王致禹，陳曉倩，孟慶鳳，李 春，劉麗波*，曲國強，孫雪婷

（1 東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室 哈爾濱150030 2 交鐵檢驗認證中心（成都）有限公司 成都610000）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是常用的生物催化酶制劑之一。脂肪酶可以水解甘油三酯并進行逆向合成反應合成新分子。脂肪酶可以作用于多種底物，在溫和條件下表現(xiàn)出高區(qū)域選擇性和對映體選擇性。脂肪酶催化的反應主要有產(chǎn)量高，產(chǎn)物雜質少和環(huán)境友好等優(yōu)點[1-2]。

諾維信脂肪酶（Lipozyme TL IM）是一種來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌的sn-1，3 特異性脂肪酶，它能夠催化酯化反應重新排列脂肪酸，具有高度的底物選擇性和良好的熱穩(wěn)定性，用于人乳脂肪替代品的合成和生物柴油的制備中[3-6]。盡管Lipozyme TL IM 價格較低，工業(yè)化應用的成本還是目前急需解決的問題。通過優(yōu)化工藝篩選高產(chǎn)菌株，提高脂肪酶活性以及再生等方法提高脂肪酶的產(chǎn)率和利用率，是實現(xiàn)脂肪酶工業(yè)化應用的最主要問題。

目前測定脂肪酶三級結構的方法主要是熒光光譜法，測定二級結構的方法主要有圓二色譜法和傅里葉變換紅外光譜法。圓二色譜和傅里葉變換紅外光譜可以區(qū)分脂肪酶二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲等結構[7-8]。目前提高脂肪酶活性的方法有很多。如：極性有機溶劑可以改變脂肪酶的構象[9]，從而提高脂肪酶活性；超高壓技術對有害酶有鈍化作用，還可以提高一些酶的活力[10-11]。

本文通過使用熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜技術檢測不同催化次數(shù)的脂肪酶，分析脂肪酶活性與二級、三級結構之間的關系。使用有機溶劑和混合油脂處理脂肪酶，使低活性脂肪酶的催化活性恢復，達到低活性脂肪酶重復利用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lipozyme TL IM（250 PLU/g），北京高瑞森科技有限公司；異丙醇，上海阿拉丁生化科技有限公司；椰子油，菲律賓Supercoco 集團有限公司；菜籽油，山東魯花集團有限公司。

1.2 儀器與設備

PerkinElmer Spectrum 400 傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀，美國Perkin Elmer 公司；F4500 熒光分光光度計，日本日立公司；Agilent 7890A 型氣相色譜儀，美國Agilent 科技有限公司；Waters 2695-2420 高效液相色譜儀，美國Waters 科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂肪酶的預處理 在9 份具塞三角瓶中加入棕櫚酸甘油三酯與油酸，物質的量比為1∶4，添加8%的Lipozyme TL IM 脂肪酶，在60 ℃，200 r/min 的氣浴搖床中進行振蕩反應，分別反應1～9次，每次反應時間為6 h。反應完成后，用100 目過濾篩分離油脂與脂肪酶，收集脂肪酶，用丙酮清洗脂肪酶表面多余的油脂，干燥后儲存在4 ℃待用。

1.3.2 脂肪酶活性的測定 固定化脂肪酶可將1-丙醇和月桂酸酯化，形成丙基月桂酸酯。標準反應條件下每分鐘生成1 μmol 的丙基月桂酸酯所需的酶的量為一個單位，表示為PLU。將約30 mg的Lipozyme TL IM 置錐形瓶中，加入10.73 g 反應底物（24.0 g 1-丙醇，80.1 g月桂酸和3.2 g 蒸餾水），蓋上膠塞，立即放入60 ℃水浴中反應20 min。20 min 后取出錐形瓶，吸取5 μL 上清液，加入995 μL 庚烷，轉移至氣相樣品瓶中。采用帶有FID 檢測器的Agilent 7890A 型氣相色譜儀檢測。毛細管柱選用restek stabilwas DA 柱（15 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣量0.7 μL。載氣為氦氣，流速1.7 mL/min，分流比50∶1。進樣器溫度280 ℃，檢測器溫度280 ℃。柱溫程序：60 ℃保持1 min，以50℃/min 速率升至250 ℃保持2.2 min。試驗結束后在以下溫度清洗儀器3 h，除去儀器中的殘留物。進樣器350 ℃，檢測器350 ℃，柱250 ℃[12]。

月桂酸到丙基月桂酸酯的轉化量按式（1）計算：

式中，C——月桂酸到丙基月桂酸酯的轉化量（g）；LA——月桂酸濃度（mmol/L）；PL——丙基月桂酸酯濃度（mmol/L）；APL——色譜圖上丙基月桂酸酯的面積（mAUos）；ALA——色譜圖上月桂酸的面積（mAU·s）；R1——標準曲線上丙基月桂酸酯的響應因子；R2——標準曲線上月桂酸的響應因子。

