CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻分子育種中的應(yīng)用

劉欣欣，李 赫，卜慶云，田曉杰，王臻昱，何明良，唐佳琦，李秀峰，孟 威

(1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150060；2.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

0 引 言

水稻是我國(guó)的主要糧食作物之一，近年來(lái)受耕地面積的減少以及各種生物脅迫的影響，水稻的產(chǎn)量已下降[1]。為了提高水稻產(chǎn)量和水稻的品質(zhì)，經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家的不懈努力，水稻育種已經(jīng)由傳統(tǒng)育種進(jìn)入到借助分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)以及經(jīng)典遺傳學(xué)等理論，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種[2]、生物信息學(xué)[3]、轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)[4]、分子設(shè)計(jì)學(xué)育種[5]等方法進(jìn)行的分子育種的階段。由于現(xiàn)代水稻分子育種具有更廣泛的實(shí)用性，以及育種周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為水稻育種的主要發(fā)展方向。

任何新的育種技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用都會(huì)帶來(lái)新的改變，基因編輯技術(shù)就是典型的代表[6]?；蚪M編輯技術(shù)[7]是利用工程核酸酶誘導(dǎo)基因組產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)源修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精確的修飾(替換、插入或缺失)。

高效的基因編輯技術(shù)是研究細(xì)胞過(guò)程和生物分子機(jī)制的重要工具，基因編輯技術(shù)在育種上的應(yīng)用十分廣泛[8]。在現(xiàn)代基因編輯技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，分別出現(xiàn)了鋅指核酸酶系統(tǒng)(ZFN)、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶系統(tǒng)(TALENs)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(CRISPR)[9]。三種基因編輯系統(tǒng)具有不同的編輯原理，且不同編輯系統(tǒng)作用的方式也不相同，但都依賴(lài)于經(jīng)過(guò)人工改造的限制性內(nèi)切酶[10]。ZFN和二代基因編輯技術(shù)TALENs作為最初的基因編輯技術(shù)，二者都是由DNA結(jié)合蛋白和核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合而成[11-12]，能夠精確識(shí)別并特異性切割DNA序列，使DNA雙鏈發(fā)生斷裂，最后通過(guò)同源重組或非同源末端連接的方法實(shí)現(xiàn)基因組堿基的刪除、插入或突變[13]。但ZFN技術(shù)的運(yùn)用有明顯的局限性，載體構(gòu)建難度大，對(duì)目標(biāo)序列也有嚴(yán)格的要求，所以設(shè)計(jì)出適合的打靶位點(diǎn)十分困難，即使設(shè)計(jì)出合適的打靶位點(diǎn)，若沒(méi)有高親和性、高特異性的鋅指蛋白與打靶位點(diǎn)結(jié)合，也十分易出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象，使DNA發(fā)生錯(cuò)配和序列的改變，不僅工作量大，費(fèi)用還高[14]；TALENs技術(shù)雖然對(duì)打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)要求低，選擇多，但其載體構(gòu)建繁瑣，難度大。所以需要一種簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定且成本低的基因組編輯技術(shù)來(lái)改變現(xiàn)狀。與前兩種技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)操作更簡(jiǎn)單、成本更低、效率更高，不需要設(shè)計(jì)和構(gòu)建蛋白，只需要設(shè)計(jì)sgRNA，就會(huì)產(chǎn)生突變并識(shí)別不同的打靶位點(diǎn)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因編輯[15]，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了CRISPR/Cas9精確編輯技術(shù)在水稻中具有可行性[16-17]。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)水稻進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，通過(guò)有效控制水稻基因組的修飾，進(jìn)而將具有優(yōu)良性狀的基因整合到一起，使CRISPR/Cas9技術(shù)成為保證稻米品質(zhì)，提高水稻抗逆性及產(chǎn)量的重要手段。本文總結(jié)了近幾年CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水稻新品種培育方面的應(yīng)用，詳細(xì)闡述了參與水稻抗逆性調(diào)控基因的編輯、品質(zhì)及熟期等農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的編輯，旨在為未來(lái)提高水稻抗逆性，獲得早熟品質(zhì)水稻品種提供有力的理論指導(dǎo)。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)由CRISPR基因座和Cas基因2部分組成(圖1)，CRISPR基因座由富含AT結(jié)構(gòu)的300～500 bp的前導(dǎo)序列，其可作為啟動(dòng)子啟動(dòng)CRISPR序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄出pre-crRNA和tracrRNA，包括可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的回文序列的重復(fù)序列 (Repeat) 和被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列(間隔序列)。分別以重復(fù)序列開(kāi)始和結(jié)束，每2個(gè)重復(fù)序列之間穿入一個(gè)間隔序列，因此，重復(fù)序列的數(shù)量始終比間隔序列數(shù)量多1個(gè)。Folk酶功能與Cas蛋白十分相似，通過(guò)特異性位點(diǎn)識(shí)別切斷入侵DNA片段，進(jìn)而降解外來(lái)基因序列。目前已發(fā)現(xiàn)Cas1-Cas12等多個(gè)Cas蛋白[18-20]。

