細(xì)粒棘球蚴感染羊肝臟包囊纖維化形成的病理形態(tài)學(xué)觀察

翟少華，胡美荷，李淑嫻，劉來(lái)珍，阿爾祖古麗·阿卜力孜，王 楠，梁 天，劉海燕

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052）

細(xì)粒棘球蚴?。òx病）是由細(xì)粒棘球蚴寄生于人或動(dòng)物體內(nèi)而感染的一種人獸共患寄生蟲病，俗稱“蟲癌”[1]。我國(guó)是世界上包蟲病最嚴(yán)重的國(guó)家之一，新疆是高發(fā)區(qū)，在新疆家畜包蟲病感染情況調(diào)查中，肝臟棘球蚴平均感染率為50.24%；包蟲病感染率超過60%的有巴州、阿勒泰、伊犁和喀什4個(gè)地區(qū)，其中伊犁的感染率最高，達(dá)78.15%[2]。在我國(guó)分布的主要是細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲[3]。前者的幼蟲會(huì)引起細(xì)粒棘球蚴病，又稱囊型包蟲病，病例數(shù)占所有病例的90%以上；后者的幼蟲會(huì)引起多房棘球蚴病，又稱泡型包蟲病[4]。

囊型棘球蚴病對(duì)人體器官的損害中以對(duì)肝臟的損害居首位[5]。中間宿主食用被細(xì)粒棘球蚴蟲卵污染的食物或水后，在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進(jìn)入血液，主要在肝和肺中發(fā)育成包囊，若包囊破裂釋放出原頭節(jié)可再次感染[6]。細(xì)粒棘球蚴在感染宿主過程中，對(duì)宿主致病的機(jī)制十分復(fù)雜，包括對(duì)宿主組織器官造成壓迫性損傷、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)以及免疫逃避等多方面問題[7]。肝包蟲包囊纖維化早已被人熟知，但其炎癥細(xì)胞的變化和形成機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在運(yùn)用病理組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和超微形態(tài)學(xué)的相關(guān)知識(shí)，將病理組織切片觀察與細(xì)胞化學(xué)染色切片觀察結(jié)合起來(lái)，共同探討細(xì)粒棘球蚴對(duì)羊肝臟的損傷性變化和肝臟包囊的形成過程，為闡釋細(xì)粒棘球蚴對(duì)機(jī)體的感染過程、肝臟纖維化以及肝細(xì)胞損傷的分子病理機(jī)制的形成提供研究基礎(chǔ)，對(duì)該病的診斷、治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料的采集 2019年8月至10月期間，收集于烏魯木齊市新市區(qū)華凌屠宰場(chǎng)所宰殺的阿勒泰羊中出現(xiàn)明顯包囊的完整羊肝臟，共10份。

1.2 試劑 10%福爾馬林固定液、Bouin固定液、無(wú)水乙醇、二甲苯、蘇木素染液、1%伊紅染液均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；蘇木紫、猩紅、復(fù)紅、磷鉬酸、磷鎢酸、淺綠染料購(gòu)自北京化工廠；冰醋酸溶液購(gòu)自天津市北方化玻購(gòu)銷中心。

1.3 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 選取屠宰過程中出現(xiàn)包囊的羊肝臟，沿包囊周圍與正常組織交界處剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm的病變組織，置于10%中性福爾馬林固定液中固定12 h，其包囊直徑范圍在2～6 cm。共10個(gè)樣品。

