李仕林，王雅雯，姜水兵，郭良帥，努爾麥麥提·麥麥提敏，王新新，焦海宏

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾843300）

冠狀病毒屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），該屬包括多種動物冠狀病毒和人冠狀病毒。根據(jù)病毒抗原，大部分文獻(xiàn)將已知并定型的冠狀病毒分為3群[1]：第1群包括人冠狀病毒229E（HCoV-229E）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、犬冠狀病毒（CCoV）和貓傳染性支氣管炎病毒（FCoV）；第2群包括人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）、牛冠狀病毒（BCoV）、火雞冠狀病毒（TCoV）、鼠肝炎病毒（MHV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（HEV）和大鼠冠狀病毒（RtCoV）；第3群包括禽傳染性支氣管炎?。↖BV）和火雞藍(lán)冠病病毒（TCoV）。部分冠狀病毒對人有致病性。其中，嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、新型冠狀病毒（2019-nCoV）造成的危害較嚴(yán)重。

冠狀病毒顆粒有包膜，直徑為60～200 nm，呈球形或橢圓形，具有多形性特點(diǎn)。冠狀病毒基因組為正鏈單股RNA，是RNA病毒中最大的病毒，長度約為27～32 kb[2]?；蚪M有一個5'帽子結(jié)構(gòu)和一個3'PolyA結(jié)構(gòu)。冠狀病毒基因組被包裹在螺旋衣殼內(nèi)，外膜呈球狀，表面有許多放射狀排列的纖突。包膜表面主要有刺突糖蛋白（S蛋白）、包膜糖蛋白（E蛋白）、膜糖蛋白（M蛋白），還有一些血凝素糖蛋白（HE蛋白）。冠狀病毒通過空氣以及接觸傳播，主要感染機(jī)體上皮細(xì)胞，引起的臨床癥狀主要以呼吸道、消化道等為主。其宿主有豬、牛、貓、犬、老鼠、蝙蝠以及人類等多種哺乳動物和鳥類，被感染的動物，可通過排泄物、污染物和呼吸道傳播病毒，其他生物媒介一般不傳播該病毒。病毒對乙醚、氯仿和酒精等消毒劑敏感，低溫下穩(wěn)定，60℃加熱1 h可滅活病毒，不耐酸不耐堿。該病毒可致豬呼吸道、胃腸道以及神經(jīng)系統(tǒng)感染?，F(xiàn)已知致豬腹瀉的冠狀病毒病有豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬急性腹瀉綜合征癥。

1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhoea，PED）是一種能引起豬胃腸道感染的疾病，以腹瀉、嘔吐、脫水為主癥狀。1978年，首次分離出豬流行性腹瀉病毒。該病傳遍整個歐洲，將其命名為“EVD”。1976年，出現(xiàn)一種可以致哺乳仔豬出現(xiàn)急性腹瀉的疾病，將該病稱為“EVDII型”。直到20世紀(jì)80年代，研究證實(shí)上述2類型的流行性病毒性腹瀉的病原體相同，都是冠狀病毒。隨后，被統(tǒng)一命名為豬流行性腹瀉（PED）[3]，本病對哺乳仔豬危害較為嚴(yán)重。

1.1 病原

PEDV屬于1群冠狀病毒，其抗原性與其他冠狀病毒無交叉，僅有1種血清型。輔助蛋白ORF3的基因位于S蛋白和E蛋白之間，屬PEDV特異性基因。對PEDV分離需用綠猴腎傳代細(xì)胞培養(yǎng)，鴨腸道細(xì)胞也可以用于PEDV的傳代培養(yǎng)。PEDV與紅細(xì)胞不發(fā)生凝集現(xiàn)象。

1.2 流行病學(xué)