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖[21]Fig.1 Diagram of CRISPR/Cas system structure

1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)類(lèi)型及CRISPR/Cas9原理

CRISPR系統(tǒng)3種類(lèi)型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ[22]，3種類(lèi)型都包括目標(biāo)DNA、靶向crRNA和PAM序列，其中Ⅰ型CRISPR和Ⅲ型CRISPR均需要多種Cas蛋白和crRNA協(xié)同作用才能夠剪切外源DNA，而II型CRISPR僅僅需要Cas9、crRNA、tracrRNA互相協(xié)作就可以發(fā)揮作用，降解外源DNA[23]，操作上具有實(shí)用性。

CRISPR/Cas9隸屬于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)。其原理是反式激活crRNA和CRISPR RNA結(jié)合成雙元聚合體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為單一引導(dǎo)RNA，引導(dǎo)內(nèi)切酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。Cas9蛋白是一個(gè)具有RuvC核酸酶活性結(jié)構(gòu)域及HNH的功能蛋白，通過(guò)識(shí)別外源DNA序列中3至6個(gè)堿基組成的具有原間隔序列的PAM (Proto-spacer adjacent motif)，對(duì)外源雙鏈DNA序列進(jìn)行切割，并引起外源DNA序列的雙鏈發(fā)生斷裂(DSB)[24]，隨后，在其修復(fù)的過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的特定位點(diǎn)進(jìn)行DNA的缺失、插入、堿基突變以及修飾作用。

1.3 CRISPR/Cas9的編輯形式

CRISPR/Cas9的編輯形式有兩種，即基因敲除形式和基因的插入或替換形式。

基因敲除是在目的基因的上下游分別設(shè)計(jì)一個(gè)引導(dǎo)RNA，將Cas9蛋白編碼基因連接到質(zhì)粒上，將連接好的質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，引導(dǎo)gRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則靶向PAM附近的目標(biāo)序列，Cas9蛋白編碼基因使該基因上下游的DNA雙鏈發(fā)生斷裂，但是由于生物體存在DNA損傷修復(fù)應(yīng)答機(jī)制來(lái)保護(hù)自身免受外界不良環(huán)境的侵害，生物體會(huì)將斷裂的上下游兩端的基因序列重新連接起來(lái)，從而成功敲除目標(biāo)基因。

基因的插入或替換，是在基因敲除技術(shù)的基礎(chǔ)上，引入一個(gè)能自我修復(fù)的模板，細(xì)胞就按照符合預(yù)期的模板，在細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中通過(guò)在特定位點(diǎn)突變或引入、插入突變片段，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的突變。其中包括兩種突變形式，一種是單堿基編輯形式。單堿基編輯技術(shù)是指對(duì)目標(biāo)基因片段中的特定位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行替換。其工作原理是在雙鏈不發(fā)生斷裂的情況下，分別利用胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)或經(jīng)改造的腺嘌呤脫氨酶對(duì)靶點(diǎn)上一定范圍內(nèi)的腺嘌呤(A)或胞嘧啶(C)進(jìn)行脫氨基反應(yīng)，經(jīng)過(guò)DNA修復(fù)作用，最終實(shí)現(xiàn)A-G或C-T堿基對(duì)的精準(zhǔn)替換。另一種是直接調(diào)控基因的表達(dá)，在CRISPR/Cas的Ⅱ型系統(tǒng)中將Cas9的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白失去對(duì)DNA的切割活性，但不影響其與DNA的結(jié)合力[25-26]，這種蛋白被命名為dCas9蛋白。若dCas9蛋白能與特定的靶向基因引導(dǎo)RNA(gRNA)在細(xì)胞中共同表達(dá)，則gRNA介導(dǎo)的dCas9蛋白就會(huì)與DNA結(jié)合。若dCas9蛋白結(jié)合到靶基因編碼區(qū)之內(nèi)，就可以阻斷RNA聚合酶的延伸作用；若結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域則會(huì)阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程。

