沉默CXCL12抑制ox-LDL誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7泡沫化和凋亡

莊 紅，張?zhí)K川，劉慧地，徐亞寧，黃 璐，代 天，蔣 品

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院) 心血管內(nèi)科, 湖北 武漢 430015)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康和生活質(zhì)量的疾病之一，揭示AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，對(duì)有效預(yù)防和治療AS具有重要意義[1]。巨噬細(xì)胞參與的脂質(zhì)代謝障礙是AS的病變基礎(chǔ)；巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡是導(dǎo)致AS斑塊不穩(wěn)定的重要因素；干預(yù)巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡可對(duì)阻止AS進(jìn)展、防治心腦血管病的發(fā)生具有重要意義[2]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是AS的重要危險(xiǎn)因子，其可以結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL，造成脂質(zhì)積聚，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞[3]。CXC趨化因子配體 12(CXC chemokine ligand 12，CXCL12)是CXC趨化因子家族的成員，又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，穩(wěn)定和不穩(wěn)定的頸動(dòng)脈粥樣斑塊中CXCL12的表達(dá)增加，且定位在巨噬細(xì)胞中[4]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是調(diào)控免疫炎性反應(yīng)最主要的MAPK家族成員之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)影響AS的進(jìn)展[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CXCL12對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡作用及其機(jī)制是否與p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7(上海北諾生物科技有限公司)；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)(廣州奕源生物科技有限公司)；油紅O(Sigma-Aldrich公司)；蘇木精(上海源葉生物科技有限公司)；異丙醇(天津市化學(xué)試劑三廠)；蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；抗體(Cell Signaling Technology 公司)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒(Progema公司)；載體質(zhì)粒(北京普瑞金科技有限公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，待細(xì)胞匯合至90%左右時(shí)，進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)增殖期RAW264.7細(xì)胞，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用60 mg/L的ox-LDL處理24 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化，記為ox-LDL組，不添加ox-LDL的作為對(duì)照(NC)組；將si-con、si-CXCL12轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞中再用60 mg/L的ox-LDL處理，分別記為ox-LDL+si-con組、ox-LDL+si-CXCL12組。

1.2.2 油紅O染色觀察細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞去上清后用PBS洗滌3次,10%甲醛固定30 min，再用PBS洗滌2次，用60%異丙醇浸洗5 min，吸去異丙醇，加入油紅O，置于60 ℃烤箱中染色30 min，蒸餾水清洗3次，蘇木精染色5 min，蒸餾水洗藍(lán)化1～3 min，控干，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 Western blot檢測(cè)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA-1)、B類1型清道夫受體(SRB-1)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cleaved caspase-9)、CXCL12、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白表達(dá):培養(yǎng)細(xì)胞48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:培養(yǎng)細(xì)胞48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μL的annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)CXCL12 mRNA表達(dá)水平:培養(yǎng)細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，CXCL12以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。CXCL12上游引物序列：5′-TTCCATTTGCAAGGGAAAAG-3′，下游引物序列：5′-ACACACAGCCAGTCAACGAG-3′；β-actin上游引物序列：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7泡沫化

對(duì)照組大部分細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅染脂滴，僅少數(shù)細(xì)胞內(nèi)有少量脂滴；ox-LDL組細(xì)胞體積增大，形狀變?yōu)閳A形，胞質(zhì)中可明顯見(jiàn)到大量紅色脂滴(圖1A)。與對(duì)照組相比，ox-LDL組ABCA-1和SRB-1表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)(圖1B，表1)。

A.Oil red O staining diagram(×200); B.ABCA-1 and SRB-1 protein expression圖1 RAW264.7細(xì)胞油紅O染色觀察和Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞ABCA-1和SRB-1蛋白表達(dá)

表1 ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)ABCA-1和SRB-1蛋白表達(dá)的影響

2.2 ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡

與對(duì)照組相比，ox-LDL組cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)(圖2，表2)。