酶活性按式（2）計算：

式中：M——1-丙醇和月桂酸的初始量（g）；C——轉化成丙基月桂酸酯的月桂酸的量（g）；m——催化劑干物質的量（g）；t——反應時間（min）。

單位定義：在標準反應條件下每分鐘生成1 μmol 的丙基月桂酸酯所需要的酶的量為一個單位，用PLU 表示。

1.3.3 脂肪酶二級結構的測定 分別測定使用0 ～9 次后脂肪酶的二級結構。將固定化的Lipozyme TL IM 脂肪酶在研缽中研成粉末，置真空冷凍干燥機中干燥12 h。取適量Lipozyme TL IM 真空冷凍干燥粉末，置于研缽中，與一定量溴化鉀粉末混合，用研磨棒研磨均勻后壓片，紅外光譜測定，掃描范圍4 000～400 cm-1[13]。圖譜處理方法：選取傅里葉紅外光譜圖中的酰胺Ⅰ帶圖譜，使用Peakfit 4.12 曲線擬合軟件。首先對酰胺Ⅰ帶的圖譜進行基線校正，調整參數(shù)對譜圖去卷積。采用二階導數(shù)方法對譜圖的分峰擬合，用Origin 2018對圖譜進行高斯曲線擬合，根據(jù)擬合峰的位置確定其對應二級結構類型，計算二級結構的含量。

1.3.4 脂肪酶三級結構的測定 使用熒光發(fā)射光譜分別測定使用0～9 次后脂肪酶的三級結構。熒光發(fā)射光譜條件：激發(fā)波長279 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫5 nm，掃描波長300～400 nm，速度12 000 nm/min，PMT 電壓400 V，響應時間0.1 s。

1.3.5 脂肪酶活性的再生 考慮到工業(yè)化生產(chǎn)中，低活性脂肪酶的生產(chǎn)效率不高，使得時間成本增加，使用催化5 次的脂肪酶進行脂肪酶活性的再生試驗。將使用5 次的脂肪酶用丙酮清洗去除表面多余的油脂，在20，30，40，50，60，70 ℃異丙醇中浸泡20，40，60，80，100，120 min 后取出干燥。將干燥好的脂肪酶按m混合油脂∶m脂肪酶=4∶1 的比例放入混合油脂（m菜籽油∶m椰子油=9∶1）中，室溫下磁力攪拌24 h，過濾分離脂肪酶，用丙酮清洗脂肪酶表面的油脂，離心干燥[14]。

1.3.6 異丙醇對脂肪酶活性影響的正交試驗 在異丙醇浸泡時間和溫度對脂肪酶活性影響的基礎上，設計二因素三水平試驗，選出最佳條件。

1.3.7 脂肪酶對甘油三酯的位置特異性 取2 g棕櫚酸甘油三酯和2.8 g 油酸加入具塞三角瓶中，加入0.38 g Lipozyme TL IM 脂肪酶，置于60 ℃，200 r/min 氣浴搖床中反應6 h。反應結束后，取0.1 g 產(chǎn)物溶解于10 mL 正己烷中，過膜后待測。使用高效液相色譜法檢測產(chǎn)物，研究脂肪酶的位置特異性。

高效液相色譜條件：配有蒸發(fā)光散射檢測器（2420，美國沃世特公司）和分離模塊（2695，美國沃世特公司）的高效液相色譜，色譜柱為C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，25 μm，大連依利特），流動相為丙酮和乙腈的混合液（v丙酮∶v乙腈=8∶2），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 不同使用次數(shù)的脂肪酶的活性

圖1 顯示不同催化酯交換次數(shù)Lipozyme TL IM 的活性。隨著脂肪酶使用次數(shù)的增加，脂肪酶的活性持續(xù)下降，使用0 次的脂肪酶活性為250.00 PLU/g，使用1 次和使用2 次的脂肪酶活性分別為190.58 PLU/g 和133.32 PLU/g，具有顯著性差異（P＜0.05）。使用3，4 次和5 次的脂肪酶的活性分別為84.31，83.73，83.50 PLU/g，與之前使用次數(shù)的脂肪酶活性均有顯著性差異（P＜0.05），而彼此間差異不明顯。使用6，7 次和8 次的脂肪酶的活性分別為67.30，67.21，66.72 PLU/g，同樣與之前各組的脂肪酶活性有顯著性差異（P＜0.05），而彼此間差異不明顯。使用9 次的脂肪酶的活性為25.00 PLU/g（P＜0.05）。

