（安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，合肥 230061）

蜜蜂作為一種社會性昆蟲，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值，在諸如神經(jīng)生物學和社會生物學等研究領(lǐng)域具有很高的模型價值[1]。我國飼養(yǎng)的西方蜜蜂品種中，主要是以意大利蜜蜂為主[2]。四氫生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin，BH4）是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶[3,4]，也是一氧化氮合酶的輔因子，能作為自由基清除劑參與氧化應激作用[5-8]，BH4的合成不足會引發(fā)多種神經(jīng)性疾病[9-11]?，F(xiàn)階段，BH4合成代謝網(wǎng)絡(luò)在雙翅目模式生物黑腹果蠅和鱗翅目模式生物家蠶中都有較多的研究[12-15]，但是在以蜜蜂為代表的膜翅目昆蟲中鮮有研究。研究蜜蜂的BH4合成途徑對于意蜂乃至膜翅目的生理意義重大，特別是對于昆蟲體內(nèi)的氧化平衡以及神經(jīng)系統(tǒng)方面的影響。

二氫蝶呤還原酶（dihydropteridine reductase，DHPR）是一種催化醌型二氫生物蝶呤（Quinone dihydrobiopterin，q-BH2）還原成四氫生物蝶呤的還原酶[16]。此反應需要NADH的參與，利用DHPR將還原型的NADH煙酰胺環(huán)上的氫離子直接轉(zhuǎn)移到q-BH2上，NADH也可由還原型輔酶NADPH替代[15]。果蠅DHPR氨基酸序列與包括人和小鼠的其他物種高度同源，也具有與人類DHPR相同的 NAD（P）H結(jié)合域以及組成q-BH2結(jié)合位點相關(guān)的大多數(shù)氨基酸[12]。家蠶BmDHPR氨基酸序列與其他物種來源的DHPR 蛋白具有高度同源性，且BmDHPR與果蠅親緣關(guān)系較近[13,15]。最新有研究發(fā)現(xiàn)果蠅DHPR缺失的突變體表現(xiàn)出大腦TH神經(jīng)元減少缺陷，還顯示出線粒體的異常膨大與聚集現(xiàn)象[14]，表明DHPR對于線粒體穩(wěn)態(tài)的重要性[14]。

生物信息學方法在功能基因的測序、識別、功能預測、結(jié)構(gòu)分析等方面都發(fā)揮著重要作用。自意大利蜜蜂基因組全序列測序完成后，越來越多的生物信息學方法應用到意蜂各類基因的研究工作中。鑒于DHPR對于BH4和線粒體的重要性，本文采用生物信息學方法，對意蜂二氫蝶呤還原酶的預測基因進行一系列的預測分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，旨在為后續(xù)深入研究意蜂二氫蝶呤還原酶的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列來源

NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的意大利蜜蜂二氫蝶呤還原酶預測基因（GenBank序列號為XM_392684.7）；蜜蜂BeeBase數(shù)據(jù)庫的意大利蜜蜂二氫蝶呤還原酶預測基因（基因序列號：GB50513）。

1.2 方法

使用ORF Finder對編碼意蜂二氫蝶呤還原酶的氨基酸組分進行分析；ExPASy-Compute pI/Mw tool網(wǎng)站預測蛋白的分子量與等電點；采用Psipred在線網(wǎng)站進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測；通過SWISS-MODEL網(wǎng)站比對與意蜂DHPR相似性較高的模板對意蜂DHPR進行同源建模，構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；使用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蜜蜂DHPR的預測基因信息

利用NCBI數(shù)據(jù)庫檢索到意大利蜜蜂DHPR的預測基因，基因編號為LOC409160，再結(jié)合蜜蜂BeeBase數(shù)據(jù)庫中對于該預測基因的分析，分析結(jié)果顯示：意蜂DHPR預測基因全長2264bp，開放閱讀框大小為714bp，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子（圖1）。DNAMAN軟件預測該基因編碼237個氨基酸（不包括TAA）（圖2）。

圖1 意蜂DHPR預測基因的結(jié)構(gòu)圖

圖2 意蜂DHPR的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

2.2 意大利蜜蜂DHPR蛋白的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam分析意大利蜜蜂DHPR的蛋白組分和理化性質(zhì)（表1）。意蜂DHPR編碼蛋白的氨基酸組成中，不含Pyl和Sec，Ala含量最高，達到11.4%；含有20個酸性氨基酸(Asp+Glu)，24個堿性氨基酸(Arg+Lys)；氨基酸序列的不穩(wěn)定系數(shù)為29.55，說明此蛋白是穩(wěn)定的；預測蛋白分子量約為25.67kDa，理論等電點(pI)為8.90，原子組成為C1150H1814N310O336S10，脂肪族氨基酸指數(shù)為89.41，親水性指數(shù)為-0.077，表明其為親水性蛋白。