2 CRISPR/Cas9在水稻中的應(yīng)用

2.1 抗病水稻品種選育

稻瘟病是由稻瘟病菌產(chǎn)生的分生孢子侵染水稻，從而引起最具危害性的真菌病害[27]。稻瘟病可以發(fā)生在水稻生長(zhǎng)中任何一個(gè)生育期。傳統(tǒng)水稻抗病育種方法一般是常規(guī)育種，誘變育種和雜交育種是兩個(gè)典型的代表[28]，以人工選擇結(jié)合抗性鑒定為輔助，將抗稻瘟病品種中所攜帶的抗病基因?qū)肽繕?biāo)植株，獲得新的抗稻瘟病品種，此外對(duì)抗病基因分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)同樣用于抗病育種輔助選擇[29]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建水稻突變體，也為培育抗稻瘟病新品種帶來(lái)了新的機(jī)遇[30]。Xu等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以Pita、Pi21和ERF922為靶基因，構(gòu)建共編輯載體，轉(zhuǎn)化長(zhǎng)粒粳稻恢復(fù)系，T0代轉(zhuǎn)基因株系中，Pita、Pi21和ERF922突變頻率分別為75%、85%和65%，突變類(lèi)型多為雙等位突變。篩選出無(wú)轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的T1代能夠穩(wěn)定遺傳給T2代，最終獲得Pi21單突變純合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突變純合株系。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明，與野生型相比，突變株系的抗性顯著提高。Li等[32]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)定向改造水稻性狀，抑制了bsr-d1基因在水稻中的表達(dá)，使水稻植株表現(xiàn)出顯著的抗稻瘟病特性，經(jīng)過(guò)水稻抗病性試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，bsr-d1是水稻稻瘟病的一個(gè)廣譜抗病性基因。

2.2 抗除草劑水稻品種選育

雜草是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，噴除草劑是目前經(jīng)濟(jì)有效的方法，但是除草劑在殺死雜草的同時(shí)也抑制了水稻的生長(zhǎng)[33]，影響水稻生長(zhǎng)發(fā)育的速度以及水稻的產(chǎn)量，所以培育抗除草劑水稻品種對(duì)提高水稻的抗逆性十分重要。目前比較快速、精準(zhǔn)的育種方法是利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)突變除草劑相關(guān)調(diào)控基因，獲得發(fā)生等位變異的除草劑抗性基因進(jìn)而創(chuàng)制具有除草劑抗性的水稻品種。Li等[34]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)替換、插入水稻內(nèi)源性EPSPS基因，得到了含有抗草甘膦基因的水稻材料；Sun等[35]采用CRISPR/Cas9技術(shù)，以堿基插入與替換的方式定向改造水稻基因組序列，在同一載體上將Cas9蛋白、2個(gè)gRNA和用于同源修復(fù)的模板構(gòu)建到其中，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，得到含有不連續(xù)點(diǎn)突變ALS基因的抗除草劑水稻品種。

2.3 高品質(zhì)水稻品種培育

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以提高稻米的品質(zhì)。Li等[36]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，編輯出新的Wx的等位基因。首先設(shè)計(jì)出sgRNA，啟動(dòng)Wxmq包含區(qū)域，在PAM的NGG位點(diǎn)附近有許多鳥(niǎo)嘌呤堿基(G)，因此使用胞嘧啶堿基編輯器進(jìn)行編輯，這種編輯器在水稻中具有較高的編輯效率，通過(guò)編輯接近目標(biāo)產(chǎn)物的氨基酸，進(jìn)而控制稻米的AC含量，生產(chǎn)粘度低的糯米且不影響水稻的產(chǎn)量。周文甲等[37]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻品種綏粳14的香味基因Badh2和抽穗基因Hd2進(jìn)行編輯，結(jié)果表明突變體株型比綏粳14約早成熟13天，并且香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉 (2-AP)的含量也顯著高于野生型綏粳14，進(jìn)而成功獲得早熟且有香味的稻米[38]。邵高能等[39]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻品種中花11的香味基因Badh2進(jìn)行編輯，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因后代測(cè)定其香味物質(zhì)2-AP的含量，野生型2-AP含量為0.07 mg·kg-1，而突變體中2-AP含量為1.2 mg·kg-1。范美英等[40]構(gòu)建靶向水稻直鏈淀粉合成主效基因Wx的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌134進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因后代的直鏈淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，野生型的直鏈淀粉含量19.8%，3個(gè)突變體的直鏈淀粉含量為1.64%、2.14%與1.67%。

