

菌落PCR結(jié)果表明，可獲得單一條帶，與預(yù)期大小一致(圖2)。提取PCR陽(yáng)性菌落質(zhì)粒，酶切鑒定顯示可以切出與目的基因大小一致的片段(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示序列完整，閱讀框正確，表明成功構(gòu)建了pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒(圖3)。

2.2 重組G5P蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

結(jié)果顯示在接近15 kD的區(qū)域出現(xiàn)1條明顯表達(dá)的蛋白條帶，該條帶與預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的大小相符(包含重組G5P蛋白及N端的His標(biāo)簽和部分載體序列)；而含pET-28a-c(+)-G5P的未誘導(dǎo)對(duì)照組及E.coliBL21(DE3)空菌對(duì)照組，在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶(圖4)，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET-28a-c(+)-G5P在BL21(DE3)中得以成功表達(dá)。在非變性條件下，利用Ni-NTA柱對(duì)菌體裂解產(chǎn)物上清中的重組G5P蛋白進(jìn)行了純化。SDS-PAGE結(jié)果表明，純化后獲得重組G5P蛋白(圖4)。

M：DNA ladder；1：合成的目的片段(280 bp)；2：載體質(zhì)粒pET-28a-c(+)的EcoRⅠ單酶切；3：pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒的EcoRⅠ單酶切；4：pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒的EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切；5：菌落PCR擴(kuò)增目的片段(280 bp)圖2 pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of pET-28a-c(+)-G5P recombinant plasmid

圖3 pET-28a-c(+)-G5P重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Fig.3 Gene sequencing result of pET-28a-c(+)-G5P recombinant plasmid

M：蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：BL21全菌蛋白；2：未誘導(dǎo)的BL21(DE3)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；3：經(jīng)0.8 mmol/L濃度IPTG誘導(dǎo)的BL21(DE3)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；4：純化后的重組G5P蛋白圖4 重組G5P蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化Fig.4 Induced expression and purification of recombinant G5P protein

2.3 重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠對(duì)腦勻漿液的捕獲與檢測(cè)

利用重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠對(duì)腦勻漿液進(jìn)行捕獲，捕獲物進(jìn)行朊蛋白的Western blot檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠能夠從腦勻漿液中捕獲到朊蛋白，但僅從來(lái)自3位sCJD患者的腦勻漿液中捕獲到朊蛋白，而從2位非CJD患者的腦勻漿液中未捕獲到朊蛋白。該結(jié)果提示重組G5P蛋白結(jié)合的朊蛋白可能為朊病毒蛋白而非正常朊蛋白。

1～3：重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠對(duì)來(lái)自sCJD患者1～3的腦勻漿液的捕獲結(jié)果；4、5：重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠對(duì)來(lái)自非CJD患者1、2的腦勻漿液的捕獲結(jié)果圖5 對(duì)捕獲物進(jìn)行朊蛋白的Western blot檢測(cè)Fig.5 Detection of prion protein in the capture Western blotting

2.4 重組G5P蛋白偶聯(lián)磁珠捕獲的朊蛋白的特征分析

為了深入了解與重組G5P蛋白結(jié)合的朊蛋白特征，我們對(duì)捕獲的sCJD患者1～3的腦朊蛋白用蛋白酶K進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有蛋白酶K抗性，處理后仍可檢出Western blot條帶。這與正常朊蛋白對(duì)照(PrPC)不同，PrPC對(duì)照在蛋白酶K(PK)處理后不能檢出Western blot條帶，但與PrPSc對(duì)照的特征相同，兩者經(jīng)蛋白酶K處理后的Western blot條帶一致，進(jìn)一步證明重組G5P蛋白結(jié)合的朊蛋白為朊病毒蛋白而非正常朊蛋白(圖6)。

1：PrPC對(duì)照未經(jīng)蛋白酶K處理；2：PrPC對(duì)照經(jīng)蛋白酶K處理后；3：PrPSc對(duì)照未經(jīng)蛋白酶K處理；4：PrPSc對(duì)照經(jīng)蛋白酶K處理后；5～7：重組G5P蛋白捕獲的sCJD患者1～3的腦朊蛋白經(jīng)蛋白酶K處理后；M：蛋白Marker圖6 重組G5P蛋白捕獲的朊蛋白經(jīng)蛋白酶K處理后的Western blot檢測(cè)Fig.6 Detection of prion protein in the capture after treatment with PK by Western blotting

