納米四氧化三鐵強(qiáng)化海藻酸鈉包埋希瓦氏菌MR-1的甲基橙脫色性能

黃弘楊,黃津津,王國祥,吳向陽,沈 楠,孫 麗

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院/江蘇省水土環(huán)境生態(tài)修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023;3.無錫市濱湖區(qū)水利局,江蘇 無錫 214071)

希瓦氏菌MR-1的胞外電子轉(zhuǎn)移是偶氮染料降解的限速步驟[12]。通過添加導(dǎo)電材料可以提高電子轉(zhuǎn)移效率,是強(qiáng)化希瓦氏菌MR-1脫色效率的有效途徑之一[13]。據(jù)報(bào)道,導(dǎo)電材料如碳納米管[13]、石墨烯[14]、納米磁鐵礦[15]等常被用來加速電子轉(zhuǎn)移效率。例如,添加5 g·L-1的碳納米管希瓦氏菌MR-1還原硝基苯的效率提高了74%[16]。因此,加入不同的導(dǎo)電材料可以加速希瓦氏菌MR-1向偶氮染料的電子轉(zhuǎn)移效率,提高脫色效率。碳納米管的加入雖然提高了脫色效率,但具有微生物密度低、不宜進(jìn)行分離、使用周期短等缺點(diǎn),仍然限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。

固定化微生物技術(shù)可以把篩選出來的能降解特定物質(zhì)的優(yōu)勢菌屬固定在載體上,有效提高微生物密度,縮短反應(yīng)時(shí)間,有利于提高污染物的去除率。隔離菌體與污染環(huán)境可緩解環(huán)境變化對水處理效果的影響,增大污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性和耐受性。固定化微生物技術(shù)根據(jù)微生物與載體之間的關(guān)系和相互作用分為5大類:包埋法、吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法和復(fù)合固定化法。其中包埋法是最常用的方法。該技術(shù)使微生物截留在不溶于水的凝膠聚合物孔隙所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)空間中,這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使微生物細(xì)胞在載體內(nèi)部可以擴(kuò)散但不能外泄,而且能讓外部小分子底物滲入和內(nèi)部微生物代謝產(chǎn)物排泄出去。包埋法的主要優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)操作簡單、對微生物活性影響較小、固定化顆粒強(qiáng)度高、可控制被固定微生物的種類和數(shù)量、固定化顆粒易于長期貯藏,因而成為水污染控制領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[17]。相對于碳納米管而言,納米Fe3O4具有較好的可回收性,是一種環(huán)境友好的導(dǎo)電材料,而海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是常用的微生物包埋材料,將SA、納米Fe3O4和希瓦氏 MR-1有機(jī)結(jié)合形成導(dǎo)電微球是一種理想的工業(yè)廢水高效脫色體系。并且這種結(jié)合方式可以避免納米磁鐵礦泄漏到環(huán)境中,提高導(dǎo)電材料的利用效率。但海藻酸鈉包埋希瓦氏菌MR-1和納米Fe3O4制備微球?qū)谆?MO)的脫色效率如何,以及微球的重復(fù)利用性如何,目前尚無明確報(bào)道[17]。

綜上所述,該研究的主要目的是:(1)考察復(fù)合微球的抗形變性、機(jī)械強(qiáng)度等,以期評(píng)價(jià)復(fù)合微球的重復(fù)利用性能,以及納米Fe3O4的添加對復(fù)合微球的重復(fù)利用性能的影響；(2)研究包含納米Fe3O4及不包含納米Fe3O4的復(fù)合微球?qū)O的脫色性能,比較分析納米Fe3O4是否能夠提高希瓦氏菌MR-1向MO的電子轉(zhuǎn)移效率,進(jìn)而提高復(fù)合微球的脫色性能。