PED只限于豬。病豬和帶毒豬是主要傳染源，主要經(jīng)口、糞便、水源、飼料、器具、車輛、工作人員制服以及蚊蟲老鼠等傳播。該病毒傳播迅速、寒冷季節(jié)發(fā)病頻繁、哺乳仔豬發(fā)病率和病死率較高。帶毒的豬場如有仔豬出生，病毒會不斷感染失去母源抗體保護(hù)的斷奶仔豬，使本病呈地方流行性。

1.3 臨床癥狀及病理變化

哺乳仔豬糞便不成型，以黃色、淡綠色或灰白色為特點(diǎn)、且惡臭、不帶血，死亡率較高。保育豬和成年豬癥狀較輕，后期可自行恢復(fù)。剖解可見腸系膜淋巴結(jié)腫大、腸內(nèi)有黃色液體和干酪樣乳塊。組織學(xué)觀察，空腸上皮細(xì)胞有空泡形成、腸絨毛變短、細(xì)胞變性壞死。

1.4 診斷方法

對小腸組織接種于綠猴腎傳代細(xì)胞（Vero）加入胰酶進(jìn)行盲傳分離[4]。為檢測血清中PEDV特異性抗體，以PEDV的N蛋白為抗原建立FMIA方法，以免疫血清為抗體、PED致敏紅細(xì)胞為抗原建立的間接凝集試驗(yàn)（IHA）和以病毒陽性標(biāo)本為抗原、被檢血清為抗體、以兔抗豬lgG熒光抗體建立的間接免疫試驗(yàn)（IFA）對豬傳染性胃腸炎進(jìn)行檢測[5]。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒疫苗株ORF3基因序列，設(shè)計并合成特異性引物[6]，建立檢測豬流行性腹瀉病毒野毒株和疫苗株的RT-PCR方法。根據(jù)GenBank PEDV M基因、TGEV S基因、PoRV VP7基因的保守序列設(shè)計特異性引物[7]，建立RT-PCR方法。以豬流行性病毒腹瀉N基因序列，設(shè)計特異性引物[8]，建立RTPCR方法。對GenBank中多株P(guān)EDV M基因序列進(jìn)行比對后，設(shè)計特異性引物[9]，建立熒光定量PCR方法。

1.5 防治措施

采用豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和輪狀病毒細(xì)胞培養(yǎng)物制備三聯(lián)滅活疫苗[10]。中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所制備豬傳染性胃腸炎（TGE）和豬流行性腹瀉（PED）二聯(lián)滅活苗及二聯(lián)活疫苗[11]。用2.5%恩諾沙星注射液進(jìn)行肌肉注射，按每10 kg體重1 mL的量進(jìn)行注射，每天2次；還可用頭孢噻呋鈉+鏈霉素+黃芪混合進(jìn)行肌肉注射，每天2次，連用2～3 d，治療效果明顯[12]。給母豬飼喂表達(dá)PEDV S蛋白的重組枯草芽孢桿菌，可有效提高母豬乳汁及其分離細(xì)胞特異性SlgA、lNF-γ、TGF-α的水平[13]。以白頭翁湯為基礎(chǔ)方劑，添加柯子、蒼術(shù)、厚樸對豬流行性腹瀉治療，獲得良好的療效[14]。根據(jù)豬流行性腹瀉的流行病學(xué)特點(diǎn)，可對帶毒豬和病豬進(jìn)行隔離，對糞便、水源、飼料、器具、車輛、工作人員制服嚴(yán)格消毒，定期驅(qū)蚊殺鼠，用以上措施減少病毒的傳播。冬春季節(jié)做好仔豬保溫工作，確保仔豬吃到初乳，增加機(jī)體免疫力。無病期間對疑似病進(jìn)行及時檢測，對疫區(qū)及受威脅區(qū)進(jìn)行嚴(yán)格管控。

2 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）引起的一種胃腸道疾病。該病常與PED混合感染，預(yù)防本病難度較大，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的危害。1933年，美國首次報道該病，現(xiàn)階段該病已在世界各國流行[15]。

