楊婷婷，鐘 可，黃芯琦，劉 珂

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科多年生草本植物，是珍稀名貴中藥石斛的來源之一，具有滋陰養(yǎng)腎，清熱生津的功效[1]。主要分布于我國貴州、四川、廣西、云南和海南等省，在貴州主產(chǎn)于赤水市，有“赤水金釵石斛”之稱，為道地藥材[2-3]。金釵石斛化學(xué)成分有生物堿類、多糖、倍半萜、聯(lián)芐、芴酮、酚酸、苯丙素、菲類、木脂素類化合物，多糖是金釵石斛主要活性成分之一[3-4]，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗衰老、抗氧化等作用[5-7]，因此建立金釵石斛多糖有效、簡便、可靠的測定方法有重要的實(shí)踐意義。水提醇沉回流提取法是多糖常用傳統(tǒng)提取方法[8]，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的測定。本實(shí)驗(yàn)選取貴州赤水金釵石斛為實(shí)驗(yàn)對象，通過正交設(shè)計(jì)對提取溶劑加入量、提取溫度、提取時間、顯色劑用量、顯色反應(yīng)時間進(jìn)行考察，優(yōu)選最佳提取條件及顯色條件，確定金釵石斛多糖最佳測定方法。金釵石斛的傳統(tǒng)藥用部位為莖，目前研究也集中在金釵石斛莖，對金釵石斛花和葉的研究相對較少，市場上有金釵石斛花茶作為保健品使用，金釵石斛花和葉的開發(fā)利用具有極其廣闊的市場前景。通過建立的方法對金釵石斛莖、花、葉中的多糖含量進(jìn)行測定，可為金釵石斛的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

實(shí)驗(yàn)所用12批金釵石斛藥材均采自貴州省赤水市，北緯28°30′50″，東經(jīng)105°52′43″，海拔510 m。均為仿野生栽培品，隨機(jī)取樣，樣品來源見表1。經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)鐘可副教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛DendrobiumnobileLindl.。采收后的莖除去雜質(zhì)，用開水略燙或烘軟，再邊搓邊烘曬至葉鞘搓凈，于烘箱60 ℃烘干；金釵石斛葉經(jīng)洗凈處理后，于烘箱60 ℃烘干；將金釵石斛花鮮品低溫烘干。以上樣品均粉碎過3號篩備用。D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201808，僅供國家藥品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)用)，石油醚、無水乙醇、苯酚均為分析純，濃硫酸；實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水。紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，UV-5900)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊公司，GZX-9070MBE)；水浴鍋(上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DRHH-S8)；超聲機(jī)(上海喬躍電子有限公司，JOYN-10A)；十萬分之一天平(日本島津公司，ADW120D)、萬分之一天平(梅特勒-托利多上海有限公司，ME204E)。

表1 樣品來源表

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蒸餾水為空白，分別各精密量取濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖對照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL，置10 mL具塞試管中，加水至1.0 mL，精密加入臨用配制的5%苯酚溶液l mL，再精密加4 mL硫酸，搖勻，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管冰浴冷卻5 min。以蒸餾水為空白，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為A=9.33x+0.0355，r2=0.999。

2.2 紫外檢測波長的確定

精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL于10 mL具塞試管中，精密加入0.5 mL蒸餾水，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸4.0 mL搖勻，置90 ℃水浴中加熱15 min后取出并冰浴5 min后，并以蒸餾水為空白對照，按照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測得葡萄糖對照品最大吸收峰在488 nm波長處。掃描結(jié)果見圖1。

圖1 紫外波長掃描結(jié)果

2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選多糖顯色條件與提取工藝

2.3.1 顯色條件

通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，對苯酚與濃硫酸的加入量和反應(yīng)時間進(jìn)行考察，以吸光度為指標(biāo)確定最佳加入量與反應(yīng)時間。

分別精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL置于10 mL具塞試管中，共9份，精密加入0.5 mL蒸餾水，再加入臨用配置5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸，搖勻，置90 ℃水浴中加熱不同時間后，取出冰浴5 min，于488 nm波長處測定吸光度。因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 顯色條件試驗(yàn)因素

表3 顯色條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

直觀分析可知，各因素對吸光度的影響順序?yàn)锳>C>B，方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B、C均無顯著性影響(P>0.05)。綜合直觀分析及方差分析，選取反應(yīng)條件為A2B1C1時，即苯酚用量為1.0 mL，濃硫酸用量為4 mL，反應(yīng)時間為15 min時，吸光度最高。

2.3.2 提取方法

根據(jù)多糖性能選用水提醇沉法進(jìn)行金釵石斛多糖的提取條件考察，選擇提取溶劑加入量、提取溫度、提取時間3個試驗(yàn)因素，選用L9(34)正交表對金釵石斛進(jìn)行石斛多糖的提取與測定，多糖百分含量作為考察指標(biāo)。