1 研究材料與方法

1.1 培養(yǎng)基的配制

肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)包括:5 g·L-1酵母提取物,10 g·L-1胰蛋白胨,10 g·L-1氯化鈉。基本培養(yǎng)基(MM)包括:2.24 g·L-1C3H5O3Na,5.85 g·L-1NaCl,0.3 g·L-1NaOH,0.097 g·L-1KCl, 11.91 g·L-14-羥乙基哌嗪乙磺酸,1.498 g·L-1NH4Cl,0.67 g·L-1NaH2PO4·2H2O,1 mL微量元素溶液,微量元素溶液包括:1.5 g·L-1N(CH2COOH)3,30 g·L-1MgSO4·7H2O,5 g·L-1MnSO4·H2O,10 g·L-1NaCl,1 g·L-1FeSO4·7H2O,1 g·L-1CaCl2·2H2O,1 g·L-1CoCl·6H2O,1.3 g·L-1ZnCl2,0.1 g·L-1CuSO4·5H2O,0.1 g·L-1AlK(SO4)2·12H2O,0.1 g·L-1H3BO3,0.25 g·L-1Na2MoO4·2H2O,0.25 g·L-1NiCl2·6H2O,0.25 g·L-1Na2WO4·2H2O。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1希瓦氏菌MR-1(ATCC 700550)的培養(yǎng)

將菌種接種到LB培養(yǎng)基中,置于30 ℃搖床中培養(yǎng)12 h,然后在高速離心機(jī)中以8 000 r·min-1離心8 min(離心半徑16 cm),倒出上清液,菌體沉淀用60 mL的MM培養(yǎng)基重新懸浮并混勻,待用。

1.2.2納米Fe3O4的制備

100 mL高純水在N2下氛圍下加熱到80 ℃,添加0.99 g FeCl2·4H2O和2.7 g FeCl3·6H2O到水中,待其完全溶解后加入10 mL NH4OH (w為25%),保持溫度為80 ℃,在N2氛圍下快速攪拌30 min。形成的Fe3O4納米顆粒用磁鐵收集,并用高純水清洗4次,最后沉在高純水中待用。

1.2.3海藻酸鈉微球的制備

共制備了4組不同的微球,分別為SA微球(ck1)、SA/Fe3O4微球(ck2)、SA/希瓦氏菌MR-1微球(exp1)、SA/希瓦氏菌MR-1/Fe3O4微球(exp2)。制備步驟如下:(1)用50 mL溶液和1 g SA制備ck1;(2)以含1 g SA和30 mg 納米Fe3O4的50 mL溶液制備ck2;(3)以含1 g SA的40 mL溶液與10 mL的希瓦氏菌MR-1懸浮液混合,制備exp1;(4)用含1 g SA和30 mg 納米Fe3O4的40 mL溶液與10 mL的希瓦氏菌MR-1懸浮液混合,制備exp2。將4種混合物逐滴滴加到盛有w為3% CaCl2溶液的燒杯中,制備出復(fù)合包埋微球。制備好的微球用高純水洗3次后加入高純水在燒杯中保存?zhèn)溆?。所有種類的微球同時(shí)制備3份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4MO的脫色實(shí)驗(yàn)

在160 mL的血清瓶中添加60 mL的MM培養(yǎng)基,將制備得到的包埋微球轉(zhuǎn)移到血清瓶中。加入MO溶液,使瓶中的MO濃度為50 mg·L-1。氮?dú)獯祾? min使其保持厭氧狀態(tài),之后加橡皮塞和鋁帽,放入30 ℃搖床中,保持轉(zhuǎn)速為90 r·min-1。

第1次取樣在實(shí)驗(yàn)開始0.25 h時(shí),此后每30 min取樣1次,每次取樣均為2 mL。所有樣品在464 nm下進(jìn)行紫外-可見分光光度測試。脫色實(shí)驗(yàn)循環(huán)進(jìn)行4次,每次間隔約18 h,以每次的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為1個(gè)周期進(jìn)行分析;每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后血清瓶仍放入30 ℃搖床中,保持轉(zhuǎn)速為90 r·min-1,下一次實(shí)驗(yàn)前取出更換新的MO模擬廢水。4次脫色實(shí)驗(yàn)均使用同一批制備出的微球。

1.2.5指標(biāo)測定

(1)水凝膠流變性

采用TA-AR2000平行板(CP 25-2)流變儀,兩平板間距固定為1 mm,測試溫度30 ℃。水凝膠穩(wěn)態(tài)流動(dòng)行為在剪切速率為0.01～50 s-1范圍內(nèi)測量。動(dòng)態(tài)流變行為測量之前,首先在固定震動(dòng)頻率為1 Hz的條件下在0.01～10的應(yīng)變范圍內(nèi)進(jìn)行應(yīng)力掃描以確定其限性粘彈區(qū),然后固定應(yīng)變?yōu)?.1進(jìn)行動(dòng)態(tài)流變實(shí)驗(yàn)。