2.2 脂肪酶的二級結構

不同催化次數(shù)的脂肪酶的紅外光譜圖見圖2。其中，脂肪酶的酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）可以反映脂肪酶的二級結構，據(jù)文獻[13]，[15]，[16]報道，結合二階導數(shù)圖譜，可將脂肪酶酰胺Ⅰ帶的各個子峰歸屬為不同的二級結構：1 615～1 640 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結構；1 640～1 649 cm-1為無規(guī)則卷曲結構；1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結構；1 661～1 681 cm-1為β-轉角結構。通過對不同使用次數(shù)的脂肪酶的紅外光譜圖酰胺Ⅰ帶進行基線校正，去卷積，分峰擬合得到二階導數(shù)圖譜。擬合后各脂肪酶酰胺Ⅰ帶的圖譜見圖3。通過對各子峰進行結構歸屬，計算各二級結構所占比例，得到不同使用次數(shù)脂肪酶二級結構的含量見表1。隨著使用次數(shù)的增加，脂肪酶二級結構中β-折疊的含量逐漸增加，α-螺旋的含量減少，其它各二級結構增減程度不同。由此可見，脂肪酶活力的下降與β-折疊的增加有一定關系。敖敦格日樂等[13]發(fā)現(xiàn)經(jīng)電場處理的脂肪酶活性增加，而脂肪酶的α-螺旋和β-折疊的含量均下降。張瑜等[17]指出，通過超高壓處理的脂肪酶活性增加，脂肪酶中的α-螺旋含量提高，β-折疊含量降低，說明脂肪酶的活性與其β-折疊的含量呈負相關的關系。

圖1 不同使用次數(shù)Lipozyme TL IM 的酶活性Fig.1 The activity of Lipozyme TL IM with different usage times

圖2 不同使用次數(shù)脂肪酶的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of lipases with different usage times

圖3 不同使用次數(shù)脂肪酶的擬合曲線圖Fig.3 Fitting curve of lipases with different usage times

表1 不同使用次數(shù)脂肪酶的二級結構含量Table 1 Secondary structure content of lipases with different usage times

（續(xù)表1）

2.3 脂肪酶的三級結構

大多數(shù)蛋白質都具有3 種能產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜的內源性氨基酸，分別是酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，這3 種氨基酸的側鏈有生色基團，熒光峰位波長分別在348，303，282 nm 附近。一般情況下，這些氨基酸的側鏈有疏水性，通常位于脂肪酶內核的疏水區(qū)。隨著反應進行，脂肪酶表面結構被逐漸破壞，使這些疏水基團暴露出來，可通過熒光光譜檢測觀察脂肪酶結構的變化。圖4 顯示分別使用0～9 次的脂肪酶表面疏水性的熒光光譜圖。在284.6 nm 附近有吸收峰，由此可以判斷，脂肪酶Lipozyme TL IM 的內源性氨基酸以苯丙氨酸為主。隨著使用次數(shù)的增加，熒光的吸光強度逐漸升高，表明隨著脂肪酶使用次數(shù)的增加，脂肪酶的三級結構受到影響，使苯丙氨酸的暴露面積越來越大。表2 顯示不同使用次數(shù)脂肪酶的最大發(fā)射波長和峰值。結合圖4 和表2 可知，使用9 次的脂肪酶苯丙氨酸暴露最多，三級結構受到的影響最大。結合脂肪酶的酶活性顯示：隨著脂肪酶的活性逐漸下降，脂肪酶的熒光強度逐漸增強。可能是因為使用次數(shù)增加，導致一些維持空間結構的化學鍵被破壞，使脂肪酶分子的三級結構破壞，用于催化的空間結構崩潰，脂肪酶熒光強度增加，活性下降[18]。

2.4 異丙醇浸泡時間對脂肪酶活性的影響

將低活性的脂肪酶浸泡在30 ℃異丙醇中20，40，60，80，100，120 min，過濾分離脂肪酶后干燥，測定其活性。由圖5 可知，在異丙醇中分別浸泡20，40，60，80，100，120 min 的脂肪酶活性分別為90.60，122.00，165.37，148.99，130.61，104.09 PLU/g。浸泡時間60 min 時，脂肪酶活性恢復的最高，為原脂肪酶活性的66.15%。異丙醇最佳的浸泡時間為60 min。

圖4 不同使用次數(shù)脂肪酶的熒光檢測光譜圖Fig.4 Fluorescence detection spectrum of lipases with different usage times

表2 不同使用次數(shù)脂肪酶的熒光強度Table 2 Fluorescence intensity of lipases with different usage times