2.1 病原

豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）屬于冠狀病毒屬1群冠狀病毒，TGEV可在豬腎細(xì)胞或豬甲狀腺細(xì)胞上生長[16]。TGEV與豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）有交叉保護(hù)作用，病毒可凝集牛、雞和豚鼠的紅細(xì)胞，不凝集人、小鼠和鵝的紅細(xì)胞，且病毒只有一種血清型。

2.2 流行病學(xué)

TGE經(jīng)糞便、乳汁、嘔吐物及鼻分泌物等傳播，經(jīng)感染TGE死亡豬的血液和屠宰廢棄物易可傳播。2周齡哺乳仔豬發(fā)病較多、死亡率高、潛伏期短。該病爆發(fā)于寒冷季節(jié)，常與PED混合感染。新疫區(qū)呈流行性，老疫區(qū)則呈地方流行性。豬是該病的自然宿主，貯存宿主有犬、貓、小鼠、倉鼠、兔、狐貍等，都可攜帶病毒[17]。

2.3 臨床癥狀及病理變化

腹瀉是豬傳染性胃腸炎的主要特征。哺乳仔豬糞便顏色呈黃綠色或灰白色，糞便中有凝乳塊。TGE臨床癥狀與PED極為相似。哺乳仔豬發(fā)病出現(xiàn)急性死亡，死亡率高。5周齡以上的仔豬死亡率較低，后期可自愈。剖解可見小腸腫脹、出血、腸壁透明松弛、腸系膜淋巴結(jié)腫大。鏡檢可見腸絨毛縮短脫落、內(nèi)膜粗糙。

2.4 診斷方法

目前，實(shí)驗(yàn)室以ST、PK15和IBRS2細(xì)胞系用來分離TGEV。利用原代豬甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行TGEV分離，盲傳九代出現(xiàn)具有典型TGEN細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），再適應(yīng)豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2獲得成功。

以重組的N蛋白作為診斷抗原，建立TGEV抗體間接ELISA檢測方法；以TGEV N蛋白作為診斷抗原，建立檢測TGEV血清抗體的間接ELISA檢測方法；以抗TGEV N蛋白的單抗和多抗血清建立雙抗體夾心ELISA方法；在單克隆抗體基礎(chǔ)上建立免疫組化法[18-19]。根據(jù)豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的基因序列通過設(shè)計2對特異性引物，建立雙重RT-PCR檢測方法[20]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展克服諸多難題，新的檢測方法不斷被應(yīng)用，如恒溫隔熱RT-PCR、實(shí)時熒光定量RT-PCR等用于病原的檢測，但在實(shí)際工作中需要與其他檢測方法配合應(yīng)用[20-21]。

2.5 防治措施

對妊娠母豬和哺乳仔豬進(jìn)行豬傳染性胃腸炎豬和流行性腹瀉弱毒二聯(lián)苗免疫，可有效保護(hù)出生仔豬、斷奶仔豬和育肥豬抵抗TGEV和PEDV強(qiáng)毒的攻擊[22]。用烏洛托品腹腔注能有效提高病豬的康復(fù)率[23]。TGE免疫以局部黏膜免疫為主[24]，免疫妊娠母豬后，哺乳仔豬可從乳汁中獲得免疫保護(hù)。近些年，有研究學(xué)者用復(fù)方中藥對TGE進(jìn)行治療研究。用高劑量郁金散加減方（郁金散的基礎(chǔ)上添加白術(shù)、甘草、木香、白頭翁4味中藥，同時減去黃芩、黃檗、梔子、大黃）對TGE有較好的治療效果，用黃芪提取液和香菇提取液與枯草芽孢桿菌、食淀粉乳桿菌、屎腸球菌3種益生菌的培養(yǎng)上清聯(lián)合使用發(fā)現(xiàn)其抗TGEV作用明顯[25-26]，其中，枯草芽孢桿菌聯(lián)合黃芪提取液效果較好。