(2)掃描電鏡SEM測試

取表面和內(nèi)部各一小塊經(jīng)預(yù)處理和冷凍干燥后的海藻酸鈉微球置于導(dǎo)電膠上,測試之前采用氣相沉積的方法在樣品表面噴金,使樣品導(dǎo)電。使用JSM6700F掃描電鏡(操作電壓5.0 kV)進(jìn)行觀測。

(3)機(jī)械強(qiáng)度測試

分別取4種海藻酸鈉微球ck1、ck2、exp1、exp2放置于相同濃度的溶液中,在室溫下以200 r·min-1的速率在磁力攪拌器上平穩(wěn)持續(xù)攪拌,轉(zhuǎn)子規(guī)格10 mm×30 mm,每隔1 h撈取微球觀測破損率,記錄4種海藻酸鈉微球完整存在的時(shí)間。

(4)傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜測試

將冷凍干燥的海藻酸鈉微球進(jìn)行紅外光譜測定,掃描范圍400～4 000 cm-1。

(5)XRD測試

對制備好的Fe3O4粉末用X射線衍射儀進(jìn)行測試,觀察衍射峰出現(xiàn)的位置。測試條件:2θ范圍為10°～80°。

(6)數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行整理,所有圖形采用Origin Pro 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 微球的表征結(jié)果

2.1.1Fe3O4的XRD分析

Fe3O4特征峰的2θ值為30.201°、35.487°、43.077°、57.123°、62.674°(圖1)[17],通過水熱法制備Fe3O4較為成功。

2.1.2微球的形態(tài)

包埋微球平均粒徑約2.0～2.5 mm,包埋顆?？蔀槲⑸锾峁┐罅康挠行Ы佑|和附著的比表面積,且顆粒結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)微生物免受水力的擾動(dòng)和沖刷的影響。ck1組中微球是SA微球,無色透明(圖2);exp1組中微球是SA中摻雜希瓦氏菌MR-1,顏色為乳白色;ck2和exp2組中微球因?yàn)樘砑恿藢?dǎo)電材料Fe3O4均呈黑色。4組微球的形態(tài)相同,都是均勻球狀顆粒,表明制備的包埋微球較為成功。

在MO脫色實(shí)驗(yàn)后觀察可見,ck1組中微球的顏色變?yōu)槌壬?應(yīng)該是由吸附甲基橙引起的;而exp1組中微球的粉紅色是由N,N-二乙基對苯二胺(DPD)氧化引起的,因?yàn)榧谆瓤杀幌Ｍ呤暇鶰R-1降解為對氨基苯磺酸(4-ABA)和DPD[4],而DPD在暴露在空氣中時(shí)可被氧化成粉紅色[18](圖3)。ck2和exp2組中微球的顏色變化不明顯,主要是因?yàn)樘砑拥腇e3O4在微球中顯黑色,覆蓋了其他的顏色。

2.1.3掃描電子顯微鏡(SEM)觀測

對4組包埋微球的表面進(jìn)行SEM觀測,結(jié)果如圖4所示?？梢钥吹絚k1和ck2組包埋微球樣品的表面較為光滑,只有少量褶皺。添加了希瓦氏菌MR-1后,exp1和exp2組包埋微球微觀形貌要更飽滿一些,褶皺較多,且有一些較為明顯的凸起,應(yīng)該是希瓦氏菌MR-1包裹在微球表面造成的。

2.1.4傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

如圖5所示,4組樣品的FTIR譜圖沒有明顯的區(qū)別。

在3 340 cm-1處存在1個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,該峰為羥基的伸縮振動(dòng)峰,說明樣品中含有大量的羥基。1 603 cm-1和1 402 cm-1處出現(xiàn)的2個(gè)特征峰分別為—COO—的反對稱和對稱伸縮振動(dòng)峰,1 210 cm-1處出現(xiàn)的特征峰為C—O或C—H的伸縮振動(dòng)峰,在1 000 cm-1左右出現(xiàn)的尖銳特征峰為C—C或C—O—C的伸縮振動(dòng)峰[19]。從FTIR譜圖可以看到ck1、ck2、exp1和exp2這4組樣品的出峰位置基本一致,且峰型大致相同;對比SA的特征峰數(shù)值,4個(gè)樣品的紅外特峰完全符合,均為SA的特征峰。結(jié)果表明SA、Fe3O4以及希瓦氏菌MR-1只是簡單的物理結(jié)合,并沒有化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生,所以沒有官能團(tuán)的變化且沒有產(chǎn)生新的官能團(tuán)。

