馮雨晴， 李耕， 趙園園， 周駿， 馬雁軍， 白若石， 劉德水， 史宏志

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠，北京 100024)

白肋煙是一種Yellow Burley (Yb)基因突變體，因其葉片本身色素含量較低，導(dǎo)致光合作用下降，從而不能為葉片氮還原同化過(guò)程提供充足能量，造成葉片中的硝酸鹽大量積累[1-2]。煙草特有亞硝胺(Tobacco-specific nitrosamines, TSNAs)是一類存在于煙葉和煙草制品中的有害化合物，硝酸鹽作為TSNAs的重要前體物，與后期煙草葉片TSNAs形成密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，煙草葉片中硝酸鹽含量與TSNAs積累呈顯著性直線相關(guān)關(guān)系[3-4]。相同供氮條件下，白肋煙硝酸鹽含量較普通烤煙高百倍，與其Yb基因突變導(dǎo)致的色素含量低、光合碳固定弱和氮素利用效率低密切相關(guān)[5-7]。因此，促進(jìn)煙草葉片色素合成，提高煙草葉片光合作用和碳氮代謝能力，有助于降低葉片中硝酸鹽和TSNAs形成和積累。

生長(zhǎng)素是植物體內(nèi)的重要細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化過(guò)程，其中吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)是生長(zhǎng)素最主要的形式，且其生理功能主要表現(xiàn)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、調(diào)控植物細(xì)胞數(shù)目的增加和細(xì)胞伸長(zhǎng)及有效緩解環(huán)境脅迫等方面[8-9]，同時(shí)還可與油菜素內(nèi)酯、赤霉素、乙烯等生長(zhǎng)激素信號(hào)通路相互作用，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各種代謝活動(dòng)[10-12]。目前, 有關(guān)這類植物激素在煙草生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用有不少研究。外源生長(zhǎng)素不僅在促進(jìn)作物根系伸長(zhǎng)、地下及地上部分生物量的積累，提高葉綠素含量和凈光合速率方面效果顯著[13-15]，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)煙株的碳氮代謝，增加其還原糖含量，降低煙草葉片中煙堿的含量，從而有效改善煙草葉片內(nèi)在化學(xué)成分間的協(xié)調(diào)性[16-18]。研究表明，外源生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)植物NRT1.1(Nitrate transporters 1.1) 基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)硝酸鹽的吸收，減少硝酸鹽的積累[19-20]。丙三醇作為一種三碳碳源，一方面可以為細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)提供碳骨架，另一方面在光合作用、蔗糖代謝、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)及增強(qiáng)植物抗逆性中均能發(fā)揮重要作用[21-24]。近年來(lái)，丙三醇在降低植物葉片硝酸鹽含量研究方面取得了一定的進(jìn)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，10 mL·L-1丙三醇在降低葉菜類蔬菜硝酸鹽含量效果顯著，與丙三醇促進(jìn)植株葉片色素含量升高和光合作用有關(guān)[25-26]。此外，丙三醇可以促進(jìn)煙草光反應(yīng)途徑、碳固定途徑、蔗糖合成和氮代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而提高碳氮代謝和氮素利用效率，進(jìn)而降低煙草葉片中硝酸鹽含量[27]。已有研究證明，糖類物質(zhì)可與細(xì)胞分裂素(Cytokinin, CTK)、生長(zhǎng)素(IAA)等激素相互作用，在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和個(gè)體發(fā)育的進(jìn)程中有重要作用[28]。郎冬梅等[29]研究表明，外源葡萄糖與生長(zhǎng)素混合施用對(duì)提高山定子碳氮代謝進(jìn)程和氮素利用效率效果顯著。白肋煙碳氮代謝能力弱，氮素利用效率低和硝酸鹽積累含量高，丙三醇作為一種三碳碳源，與生長(zhǎng)素混合施用能否更有效地改善白肋煙所存在的問(wèn)題有待研究。因此，本試驗(yàn)選擇苗期白肋煙TN 90為材料，選用清水為對(duì)照，設(shè)置丙三醇單獨(dú)噴施、丙三醇和吲哚-3-乙酸混合噴施處理，研究不同噴施處理對(duì)煙苗生長(zhǎng)指標(biāo)、光合速率、色素含量、硝酸還原酶活性(Nitrate reductase, NRA)和谷氨酰胺合成酶活性(Glutamine synthetase, GSA)、碳氮化合物含量和氮素利用效率的影響，為減少煙葉硝酸鹽和TSNAs積累量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地光照培養(yǎng)架下培育煙苗。光照培養(yǎng)架條件如下:每12 h晝夜交替光照(時(shí)間段設(shè)置為7：00—19：00)，光照度設(shè)置為400 μmol·m-2·s-1。材料選擇白肋煙品種TN 90，采用漂浮育苗，煙草種子用2 % 次氯酸鈉溶液消毒，并將其播種在填滿基質(zhì)的200孔育苗盤中。浮盤規(guī)格:寬38 cm，長(zhǎng)78 cm，高5.5 cm，每盤200孔。育苗框規(guī)格: 寬45 cm，長(zhǎng)82 cm，高20 cm，育苗時(shí)在框中加入8 L清水，煙苗長(zhǎng)至大十字期時(shí)開(kāi)始加入8 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)煙苗長(zhǎng)至4～5片真葉(苗齡約40 d)時(shí)，挑選大小均勻一致的壯苗，移栽至小花盆中(規(guī)格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm)，煙苗長(zhǎng)至伸根期 (7片完全開(kāi)展葉) 時(shí)開(kāi)始進(jìn)行噴施處理。每處理選取8株大小均勻一致的煙苗，共計(jì)24株。設(shè)置試驗(yàn)處理為:(1)CK，清水對(duì)照；(2)T1，1 mL·L-1丙三醇；(3)T2，1mL·L-1丙三醇+10 mg·kg-1吲哚-3-乙酸，連續(xù)噴施3 d，7 d后進(jìn)行取樣。丙三醇的體積分?jǐn)?shù)參考史宏志等[27]文獻(xiàn)，吲哚-3-乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考劉超等[30]和魏曉梅等[31]及自己的預(yù)試驗(yàn)的研究結(jié)果。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