根據(jù)該病流行特點(diǎn)，對豬場犬、狐貍、老鼠進(jìn)行撲殺，冬春季節(jié)應(yīng)加強(qiáng)哺乳仔豬圈舍溫度；同時，做好定時通風(fēng)，對圈舍及內(nèi)部設(shè)備定期消毒。在TGE易感季節(jié)對環(huán)境和人員流動加強(qiáng)管制、做好定期檢疫記錄、制定完整的免疫計劃。當(dāng)發(fā)病時，隔離病豬、封鎖疫區(qū)、緊急免疫、對病死豬進(jìn)行無害化處理、對圈舍徹底清洗消毒，平時要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。

3 豬急性腹瀉綜合征

豬急性腹瀉綜合征（SADS）由一種新型蝙蝠冠狀病毒（SADS-CoV）引起。本病發(fā)病率高、死亡率高、5日齡內(nèi)仔豬多發(fā)。仔豬出現(xiàn)急性腹瀉、嘔吐。

3.1 病原

2017年，在華南某豬場從腹瀉仔豬體內(nèi)成功分離出病毒。研究證實(shí)，是1種類似蝙蝠冠狀病毒HKU2的冠狀病毒SADS-CoV[27]，屬于1群冠狀病毒，具有典型冠狀病毒結(jié)構(gòu)，SADS-CoV對仔豬的致病力低于PEDV。PEDV、TDEV、PDCoV（豬德爾塔冠狀病毒）的抗體與SADS-CoV不發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.2 流行病學(xué)

該病主要經(jīng)呼吸道、消化道傳播，被污染的飼料、工具、運(yùn)輸車也可傳播。病豬和帶毒豬是該病的主要傳染源.5日齡以下仔豬發(fā)病率達(dá)90%，8日齡以上仔豬死亡率較低，病程2～5 d。該病冬春季節(jié)多發(fā)。

3.3 臨床癥狀及病理變化

哺乳期仔豬以嘔吐、水樣腹瀉、病程短為主要特征。母豬出現(xiàn)輕微腹瀉，后期可恢復(fù)健康。剖解可見小腸腫脹、腸壁變薄、腸管彈性降低等。組織學(xué)檢查，腸上皮細(xì)胞變性壞死、腸絨毛縮短。

3.4 診斷方法

根據(jù)新型豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的保守序列核衣殼蛋白（N蛋白）基因設(shè)計特異性熒光定量PCR引物和探針[28]，建立一種檢測新型豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的熒光定量引物及試劑盒。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中SADS-CoV GDS04毒株的核衣殼蛋白（N）基因核酸序列設(shè)計特異性套式引物[29]，建立檢測SADS-CoV的套式PCR方法。

3.5 防治措施

現(xiàn)階段，尚無疫苗預(yù)防本病，抗生素治療效果無效。用中藥藿香、大腹皮、厚樸、茯苓、陳皮、谷芽、蒼術(shù)、萹蓄組成方劑，對腹瀉豬進(jìn)行治療，取得較好效果；用水楊梅全草水煎灌服治療腹瀉豬，治療效果明顯[30]。根據(jù)該病的流行特點(diǎn)，冬春季節(jié)加強(qiáng)哺乳產(chǎn)房的保溫工作，保證飼料質(zhì)量。本病的發(fā)生與PED感染有密切關(guān)系，要加強(qiáng)對PED愈后觀察。對發(fā)病或死亡豬進(jìn)行無害化處理，對人員、工具、場地、圈舍嚴(yán)格徹底消毒。

4 展望

近年來，豬冠狀病毒病在國內(nèi)外廣泛流行，其血清型較多，易發(fā)生變異，并且冠狀病毒引起動物臨床癥狀各不相同。現(xiàn)階段，由于冠狀病毒易發(fā)生變異，需進(jìn)一步分離病毒株，開發(fā)不同型號的疫苗。