2.1.5流變性測試

復(fù)數(shù)模量G*指材料發(fā)生形變時(shí)抵抗形變的能量大小[20],可以用來表明抗形變性[21]。如圖6所示,在較低的應(yīng)變條件下(<0.01%),ck1和ck2組微球的復(fù)數(shù)模量要大于exp1和exp2組微球,希瓦氏菌MR-1的添加可能降低了微球的抗形變性。在較高應(yīng)變條件下(>0.01%),ck2和exp1組微球的復(fù)數(shù)模量下降很快,降低到了低于exp2組微球的程度。

而exp2組微球的變化不大,仍保持一個(gè)相對較高的數(shù)值,可能因?yàn)榧{米Fe3O4和微生物的共同作用維持了微球的抗形變性,ck2組和exp1均沒有這種效果。exp2微球在較低的應(yīng)力掃描期間(<0.01%)顯示出最低的損耗系數(shù)和更好的固體性質(zhì)。因此,根據(jù)流變性推測可知,該研究中制備的exp2組微球在較高應(yīng)變條件下(>0.01%)能維持自身性狀,抵抗外界壓力產(chǎn)生的形變,有利于重復(fù)使用。

2.1.6機(jī)械強(qiáng)度測試

在機(jī)械攪拌條件下4組包埋微球的完整存在時(shí)間有較大差距。ck1組包埋微球在連續(xù)攪拌15 h后開始破碎,攪拌18 h后微球基本完全破碎;而添加了Fe3O4的ck2組和exp2組的包埋微球完整存在時(shí)間均超過7 d;僅添加了希瓦氏菌的exp1組包埋微球完整存在時(shí)間為3 d,不如ck2和exp2組的完整存在時(shí)間長,說明Fe3O4的加入極大增強(qiáng)了微球的機(jī)械強(qiáng)度,有利于包埋微球的重復(fù)利用。添加Fe3O4的ck2組和exp2組的包埋微球機(jī)械強(qiáng)度的增加,可能是由于Fe3O4顆粒之間的磁性,使合成包埋微球的物質(zhì)之間的結(jié)合更為牢固。

2.2 MO脫色實(shí)驗(yàn)

如圖7所示,ck1和ck2組的包埋微球?qū)O的脫色率極低,2種包埋微球?qū)O的脫色效率沒有明顯差距,且均為吸附產(chǎn)生的效果,表明納米Fe3O4基本不吸附MO。添加希瓦氏菌MR-1的exp1和exp2組包埋微球?qū)O的脫色效果較好,表明希瓦氏菌MR-1具有較好的MO降解性能。在包埋微球重復(fù)利用過程中,exp1組微球?qū)O的脫色率從第1循環(huán)的100%降低到第4循環(huán)的53.19%左右,而exp2組的脫色率雖亦有所下降,但在第4循環(huán)依然維持在77.83%,體現(xiàn)出添加納米Fe3O4對MO脫色效率有明顯提升作用。針對重復(fù)利用微球?qū)O進(jìn)行脫色的過程中出現(xiàn)的脫色效率有所下降的現(xiàn)象,之前的研究也出現(xiàn)了在重復(fù)利用微生物包埋微球的實(shí)驗(yàn)中希瓦氏MR-1對Cr6+的生物還原能力降低的結(jié)果[22]。原因可歸結(jié)為以下3種情況:(1)循環(huán)之間的間歇性饑餓可能會(huì)抑制希瓦氏菌MR-1的生物活性,從而導(dǎo)致希瓦氏菌MR-1的MO脫色能力降低;(2)此外,MO及其代謝產(chǎn)物的毒性可能是另一個(gè)原因;(3)添加了納米Fe3O4的exp2組中的包埋微球完整存在時(shí)間大于7 d,增強(qiáng)微球機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)也有利于減少希瓦式菌MR-1從微球中流逝,較高的希瓦氏菌數(shù)量也是該組脫色效率較高的原因之一。2組微球在第1循環(huán)中的差距不大,可能是此時(shí)希瓦氏菌的活性處于實(shí)驗(yàn)中的最高點(diǎn),隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行希瓦氏菌活性逐漸降低,添加納米Fe3O4加速電子轉(zhuǎn)移,提高了微球?qū)O的脫色性能。希瓦氏菌 MR-1還原Cr6+和MO主要通過CymA和Mtr呼吸途徑[15],碳納米管的加入可以提高該途徑的電子傳遞效率[18]。其次,納米Fe3O4可能作為細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移的橋梁,通過另一種未知的呼吸途徑對MO進(jìn)行脫色[22]。因此,exp2組的希瓦氏菌MR-1或可通過上述2種途徑對MO進(jìn)行脫色強(qiáng)化,而exp1組的希瓦氏菌MR-1只有1種脫色途徑,因此exp2組的希瓦氏菌MR-1的脫色能力明顯強(qiáng)于exp1組。