2.5 重組G5P蛋白與PrPSc親和能力分析

為了解重組G5P蛋白與PrPSc的親和力，我們將sCJD患者3的腦勻漿液進(jìn)行了500～50000倍的倍比稀釋?zhuān)俳?jīng)蛋白酶K處理后，用重組G5P蛋白偶聯(lián)的磁珠進(jìn)行捕獲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示(圖7)即使稀釋10000倍，重組G5P蛋白仍捕獲到了PrPSc，表明重組G5P蛋白是一種高親和力的PrPSc捕獲分子。

1：初始濃度；2～6：500、1000、5000、10000、50000倍稀釋圖7 重組G5P蛋白與低濃度倍比稀釋的PrPSc結(jié)合能力的分析Fig.7 Binding ability of the recombinant G5P protein to PrPSc

3 討論

朊病毒病的致病因子是具有感染能力的朊蛋白，即通常所說(shuō)的朊病毒蛋白，它是由存在于正常宿主細(xì)胞表面的PrPC在翻譯后發(fā)生某些修飾而形成的異常朊蛋白PrPSc。PrPC與PrPSc在結(jié)構(gòu)上存在差異，PrPC包含4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域，由于不明的原因，其中2個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域異構(gòu)成β折疊結(jié)構(gòu)，從而轉(zhuǎn)變成具有感染性和致病性的PrPSc。與PrPC不同，PrPSc溶解性較差，對(duì)蛋白酶有部分抗性[6]。PrPSc無(wú)法被正常的蛋白酶分解，如果沉積在腦組織中會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，形成腦組織空洞化，引起海綿狀腦病，導(dǎo)致宿主迅速死亡。引起PrPC構(gòu)象變化的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚，過(guò)去公認(rèn)的學(xué)說(shuō)為“唯蛋白假說(shuō)”，該假說(shuō)認(rèn)為構(gòu)象的轉(zhuǎn)化僅涉及蛋白質(zhì)，未涉及到其他物質(zhì)，但仍有不少學(xué)者對(duì)該假說(shuō)保持質(zhì)疑，質(zhì)疑的核心問(wèn)題為是否僅有朊蛋白起作用，是否還有未檢出的核酸參與。

目前臨床上缺乏早期診斷朊病毒病的方法，通常是在臨床癥狀出現(xiàn)后，進(jìn)行腦組織解剖，利用腦組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，若顯示有海綿狀改變和朊病毒聚集方可確診。由于缺乏能夠區(qū)分PrPC和PrPSc的抗體，所有檢測(cè)PrPSc的經(jīng)典方法均依賴(lài)于蛋白酶預(yù)處理，但這可能會(huì)漏診一些對(duì)蛋白酶敏感的PrPSc，這種PrPSc在蛋白酶K處理后被降解，因此無(wú)法檢出[7]。在過(guò)去的20年中一些研究小組發(fā)現(xiàn)核酸，即RNA和DNA對(duì)于朊病毒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增具有重要的作用[4，8-12]。這些分子能夠在體外誘導(dǎo)PrPC向PrPSc的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致有毒或無(wú)毒性聚集物的形成。鑒于核酸可能參與PrPSc的形成，有學(xué)者嘗試對(duì)一些抗DNA抗體或是DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選，以期獲得能從病變大腦勻漿中捕獲PrPSc的抗DNA抗體或是DNA結(jié)合蛋白[4，13]。令人驚訝的是，一種來(lái)源于絲狀噬菌體的單鏈DNA結(jié)合蛋白能夠特異性結(jié)合PrPSc而不與PrPC結(jié)合。該蛋白為絲狀噬菌體的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，被稱(chēng)為G5P。G5P由87個(gè)氨基酸殘基組成，為噬菌體DNA復(fù)制所必需，可使噬菌體DNA移動(dòng)至細(xì)菌的細(xì)胞膜，該蛋白還可抑制翻譯活性，在病毒、原核生物的DNA復(fù)制、翻譯及遺傳重組等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)G5P蛋白與PrPSc的結(jié)合具有以下的特點(diǎn)：只與PrPSc結(jié)合，而不與PrPC結(jié)合；結(jié)合具有高親和力；結(jié)合與PrPSc的構(gòu)象相關(guān)，可能涉及DNA或DNA相關(guān)分子在內(nèi)的復(fù)合體；既可結(jié)合蛋白酶敏感型PrPSc，也可結(jié)合蛋白酶不敏感型PrPSc。以上發(fā)現(xiàn)預(yù)示著G5P將在PrPSc診斷和機(jī)制研究中具有應(yīng)用價(jià)值。