1.4 感染羊肝臟組織病理組織切片制備 取已固定的肝臟包囊病變組織，用流水沖洗2 h。將樣品放入自動(dòng)脫水機(jī)中按照70%乙醇（2 h）、80%乙醇（1.5 h）、90%乙醇（45 min）、95%乙醇Ⅰ（30 min）、95%乙醇Ⅱ（30 min）、100%乙醇Ⅰ（30 min）、100%乙醇Ⅱ（30 min）系列梯度逐級(jí)脫水；用二甲苯Ⅰ（二甲苯/無(wú)水乙醇1:1）、純二甲苯Ⅱ、純二甲苯Ⅲ，各透明8 min。最后用固體石蠟包埋組織、切片5 μm厚度。通過脫蠟、復(fù)水、蘇木素-伊紅染液染色各1 min，通過75%乙醇、80%乙醇、85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，逐級(jí)脫水各2 min。甲苯Ⅰ（二甲苯與無(wú)水乙醇1∶1）、二甲苯Ⅱ，各透明1 min，滴加中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.5 感染羊肝臟細(xì)胞化學(xué)染色樣品制備 石蠟切片脫蠟后置于蒸餾水中，再置入Bouin氏固定液于56℃溫箱中固定1 h，冷卻10 min；清水沖洗約10 min至切片變透明，再置入蒸餾水中清洗；Weigert氏蘇木紫溶液染10 min，清水沖洗10 min，置入蒸餾水中清洗；猩紅-酸性復(fù)紅溶液染10 min，切片置入蒸餾水中清洗；以鉬酸-磷鎢酸溶液染10～15 min做分色。檢查膠質(zhì)纖維沒有被染成紅色；使用淺綠溶液做對(duì)比染色1 min；以5%磷鎢酸溶液分色15 min；以95%乙醇、絕對(duì)酒精及二甲苯脫水及透明封片。染色結(jié)果判定：肌肉、細(xì)胞質(zhì)及角質(zhì)呈紅色；細(xì)胞核呈黑色；膠質(zhì)纖維呈綠色。

1.6 感染羊肝臟組織掃描電子顯微鏡樣品制備 從自然感染的綿羊肝臟細(xì)粒棘球蚴抽取包囊囊液和剪取包囊囊壁，分別將抽取的包囊液經(jīng)自然沉淀?xiàng)壢ド锨逡菏占^蚴，滴加至粘貼有碳導(dǎo)電膠的掃描電鏡樣品臺(tái)上；同時(shí)將剪取的1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm包囊囊壁粘貼于掃描電鏡樣品臺(tái)碳導(dǎo)電膠上，置于場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察蟲體特征和包囊囊壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。共7個(gè)樣品。

2 結(jié)果

2.1 感染羊肝臟病變組織的采集與觀察 感染羊肝臟表面可見大小不等的包囊凸出，包囊壁呈半透明狀，包囊液清亮，有的包囊體積較大向肝組織內(nèi)侵入生長(zhǎng)，充滿囊液的棘球蚴均具有一定張力，富有彈性不易塌陷。在肝臟表面的包囊中可以透過角質(zhì)層清晰的看見顆粒狀的生發(fā)囊[8]，切開后有大量包囊液流出，包囊空虛，包囊壁呈灰白色，質(zhì)地堅(jiān)韌。在凸起的包囊周圍可見散在的大范圍的壞死灶布滿整個(gè)肝臟，部分病灶相互融合形成較大范圍的不規(guī)則的融合性病灶。抽取包囊液滴在載玻片上于顯微鏡下觀察，可見大量原頭蚴，原頭蚴出現(xiàn)明顯伸縮蠕動(dòng)，活力較好，多數(shù)頭節(jié)縮入蟲體內(nèi)，少數(shù)頭節(jié)伸出。原頭蚴多呈橢圓形，表面層光滑、透明。部分原頭蚴頂突和4個(gè)吸盤完全翻出，高倍鏡下頂突小鉤結(jié)構(gòu)清晰可見，體節(jié)內(nèi)鈣顆粒明顯（圖1）[9]。

圖1 感染羊肝臟包囊與包囊中原頭蚴形態(tài)Fig.1 Morphology of protocephala in liver cysts and cysts in sheep infected

2.2 細(xì)粒棘球蚴的超微形態(tài)學(xué)觀察 在場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡下，可見分離的原頭蚴呈長(zhǎng)梭形，蟲體長(zhǎng)度平均約120 μm，內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)、肌纖維清晰。原頭蚴上有小鉤、吸盤及微細(xì)的石灰顆粒，具有感染性。以及包囊壁上可見附著的原頭蚴蟲體。包囊壁組織結(jié)構(gòu)疏松，囊壁表面可見密集空隙結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 掃描電子顯微鏡下原頭蚴與包囊壁的超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of protocephala and cyst wall under scanning electron microscope

2.3 感染羊肝臟血管病理組織學(xué)變化 通過感染綿羊的肝臟病理組織學(xué)觀察，可見肝臟呈局灶性壞死，在壞死組織內(nèi)血管管壁分解出芽，并向外側(cè)凸起延伸至炎癥區(qū)域。圍繞血管周圍有較多的纖維組織增生呈片層結(jié)構(gòu)，增生的膠原纖維自外側(cè)血管壁向周圍炎癥區(qū)域輻射擴(kuò)散性生長(zhǎng)。在出芽的血管周圍肝細(xì)胞消失，血管內(nèi)外積聚大量的嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。嚴(yán)重病變血管壁纖維組織增生導(dǎo)致血管管腔狹窄，形態(tài)不規(guī)則（圖3）。