在包埋微球重復(fù)利用過程中對exp1和exp2組中MO的脫色效率進(jìn)行比較,得到4個(gè)循環(huán)過程中經(jīng)過相同反應(yīng)時(shí)間的MO脫色效率(表2)。在第1循環(huán)(0～1.25 h)過程中,經(jīng)過0.75 h的反應(yīng)時(shí)間,exp1組和exp2 組中50 mg·L-1的MO的脫色率分別是89.06%和85.54%,2組的脫色效率相近。與懸浮狀態(tài)的希瓦氏菌MR-1對MO的脫色效率相比,在懸浮希瓦氏菌MR-1體系中40 mg·L-1的MO進(jìn)行脫色需要至少6 h[3]。由此可知,該研究中研制的包埋微球?qū)O進(jìn)行脫色的效率明顯較高。在第2循環(huán)(24.25～25.50 h)過程中,經(jīng)過0.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即25 h)exp2組中MO的脫色率為90.71%,而exp1中MO的脫色率僅有70.86%;經(jīng)過1.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即26 h),2組中MO基本完全脫色。第3循環(huán)(48.50～50.25 h)過程中,經(jīng)過0.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即48.5 h),exp1和exp2中MO的脫色率是38.75%和52.31%,差值為13.56%;經(jīng)過1.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即50.25 h),exp1和exp2組中MO脫色率為88.03%和99.41%,差值為11.38%;在第4循環(huán)(72.25～74.50 h)過程中,經(jīng)過0.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即73 h),exp1和exp2組中MO脫色率為30.96%和37.19%,差值6.23%;經(jīng)過1.75 h的反應(yīng)時(shí)間(即73.50 h),exp1和exp2組中MO脫色率為53.19%和77.83%,差值24.64%。以上結(jié)果均可以顯示出添加Fe3O4對MO脫色效率的提升作用。

表1 exp1和exp2組包埋微球?qū)O的脫色效率

3 結(jié)論

針對希瓦氏菌對偶氮染料進(jìn)行脫色過程中脫色效率較低的關(guān)鍵問題,提出利用海藻酸鈉包埋希瓦氏菌MR-1和納米Fe3O4對MO進(jìn)行脫色處理,以提高其細(xì)胞密度和電子傳遞效率,進(jìn)而提高對MO的脫色效率。通過比較4種包埋微球的形態(tài)學(xué)、流變性、機(jī)械強(qiáng)度以及脫色效率,得到以下結(jié)論:

(1)Fe3O4的加入提高了微球的機(jī)械強(qiáng)度,有利于微球的重復(fù)利用,且對微球的形貌基本不產(chǎn)生影響,并且不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),不產(chǎn)生新的物質(zhì)。

(2)Fe3O4的加入加速了希瓦氏菌MR-1向MO轉(zhuǎn)移電子的效率,從而提高了包埋微球?qū)O的脫色效率。

(3)循環(huán)利用后續(xù)過程中出現(xiàn)的脫色效率下降問題有待進(jìn)一步的探索,以提高微生物包埋微球的重復(fù)利用效率。

海藻酸鈉包埋微球可以防止納米材料泄漏到自然環(huán)境中,是納米材料應(yīng)用于廢水處理的理想途徑。并且添加納米導(dǎo)電材料可以改善細(xì)胞向污染物的電子轉(zhuǎn)移效率,進(jìn)而提高污染物處理效率。但是在實(shí)際的連續(xù)應(yīng)用過程中,需要進(jìn)一步提高海藻酸鈉包埋微球的性能。