分別稱取金釵石斛莖粉末0.15 g于250 mL圓底燒瓶中，共9份。各加10 mL石油醚回流脫脂1 h，過濾揮干溶媒。藥渣用10 mL 80%乙醇回流除雜 1 h，過濾水浴揮干。藥渣用不同量的蒸餾水按照不同溫度分別提取不同時間，趁熱過濾，定容至250 mL容量瓶中，搖勻，因素水平表見表5。將分別所得金釵石斛供試品溶液，精密吸取0.5 mL于具塞試管中，精密加入0.5 mL蒸餾水，按“2.3.1”所得的最優(yōu)條件反應(yīng)，測得吸光度，分別代入“2.1”項(xiàng)所得的回歸方程，計(jì)算多糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。并以多糖百分含量作為衡量提取效率的客觀指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。方差分析結(jié)果見表7。

表5 提取條件試驗(yàn)因素表

表6 提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 方差分析結(jié)果

由直觀分析可知，各因素對多糖含量的影響順序?yàn)锳>B>C，方差分析結(jié)果表明，A、B、C對提取的多糖濃度無顯著性影響(P>0.05)。結(jié)合直觀分析結(jié)果，最佳反應(yīng)條件為A2B2C3時，即提取溫度為100 ℃，加水量為150 mL，提取時間為2 h的條件下，提取的多糖百分含量最高。

2.4 供試品溶液制備及反應(yīng)條件的確定

稱取樣品粉末0.15 g，置于250 mL圓底瓶中，加10 mL石油醚回流提取1 h，過濾后揮干溶媒；再加入10 mL 80%乙醇回流1 h，過濾水浴揮干，用150 mL的蒸餾水在100 ℃下回流提取2 h，過濾，殘?jiān)谜麴s水洗滌，定容至250 mL容量瓶中，搖勻即得供試品溶液。最佳顯色反應(yīng)條件為：取供試品溶液0.5 mL，置10 mL具塞試管中，再加0.5 mL水補(bǔ)至1 mL。取臨用配置5%苯酚溶液l mL，再精密加濃硫酸4 mL，搖勻，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管冰浴冷卻5 min，在488 nm處測定吸光度。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確量取濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖對照品溶液共6份，按“2.4”項(xiàng)下操作，測定對照品溶液吸光度，RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批金釵石斛樣品6份，每份約0.15 g，按“2.4”項(xiàng)下操作，測定每份樣品吸光度，計(jì)算多糖的含量為20.14%，RSD為1.83%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取金釵石斛樣品粉末0.15g，按“2.4”項(xiàng)下操作，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h測定其吸光度，其RSD為1.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知多糖百分比含量為20.14%的金釵石斛莖粉末6份，每份約0.075 g，分別精密加入與樣品中多糖含量相等的D-無水葡萄糖對照品，按“2.4”項(xiàng)下操作，測定樣品吸光度結(jié)果見表8，其RSD為1.32%，平均回收率為100.68%，均符合要求。

表8 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品中多糖含量測定結(jié)果

按“2.4”項(xiàng)下操作，以蒸餾水為空白，對12批樣品進(jìn)行多糖含量的測定，多糖的百分含量結(jié)果見表9。

表9 樣品多糖含量測定結(jié)果(n=2)

由測定結(jié)果可知，12批樣品中，金釵石斛莖中多糖含量最高，為21.88%，莖、花、葉中多糖含量表現(xiàn)為：莖>葉>花。

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)對金釵石斛多糖提取條件以及顯色條件進(jìn)行考察優(yōu)選。以多糖百分含量為指標(biāo)，確定最優(yōu)提取條件為：加入蒸餾水150 mL沸騰后回流提取2 h；以吸光度為指標(biāo)，最佳顯色條件為：加入苯酚1 mL、濃硫酸4 mL，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出試管后冰浴冷卻5 min。建立的方法操作簡便，易控制，穩(wěn)定性及精確度高，多糖的得率較高。金釵石斛多糖提取方法多種，如曾雨馨等[8]對金釵石斛多糖超聲提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，荊晶等[9]對微波輔助提取法進(jìn)行了優(yōu)化，還有酶解輔助提取法等[10]，但多糖經(jīng)過超聲或微波處理后其糖苷鍵可能會發(fā)生斷裂，酶解輔助提取法中酶反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，成本較高[7]。水提醇沉回流提取法一直是金釵石斛多糖常用的傳統(tǒng)提取方法，苯酚-硫酸法也常用于多糖含量的測定，水提法[11-13]目前亦有提取工藝的優(yōu)化，但對苯酚-硫酸法顯色條件的考察較少。本實(shí)驗(yàn)在對水提法的提取工藝優(yōu)化的同時，對顯色條件也進(jìn)行了優(yōu)選，建立的方法可適用于金釵石斛多糖含量的測定。通過實(shí)驗(yàn)建立的方法，對金釵石斛不同部位多糖的含量進(jìn)行了測定，金釵石斛的傳統(tǒng)藥用部位為莖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了莖中多糖含量高于葉與花，但金釵石斛葉與花中亦有較高的多糖含量，可為金釵石斛的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。