由于野生型G5P在細(xì)菌中的含量較低且不易收集與純化。本研究利用基因克隆技術(shù)表達(dá)、純化重組G5P蛋白，并考察重組G5P蛋白結(jié)合PrPSc的能力。為了實(shí)現(xiàn)G5P基因在大腸埃希菌中的高效表達(dá)，本研究采用基因全合成的方式，使用大腸埃希菌偏愛(ài)密碼子替換原密碼子，從基因水平上進(jìn)行優(yōu)化。絲狀噬菌體編碼的G5P蛋白為87個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為9682 D。本實(shí)驗(yàn)得到的重組G5P蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為13 kD，由偏愛(ài)密碼子替換后的全長(zhǎng)G5P基因與載體pET-28 a(+)中表達(dá)氨基末端的一段6×His標(biāo)簽的序列及載體部分序列進(jìn)行融合表達(dá)獲得，這樣即可實(shí)現(xiàn)G5P蛋白在宿主菌中的高效表達(dá)，同時(shí)His標(biāo)簽又為后續(xù)的重組蛋白分離純化提供了方便，利用重組蛋白上His標(biāo)簽與Ni+親和層析柱間高的親和力，洗滌雜蛋白從而獲得純化G5P蛋白。

通過(guò)捕獲實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)獲得的帶His標(biāo)簽重組G5P蛋白可以捕獲PrPSc，因此不需要利用凝血酶(thrombin)切除His標(biāo)簽，從而大大節(jié)約了制備成本與時(shí)間。與天然G5P蛋白相似，重組G5P蛋白結(jié)合PrPSc具有特異性，只能從CJD患者的腦勻漿液中捕獲到朊蛋白，而從非CJD患者的腦勻漿液中未捕獲到朊蛋白。捕獲的朊蛋白經(jīng)蛋白酶K處理后仍能檢出Western blot條帶，且具有高親和力的特點(diǎn)，進(jìn)一步證明重組G5P蛋白結(jié)合的朊蛋白為朊病毒蛋白而非正常朊蛋白。重組G5P蛋白結(jié)合PrPSc具有高親和力，將sCJD患者的腦勻漿液稀釋10000倍，重組G5P蛋白仍可捕獲到PrPSc，表明重組G5P蛋白是一種高親和力的PrPSc捕獲分子。

以上結(jié)果預(yù)示重組G5P蛋白可用于開(kāi)發(fā)新型的PrPSc診斷試劑。與傳統(tǒng)的抗朊蛋白抗體相比，重組G5P蛋白的檢測(cè)更具優(yōu)勢(shì)，一方面，G5P對(duì)PrPSc的特異性結(jié)合是構(gòu)象依賴(lài)性的，檢測(cè)并不需要蛋白酶K的處理，這意味著可以直接檢測(cè)PrPSc，而不需要進(jìn)行蛋白酶K預(yù)處理；另一方面，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，存在具有感染性、致病性，但對(duì)蛋白酶K沒(méi)有抵制能力的PrPSc。對(duì)于這些PrPSc，傳統(tǒng)的抗體無(wú)法檢測(cè)，而G5P與PrPSc結(jié)合是構(gòu)象依賴(lài)性的，則可以在這些PrPSc的檢測(cè)上發(fā)揮不可替代的作用；此外，由于G5P與PrPSc的結(jié)合是在天然條件下，不需要變性劑的存在，這一特點(diǎn)有別于抗體，因此基于G5P蛋白的檢測(cè)方法將具有活體內(nèi)檢測(cè)的應(yīng)用前景。鑒于重組G5P蛋白是一種高親和力的PrPSc捕獲分子，它還可用于開(kāi)發(fā)新型的PrPSc的濾除設(shè)備，特別是用于去除血液中的PrPSc，這將對(duì)預(yù)防PrPSc的輸血感染，保障輸血安全具有重要作用。

綜上所述，本研究利用基因克隆技術(shù)成功獲得了純化的重組G5P蛋白。該蛋白具有特異性結(jié)合PrPSc的能力，并具有較高親和力，這為下一步研發(fā)新型朊病毒檢測(cè)技術(shù)和濾除技術(shù)打下基礎(chǔ)。