2.5 異丙醇浸泡溫度對脂肪酶活性的影響

將低活性的脂肪酶分別在20，30，40，50，60，70 ℃異丙醇中浸泡60 min，過濾分離脂肪后酶干燥，測定其活性。由圖6 可知，在20，30，40，50，60，70 ℃的異丙醇中浸泡60 min 后脂肪酶活性分別為95.28，120.05，172.38，153.60，134.83，119.05 PLU/g。溫度為40 ℃時，脂肪酶活性恢復的最高，為原脂肪酶活性的68.95%。異丙醇最佳的浸泡溫度為40 ℃。有機溶劑能夠提高脂肪酶活性，可能是因為極性有機溶劑與水的親和性較好，在浸泡脂肪酶時，能夠吸收脂肪酶中多余的水分，使脂肪酶中處于閉合狀態(tài)的活性部位暴漏出來，與底物結合發(fā)揮作用[19-21]。祖昕等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用極性較強的有機溶劑處理未使用過的固定化脂肪酶，可以明顯提高脂肪酶的活性。Talukder 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，使用異丙醇預處理的脂肪酶活性比沒有處理過的脂肪酶要高。Chen 等[24]使用叔丁醇對活性降低的脂肪酶進行活性恢復，恢復后的脂肪酶活性為原脂肪酶活性的75%。以上試驗結果均與本試驗一致，極性有機溶劑可使脂肪酶的活性恢復。脂肪酶中殘余的異丙醇可通過高速離心和氮吹等物理方法去除。

2.6 異丙醇對脂肪酶活性影響的正交試驗

在異丙醇浸泡時間和溫度對脂肪酶活性影響的基礎上，選擇浸泡時間為50，60，70 min，浸泡溫度為25，30，35 ℃，設計二因素三水平試驗，共9組，因素水平表見表3，試驗條件和結果見表4。

通過對各組試驗進行顯著性分析可知，異丙醇浸泡脂肪酶恢復活性的最佳條件為：時間60 min，溫度40 ℃。在此條件下，恢復后的脂肪酶的活性為172.38 PLU/g（P＜0.05），脂肪酶活力為初始脂肪酶的68.95%。

將異丙醇處理過的脂肪酶放入室溫下的混合油脂中，磁力攪拌24 h 后測定其酶活性為241.48 PLU/g。與異丙醇處理的脂肪酶活性相比，提高了40.09%。與原脂肪酶活性相比，經(jīng)混合油脂處理的脂肪酶活性恢復了96.60%。Negishi 等[14]使用菜籽脫色油和中鏈甘油三酯混合物沖洗活性降低的脂肪酶Lipozyme TL IM，結果顯示，Lipozyme TL IM的活性恢復到原活性的90%。

圖5 異丙醇浸泡時間對脂肪酶活力的影響Fig.5 Effects of isopropanol soaking time on lipase activity

圖6 異丙醇浸泡溫度對脂肪酶活力的影響Fig.6 Effects of isopropyl alcohol soaking temperature on lipase activity

表3 正交試驗因素水平表Table 3 Factor levels table of orthogonal test

2.7 脂肪酶對甘油三酯的催化位置特異性

以棕櫚酸甘油三酯和油酸為底物，對脂肪酶Lipozyme TL IM 的催化位置特異性進行分析，結果見圖7。

若脂肪酶經(jīng)活性再生后的催化位置特異性改變或者喪失，則甘油三酯的2 位可能因酯交換反應而被油酸取代，即反應產(chǎn)物中有POP、OOO 或者OPP 生成。如圖7所示，Lipozyme TL IM 催化棕櫚酸甘油三酯和油酸產(chǎn)生的產(chǎn)物經(jīng)液相色譜檢測，含有1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯，這是因為催化底物為棕櫚酸甘油三酯和油酸，產(chǎn)物中的1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯為脂肪酶催化合成的產(chǎn)物。Lipozyme TL IM 的位置特異性沒有受到影響。

表4 異丙醇對脂肪酶活性的影響Table 4 Effects of isopropanol on lipase activity

圖7 高效液相色譜檢測結果Fig.7 High performance liquid chromatography test result

3 結論

本文主要研究了脂肪酶活性與其二級和三級結構間的關系。在脂肪酶活性降低時，脂肪酶二級結構中α-螺旋結構減少，β-折疊結構逐漸增多，且三級結構也受到影響。其熒光強度逐漸增強，氨基酸的暴漏面積隨使用次數(shù)的增加而增大。本文還研究了低活性脂肪酶活性再生的方法。在經(jīng)異丙醇和混合油脂浸泡后，低活性脂肪酶的活性得以再生，為原脂肪酶活性的96.60%。脂肪酶活性恢復后，其催化酯交換的位置特異性未受影響，為脂肪酶重復利用時結構變化和脂肪酶活性再生提供了保障。