對(duì)各處理煙苗測(cè)定光合速率和生長(zhǎng)指標(biāo)后，將各處理煙苗分成2份，分別用于新鮮樣本檢測(cè)和殺青樣本制作。各處理煙苗不同部位用去離子水沖洗干凈，隨后用濾紙擦干進(jìn)行測(cè)定并保存樣本。

1.2.1 煙草葉片凈光合速率的測(cè)定 選取各處理大小均勻一致的煙苗，凈光合速率由便攜式光合測(cè)定儀(LI-6400，美國(guó)Licor公司)進(jìn)行測(cè)定。光合儀器設(shè)置為開(kāi)放通路 (手動(dòng)進(jìn)行)，紅藍(lán)光源外接光源光照度設(shè)為800 μmol·m-2·s-1，每棵煙所測(cè)葉片用外接光源照射15 min，使其光合速率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，測(cè)定時(shí)間選擇9:00—12:00和14:00—17:00，測(cè)定部位選擇煙苗最大功能葉(從下向上數(shù)，第3葉位)進(jìn)行測(cè)定[32]。每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 丙三醇與吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，與對(duì)照相比，噴施處理TI后，株高、葉長(zhǎng)和葉面積分別增加19.64%，10.41%和27.25%，莖粗略有下降，同時(shí)煙草根、莖、葉鮮質(zhì)量分別增加16.34%，9.46%和28.94%，根、莖、葉干質(zhì)量分別增加12.50%，10.13%和26.51%；而噴施T2處理后，株高、莖粗、葉長(zhǎng)和葉面積分別增加40.35%，26.84%，20.29%和57.75%，根、莖、葉鮮質(zhì)量分別增加32.68%，27.68%和45.51%，根、莖、葉干質(zhì)量分別增加43.75%，27.85%和41.13%。說(shuō)明外源丙三醇和生長(zhǎng)素能在不同程度上促進(jìn)白肋煙植株生長(zhǎng)，其中T2處理更有利于促進(jìn)煙株生長(zhǎng)。

2.2 丙三醇與吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率的影響

由圖2可知，T1和T2處理均能提高煙草葉片色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和凈光合速率，且T2處理的效果更為顯著。與CK相比，噴施T1后葉片中葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和光合速率分別增加22.86%，18.75%，9.09% 和28.89%；相比于T1處理，T2處理葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和光合速率分別增加17.44%，2.63%，50.00% 和25.34%。

2.3 外源丙三醇與吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，T1和T2處理后白肋煙葉片中總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于CK，兩者之間無(wú)顯著差異。與CK相比，T1處理后白肋煙葉片中總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加16.38%和31.25%，T2處理后白肋煙葉片中總糖和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加18.10% 和37.5%。

2.4 丙三醇與吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖4可知，TI 和 T2 處理均顯著提高了白肋煙葉片中NRA，且 T2 處理效果更為顯著，而對(duì)GSA略有提高。與 CK 相比，噴施 T1 和 T2 后白肋煙葉片中NRA分別提高20.35%和36.73%，GSA分別提高7.29% 和9.99%。說(shuō)明T2處理更有利于促進(jìn)苗期白肋煙NRA 和GSA活性的提高，從而降低白肋煙葉片中硝酸鹽積累量。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lower-case letters mean significant difference at 0.05 level among different treatments of the same variety. The same as below.圖1 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of glycerol and indole-3-acetic acid on the growth of tobacco seedlings

2.5 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片氮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.6 丙三醇與吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片氮素利用效率和氮素積累量的影響

由圖6可知，噴施T1和T2均能提高白肋煙葉片氮素積累量和氮素利用效率。與對(duì)照相比，噴施T1和T2后，白肋煙葉片氮素積累量分別提高14.21%和25.93%，氮素利用效率分別提高10.89%和12.18%。說(shuō)明與T1 處理相比，T2 處理更有利于促進(jìn)白肋煙葉片中干物質(zhì)積累，從而提高白肋煙葉片氮素積累量和氮素利用效率。

圖2 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片凈光合速率和色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖3 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片還原糖和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

注：ns表示不同處理間差異不顯著。下同。Note: ns means no difference among different treatments of the same variety. The same as below.圖4 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙草葉片NRA和GSA活性的影響Fig.4 Effects of glycerol and indole-3-acetic acid on NRA and GSA in tobacco leaves

圖5 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片氮化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖6 丙三醇和吲哚-3-乙酸對(duì)白肋煙葉片氮素積累量和氮素利用效率的影響

3 結(jié)論與討論

丙三醇單獨(dú)噴施處理和丙三醇與吲哚-3-乙酸混合噴施處理后，白肋煙煙苗大小、生物量、色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、光合速率、總糖還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硝酸還原酶活性、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氮素積累量均增加，葉片氮素利用效率明顯提高，并且總氮和硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低，其中丙三醇與吲哚-3-乙酸混合處理在促進(jìn)白肋煙苗碳氮代謝和降低硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)方面效果更佳。丙三醇和吲哚-3-乙酸混合噴施更有助于提高白肋煙葉片碳氮代謝能力，對(duì)降低白肋煙葉片硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)效果較好。