圖3 感染羊肝臟組織血管病理組織變化Fig.3 Pathological changes of liver blood vessels in infected sheep

2.4 感染羊肝臟組織細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng) 在肝臟病變區(qū)域內(nèi)可見沿血管周圍的肝細(xì)胞大范圍局灶性壞死，壞死組織融合成片，嗜伊紅性增強(qiáng)，以及大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在壞死組織周邊肝細(xì)胞索斷裂，細(xì)胞萎縮、形態(tài)不規(guī)則。肝細(xì)胞核消失，胞質(zhì)空泡化，壞死的炎癥區(qū)域可見纖維組織的增生（圖4）。

圖4 感染羊肝臟組織細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)Fig.4 Injury of liver cells and inflammation in infected sheep

2.5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成 在病變肝組織內(nèi)增生的纖維組織沿殘存的肝細(xì)胞周圍炎癥部位生長(zhǎng)，將炎癥區(qū)域與周圍肝組織分離，纖維化包囊逐漸形成。在纖維化包囊形成過程中炎癥細(xì)胞逐漸減少，多核巨細(xì)胞增多，包囊內(nèi)壁纖維融合形成均質(zhì)的、強(qiáng)嗜伊紅的纖維瘢痕組織（圖5）。

圖5 感染羊肝臟組織纖維化和包囊形成Fig.5 Liver tissue fibrosis and cyst formation in infected sheep

2.6 細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察感染羊肝臟纖維化形成通過Masson細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)病變肝組織特殊染色可見，原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死、組織纖維化形成均是以血管為中心所產(chǎn)生。隨著炎癥的發(fā)展，肝細(xì)胞壞死范圍增加，血管周圍纖維組織向炎癥區(qū)域伸長(zhǎng)，所形成的纖維組織沿殘存肝細(xì)胞周圍生長(zhǎng)，形成包囊（圖6）。

圖6 細(xì)胞化學(xué)染色觀察感染羊肝臟纖維化形成Fig.6 Cytochemical staining to observe liver fibrosis in infected sheep

3 討論

細(xì)粒棘球蚴?。òx?。┦俏覈?guó)畜牧地區(qū)重要的人畜共患病，嚴(yán)重危害人類健康及畜牧業(yè)的發(fā)展[1]。其感染途徑是由犬科動(dòng)物（犬、狼）等終末宿主將細(xì)粒棘球蚴的蟲卵和孕節(jié)隨糞便排至體外，牛、羊等中間宿主吞食蟲卵后而受感染。進(jìn)入消化道的六鉤蚴鉆入腸壁，在消化液的作用下囊壁溶解，原頭蚴附著在小腸壁上并開始發(fā)育。經(jīng)血流或淋巴散布到體內(nèi)各處，以肝臟、肺臟兩處最多[3]。其中Eg95基因在細(xì)粒棘球絳蟲六鉤蚴侵入小腸絨毛上皮的過程中起重要作用[10]。

細(xì)粒棘球蚴對(duì)機(jī)體的損害可以局限在寄居部位，也可以擴(kuò)展到機(jī)體的其他部位，其損害方式包括：機(jī)械損傷、奪取營(yíng)養(yǎng)、毒素作用及引起的免疫反應(yīng)。各種損害方式對(duì)機(jī)體的作用常導(dǎo)致細(xì)胞損害，表現(xiàn)為肝細(xì)胞的萎縮、凋亡和壞死等[11]。彭心宇等[12]在外科實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)囊型包蟲寄生人體肝臟后致部分肝細(xì)胞“消失”的現(xiàn)象，尤以細(xì)粒棘球蚴寄生于肝左葉時(shí)此現(xiàn)象更明顯，甚至肝左葉實(shí)質(zhì)幾乎完全“消失”，實(shí)驗(yàn)顯示肝纖維化與“外膜”的形成相關(guān)，包囊可能是宿主對(duì)棘球蚴的免疫而發(fā)生異物反應(yīng)形成肉芽腫樣組織并不斷纖維化增生的結(jié)果[13-14]。