表1 意蜂DHPR的蛋白組分和理化性質(zhì)

2.3 意大利蜜蜂DHPR蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

利用Psipred在線網(wǎng)站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)對西方蜜蜂DHPR蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果如圖3所示，DHPR蛋白含有8個α螺旋和8個β折疊結(jié)構(gòu)，以 （beta-alpha）4-（beta-alpha-alpha）2-betabeta的排列方式存在。沒有預測到蛋白含有二硫鍵或跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.4 意大利蜜蜂DHPR蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站（https://www.swissmodel.expasy.org/）對西方蜜蜂DHPR蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預測，選擇氨基酸一致性最高為59.83%的秀麗隱桿線蟲1ooe.1作為同源模擬的模板，進行DHPR單體的同源建模，得出相關(guān)3D模型（圖4），8個α-螺旋和8個β-折疊的三級結(jié)構(gòu)，這與哺乳動物DHPR的三級結(jié)構(gòu)的組成相同，也符合該蛋白二級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果（圖3）。秀麗隱桿線蟲DHPR氨基酸序列與人DHPR的同源性為43%，與大鼠DHPR的同源性為49%，它與哺乳動物DHPR/NADH復合物有著顯著的結(jié)構(gòu)同源性。因為NADH的結(jié)合不會引起DHPR分子構(gòu)象的任何變化，所以，意大利蜜蜂DHPR蛋白可能具有與哺乳動物DHPR類似的功能。

圖3 西方蜜蜂DHPR蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

圖4 西方蜜蜂DHPR蛋白單體三級結(jié)構(gòu)同源模擬

2.5 意大利蜜蜂DHPR蛋白與其他物種的系統(tǒng)進化樹分析

使用軟件MEGA 6.0中的最大似然法，將意大利蜜蜂DHPR與其他7個物種DHPR蛋白的氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：西方蜜蜂DHPR與同為膜翅目的大蜜蜂Apis dorsata和小蜜蜂Apis florea親緣關(guān)系最近，與人類的親緣關(guān)系較遠（圖5）。此結(jié)果為后續(xù)開展意大利蜜蜂 DHPR蛋白的功能分析研究提供了參考信息。

圖5 基于意大利蜜蜂與其他物種DHPR蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹（最大似然法）

3 討論

蜜蜂在生物學上是全變態(tài)昆蟲，在農(nóng)業(yè)上是重要的授粉昆蟲，在科研中亦是重要的模式生物。目前對昆蟲二氫蝶呤還原酶的研究多集中在果蠅和家蠶等其他種類的昆蟲上，而膜翅目意蜂二氫蝶呤還原酶的研究卻未見報道。意蜂二氫蝶呤還原酶在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學功能方面相對于其他昆蟲是否有特別之處，需要科學工作者們做更多的研究與探索。本文利用生物信息學方法對意大利蜜蜂二氫蝶呤還原酶基因進行了系統(tǒng)分析，結(jié)果表明，意蜂二氫蝶呤還原酶基因全長2264bp，含有一個714bp的開放閱讀框，編碼237個氨基酸，屬于親水性蛋白；預測蛋白分子量約為25.67kDa，理論等電點（pI）為8.90，原子組成為C1150H1814N310O336S10；蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由8個α-螺旋和8個β-折疊組成，同源建模了此蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，暗示意蜂 DHPR蛋白具有與哺乳動物DHPR類似的功能；使用8種6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，意蜂DHPR與大蜜蜂和小蜜蜂的DHPR親緣關(guān)系較近，分析結(jié)果與傳統(tǒng)的生物學分類結(jié)果一致。

本文的研究結(jié)果為深入開展意蜂二氫蝶呤還原酶的科學研究提供基礎(chǔ)信息，為意蜂該催化酶的克隆分析、分離及純化提供了參考，也為進一步研究其高級結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)。本文是基于生物信息學工具對目標基因進行的系統(tǒng)研究，關(guān)于意大利蜜蜂二氫蝶呤還原酶的具體生物學功能和表達機制等還需進一步研究。