2.4 高產(chǎn)水稻品種培育

多個(gè)因素共同決定水稻的高產(chǎn)性狀，有效穗數(shù)、穗粒數(shù)以及千粒重是決定水稻單株產(chǎn)量的主要因素[41-42]。水稻的穗數(shù)與水稻的分蘗能力密切相關(guān)，主要由一級(jí)和二級(jí)分蘗數(shù)共同決定。穗粒數(shù)由稻米結(jié)實(shí)率和每穗穎花數(shù)共同決定，每穗穎花數(shù)由一次枝梗數(shù)和二次枝梗數(shù)決定。千粒重受灌漿率和粒型兩個(gè)因素決定，水稻粒型又由粒寬、粒厚和粒長(zhǎng)3個(gè)因素共同決定。Shen等[43]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)4種不同的水稻品種進(jìn)行基因編輯，研究發(fā)現(xiàn)與野生型相比，gs3和gs3gn1a突變體的粒長(zhǎng)和千粒重均有所增加。Li等[44]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以中花11為試驗(yàn)育種材料，對(duì)GS3、IPA1、Gn1a和DEP1這4個(gè)與產(chǎn)量性狀相關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行定向編輯，發(fā)現(xiàn)帶有g(shù)n1a、gs3和dep1這3種基因的突變體植株的穗數(shù)、粒重和每穗粒數(shù)均增加。由于IPA1突變體基因編輯位點(diǎn)不同，植株表現(xiàn)出兩種表現(xiàn)型，分別為分蘗減少或分蘗增多。Li等[45]根據(jù)育種需求，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以龍粳11為背景，選擇GS3，GS9和Badh2這3個(gè)基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行定向編輯，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得gs3gs9badh2三基因突變體，其后代與野生型龍粳11相比，粒長(zhǎng)增加26.4%～27.0%，單株產(chǎn)量增加10.8%～12.1%，千粒重增加18.3%～41.4%。

2.5 早熟水稻品種選育

我國(guó)的黑龍江省具有供水稻種植的大面積土地[46]。但是由于水稻是熱帶短日照的植物，所以需要對(duì)水稻的品種進(jìn)行改良來(lái)適應(yīng)黑龍江省日照時(shí)間長(zhǎng)和氣溫低等因素的影響，傳統(tǒng)的雜交育種對(duì)水稻品種的選育費(fèi)時(shí)費(fèi)力。Li等[47]利用CRISPR/Cas9技術(shù)，以水稻開(kāi)花抑制因子Hd2、Hd4和Hd5為靶基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9Pubi-H載體，以不同品種為底盤(pán)獲得抽穗期提前的改良品種，較為快速且經(jīng)濟(jì)有效的實(shí)現(xiàn)了水稻新品種的開(kāi)發(fā)，同時(shí)促進(jìn)了南方優(yōu)質(zhì)水稻品種的引進(jìn)，加快了黑龍江省的水稻育種進(jìn)程。此外，Li等[48]通過(guò)對(duì)水稻的花期基因(抽穗基因)進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)Hd2、Hd4和Hd5是主要的開(kāi)花抑制因子，Dth2和Hd18是主要的開(kāi)花促進(jìn)因子，Hd6和Hd16是次要開(kāi)花抑制因子，Hd17是次要的開(kāi)花促進(jìn)因子，只有當(dāng)Hd2和Hd4同時(shí)起作用時(shí)，才能檢測(cè)到它們的有效性。進(jìn)一步證實(shí)了開(kāi)花時(shí)間是影響產(chǎn)量的主要因素，通過(guò)對(duì)花期基因的不同組合可以培養(yǎng)出高產(chǎn)的水稻品種。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻品種改良中得到了廣泛應(yīng)用，針對(duì)不同性狀改良相關(guān)基因總結(jié)如表1，未來(lái)對(duì)基因功能的深入研究將極大的促進(jìn)水稻分子育種的進(jìn)程。

表1 水稻分子育種中應(yīng)用的部分相關(guān)基因匯總Table 1 Summary of some related genes used in molecular breeding of rice

3 展 望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是基因編輯技術(shù)的重大發(fā)現(xiàn)，他可以在特定位點(diǎn)上切割DNA雙鏈，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行自主修復(fù)，如非同源末端連接(NHRJ)或同源重組(HDR)，從而實(shí)現(xiàn)有效的定點(diǎn)基因組編輯[37]。其構(gòu)建簡(jiǎn)便、精度高、周期短、成本低，能夠高效地獲得具有遺傳穩(wěn)定性的材料，為研究基因功能提供材料保障和技術(shù)支持。但目前還存在諸多的問(wèn)題如：脫靶率較高，基因編輯效率較低，堿基具有偏好性，不同基因編輯位點(diǎn)效率不同，限制了基因編輯技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。盡管如此，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)在改良水稻性狀和水稻分子育種上發(fā)揮了作用。而且，我國(guó)科學(xué)家已經(jīng)提出了水稻“2020研究計(jì)劃”和“水稻4D基因組學(xué)研究計(jì)劃”[5]，相信CRISPR/Cas9技術(shù)將不斷運(yùn)用到水稻功能基因組研究中，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)，使水稻的多個(gè)優(yōu)良基因融合表達(dá)成為可能，使水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)不斷提高。也可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)選育抗逆性的水稻品種，使水稻植株具有抗鹽堿脅迫、冷脅迫和低溫脅迫的優(yōu)良性狀，為水稻在更廣范圍內(nèi)種植提供了可能性，對(duì)未來(lái)的水稻分子育種具有深遠(yuǎn)的影響。