目前對(duì)肝包蟲囊腫周圍纖維囊壁形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)觀點(diǎn)略有差異。昊少廷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球蚴寄生定位于肝臟后發(fā)育成囊腫，并不斷增大擠壓周圍肝實(shí)質(zhì)致成纖維細(xì)胞不斷增生逐漸形成膠原纖維和纖維包膜即囊，外囊是肝實(shí)質(zhì)纖維化的結(jié)果。Farrokh等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外囊是一層被擠壓的非上皮細(xì)胞化的纖維組織，與周圍肝實(shí)質(zhì)之間無(wú)解剖性分離間隙。顧樹南等[17]提出，細(xì)粒棘球蚴寄生定位于肝臟后，由于人體免疫功能及肝臟的屏蔽作用，在棘球蚴周圍的局部組織首先發(fā)生異物反應(yīng)，炎性細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)滲出，由新生的成纖維細(xì)胞形成纖維結(jié)締組織包膜包裹在棘球蚴周圍形成外囊，這種纖維性的外囊與所寄生的肝臟組織無(wú)明顯的分界不能分開。外囊壁并非蟲體而是機(jī)體臟器組織發(fā)生局部纖維化所形成的屏壁。Milicevic等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肝包蟲囊腫的外囊來(lái)源于宿主器官組織內(nèi)部包裹著血管及一些小的膽管外層被擠壓萎縮的肝細(xì)胞，其與周圍肝實(shí)質(zhì)之間無(wú)明確界線，故外囊切除是非常困難的。

本研究在細(xì)粒棘球蚴感染肝臟包囊周圍的肝實(shí)質(zhì)組織呈現(xiàn)肝臟大范圍局灶性壞死，肝細(xì)胞明顯萎縮，體積顯著縮小，散在肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞核消失，細(xì)胞質(zhì)空泡化，小血管（動(dòng)脈、靜脈）管壁纖維化、玻璃樣變以及血管出芽。其原因可能是由于局部血管及膽管的纖維化引起的局部營(yíng)養(yǎng)不良、淤血，原頭蚴不斷生長(zhǎng)對(duì)肝組織的機(jī)械性壓迫造成肝細(xì)胞萎縮（壓迫性、營(yíng)養(yǎng)不良性萎縮）[19]。本研究通過Masson細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)病變肝組織特殊染色發(fā)現(xiàn)，原頭蚴感染后肝臟的炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死，組織纖維化形成均是以血管為中心所形成。隨著炎癥的發(fā)展，肝細(xì)胞壞死范圍增加，成纖維細(xì)胞向炎癥區(qū)域伸長(zhǎng)，所形成的纖維組織沿殘存肝細(xì)胞周圍生長(zhǎng)而形成包囊。

通過本研究結(jié)果分析，細(xì)粒棘球蚴感染肝臟包囊形成是機(jī)體受到蟲體刺激后形成的纖維組織。隨著包囊的不斷增大，對(duì)機(jī)體的損傷越來(lái)越嚴(yán)重，病灶中心區(qū)域肝細(xì)胞大量壞死，炎癥細(xì)胞滲出聚集，形成明顯的炎癥反應(yīng)界限，成纖維細(xì)胞大量增生，炎癥反應(yīng)外周肝組織纖維化形成。包囊組織發(fā)生液化性壞死，包囊液形成，包囊開始發(fā)育。同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟組織局灶性壞死，肝細(xì)胞萎縮、壞死、纖維化囊壁的形成都是圍繞在血管周圍，說明血管是原頭蚴進(jìn)入肝臟的主要途徑而不是簡(jiǎn)單的附著在肝臟表面。上述研究尚屬初步，血管病理及纖維化囊壁的形成是其生長(zhǎng)過程中一種較普遍的病理現(xiàn)象，是與肝蟲病診斷、治療、愈后密切相關(guān)的一個(gè)病理學(xué)表現(xiàn)[20]。細(xì)粒棘球蚴對(duì)肝臟的致病機(jī)制還需通過建造小鼠模型進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)血管病理，纖維囊壁形成的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，組織局灶壞死過程以及通過分子病理分析肝臟纖維化形成相關(guān)因子的作用等。

本研究通過對(duì)感染原頭蚴綿羊肝臟包囊形成和肝細(xì)胞壞死的病理組織學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)原頭蚴感染后病變產(chǎn)生于感染組織的血管周圍，血管壁纖維組織分解、管壁出芽，分解并增生的纖維組織伸向周圍炎癥區(qū)域內(nèi)，血管管腔及炎區(qū)大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞萎縮、變性、壞死，增生的膠原纖維沿殘存的肝細(xì)胞周圍圍繞病變組織包囊壁形成。