2.3 ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞CXCL12基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL組CXCL12 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖3，表3)。

A.fow cytometry detection of RAW264.7 cell apoptosis; B.Western blot detection of RAW264.7 cell cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 protein expression

表2 ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞CXCL12蛋白表達(dá)Fig 3 Western blot detection of CXCL12 protein expression in RAW264.7 cells

表3 ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞對(duì)CXCL12表達(dá)的影響

2.4 沉默CXCL12基因?qū)奘杉?xì)胞RAW264.7泡沫化和凋亡的影響

ox-LDL+si-con組大部分細(xì)胞形狀為圓形，胞質(zhì)中明顯有大量紅色脂滴；而ox-LDL+si-con-CXCL12組大部分細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)紅染脂滴，僅少數(shù)細(xì)胞內(nèi)有部分脂滴(圖4A)。與ox-LDL+si-con組相比，ox-LDL+si-CXCL12組CXCL12表達(dá)水平顯著降低，ABCA-1、SRB-1表達(dá)水平顯著降低，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)(圖4B～C，表4)。

2.5 沉默CXCL12基因?qū)奘杉?xì)胞RAW264.7 p38MAPK信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL組p-p38MAPK表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與ox-LDL+si-con組相比，ox-LDL+si-CXCL12組p-p38MAPK表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖5，表5)。

3 討論

AS是由脂質(zhì)代謝失衡和動(dòng)脈壁中含有膽固醇的巨噬細(xì)胞積聚驅(qū)動(dòng)引起的一種慢性炎性疾病，發(fā)病率和致死率高，對(duì)人體健康危害極大[6]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要一員，其泡沫化可導(dǎo)致AS病變，與AS形成和發(fā)展密切相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)用ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化，結(jié)果表明ox-LDL處理可致巨噬細(xì)胞泡沫化，且可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。患有動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的患者血清CXCL12水平顯著增加[8]。CXCL12與CXCR4相互作用，激活糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)T120/轉(zhuǎn)錄因子21(transcription factor 21，TCF21)信號(hào)通路，以抑制巨噬細(xì)胞ABCA-1依賴性膽固醇外流并加重動(dòng)脈粥樣硬化[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL處理的巨噬細(xì)胞中CXCL12表達(dá)水平顯著升高，沉默CXCL12可抑制巨噬細(xì)胞泡沫化和細(xì)胞凋亡。表明CXCL12可能與AS進(jìn)展有關(guān)。

圖4 RAW264.7細(xì)胞油紅O染色觀察(A)和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞凋亡(B)及Western blot檢測(cè)CXCL12、ABCA-1和SRB-1蛋白表達(dá)(C)

表4 沉默CXCL12基因抑制ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞泡沫化和凋亡Table 4 Silencing CXCL12 gene inhibits ox-LDL-induced foaming and apoptosis of RAW264.7

圖5 Western blot檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)Fig 5 Western blot detection of p38MAPK and p-p38 MAPK protein expression in RAW264.7 cells

表5 沉默CXCL12基因?qū)AW264.7細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路的影響

纖維脂肪動(dòng)脈粥樣硬化病變中p-p38MAPK表達(dá)增加[10]；綠茶多酚可通過(guò)阻斷p38MAPK通路的活化延緩AS斑塊進(jìn)展[11]。沉默CXCL12通過(guò)下調(diào)MAPK/磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinese，PI3K)/活化蛋白1(activating protein 1，AP-1)信號(hào)通路顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成能力[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ox-LDL處理的巨噬細(xì)胞RAW264.7中p-p38MAPK表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明ox-LDL可能誘導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路激活。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)沉默CXCL12可抑制p38 MAPK信號(hào)通路激活。提示，CXCL12可能通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路影響巨噬細(xì)胞RAW264.7泡沫化和細(xì)胞凋亡。

綜上所述，沉默CXCL12抑制ox-LDL誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7泡沫化和細(xì)胞凋亡，其可能與p38MAPK信號(hào)通路有關(guān)。