基于表面增強拉曼光譜技術(shù)的多通道同時快速檢測原煙中的多菌靈和甲基硫菌靈

李霞，陳曉水，黃藝偉，楊君，周國俊*，李劍鋒*

(1.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，浙江 杭州 310008；2.廈門大學，福建 廈門 361005)

1 引言

多菌靈和甲基硫菌靈同屬于苯并咪唑類，是具有高效、廣譜、低毒等特點的一類殺菌劑，其原理是通過干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細胞分裂，從而起到殺菌作用，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物真菌病害的防治，同時也是煙草登記使用的農(nóng)藥，用于煙草白粉病、根黑腐病等的防治。甲基硫菌靈在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈。研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈和甲基硫菌靈對哺乳動物有一定的毒害作用[1]，同時煙草在燃燒后仍有部分多菌靈和甲基硫菌靈(2.2～4.5%)能夠保持分子的原有結(jié)構(gòu)，然后通過主流煙氣進入到人體內(nèi)從而對人體健康造成損傷[2]。國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)規(guī)定了煙草中多菌靈的指導性殘留限量。因此，發(fā)展煙草中多菌靈和甲基硫菌靈殘留的檢測分析方法很有必要。

目前，煙草中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有：氣相、液相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3-5]、分光光度法[6]、免疫分析法[7]等。色譜檢測方法具有準確性高，結(jié)果穩(wěn)定、重復性好的優(yōu)點，但往往需要復雜的提取、凈化等前處理過程，周期長、成本高，且需要昂貴的分析儀器，不能滿足大量樣品和現(xiàn)場快速檢測需求?，F(xiàn)有分光光度法簡單易行，但存在靈敏度低、檢測范圍小、易出現(xiàn)假陽、假陰性等問題。免疫分析法是一種有效而快速的方法，但是在獲得高效和高特異性的抗體，以及提高方法檢測靈敏度和檢測限方面，仍待進一步研究和改進。而且，由于多菌靈與甲基硫菌靈的化學性質(zhì)相似，目前的快速檢測方法中經(jīng)常未能解決它們之間的相互干擾問題。因此，尋求成本低、操作簡便、檢測速度快、靈敏度高且兩種農(nóng)藥不相互干擾的方法，具有重要的現(xiàn)實意義。

表面增強拉曼光譜技術(shù)(SERS)是一種具有超高靈敏度的指紋光譜技術(shù)，甚至能夠達到單分子檢測級別，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在食品和農(nóng)產(chǎn)品中危害物質(zhì)、食用添加劑、農(nóng)藥殘留等的快速檢測[8-10]。例如，Alsammarraie等[11]制備了有序陣列的納米金棒活性SERS基底來對果汁和牛奶中的西維因進行檢測，檢測靈敏度可達50 ppb。Chen等[12]將納米粒子粘附在膠帶上來制備SERS基底，從而對蔬菜水果中的甲基對硫磷、福美雙、毒死蜱等農(nóng)藥殘留進行快速檢測。近年來，有關(guān)SERS檢測農(nóng)藥的相關(guān)研究報道日趨增多，SERS技術(shù)在農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測方面突顯出了很大的應(yīng)用價值。例如，吳燕等人[13]以表面增強試劑為基底，利用SERS技術(shù)對茶葉中的多菌靈進行檢測；李俊杰等[14]則利用SERS技術(shù)來對臍橙樣品中不同質(zhì)量分數(shù)噻菌靈標準溶液和基質(zhì)標準液進行拉曼檢測。然而，上述方法都是通過利用SERS技術(shù)來對單一的農(nóng)藥進行檢測，而對煙草樣品中多菌靈和甲基硫菌靈進行同時檢測的方法卻未見相關(guān)報道。基于此，本工作利用便攜式拉曼光譜儀結(jié)合前處理技術(shù)開展煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈的同時快速檢測。通過優(yōu)化前處理條件，使得多菌靈與甲基硫菌靈分離于同一前處理液的不同溶液層中，并用便攜式拉曼光譜儀分別進行檢測。該方法只需結(jié)合簡單前處理便可準確區(qū)分檢測多菌靈與甲基硫菌靈，實現(xiàn)了多通道的快速檢測，檢測靈敏度低、檢測速度快、成本低、操作簡便，適用于現(xiàn)場批量樣品的快速篩查。

2 實驗部分

2.1 試劑

多菌靈(分析標準品，99%)、甲基硫菌靈(分析標準品)、乙腈(分析純)、環(huán)己烷(分析純)、溴化鉀(分析純)、碳酸鉀(分析純)、氯化鈉(分析純)和無水硫酸鎂(分析純)均購于阿拉丁化學試劑有限公司，PSA(N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)購于安捷倫科技有限公司，納米金(粒徑約為55 nm)增強試劑購于廈門賽納斯科技有限公司。

2.2 儀器

便攜式拉曼光譜儀(SHINE-P785N廈門賽納斯科技有限公司，激發(fā)光波長785 nm，最大激光功率為500 mW)，超純水儀(Heal-force，smart-N系列)，高速離心機(湘儀 H2500R)，漩渦振蕩器(VORTEX-GENIE2)。

2.3 實驗方法

2.3.1多菌靈和甲基硫菌靈標準品的拉曼光譜采集

將標準品多菌靈/甲基硫菌靈固體粉末置于干凈的載玻片上壓平后，直接用便攜式拉曼光譜儀進行拉曼光譜采集，獲取拉曼光譜。

采用逐級稀釋的方法，分別配制不同濃度的多菌靈、甲基硫菌靈標準酸性水溶液(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)。

多菌靈的檢測：取100 μL標準液，加入50 μL團聚劑1(1 mol/L碳酸鉀與1 mol/L溴化鉀水溶液按體積比1：4混合)，加入300 μL納米金溶膠，混勻，于便攜式拉曼光譜儀進行圖譜采集；

甲基硫菌靈的檢測：取200 μL標準液，加入50 μL團聚劑2(1 mol/L氯化鈉水溶液)，加入200 μL納米金溶膠，混勻，于便攜式拉曼光譜儀進行圖譜采集；

拉曼檢測條件：激發(fā)光785 nm，激光功率500 mW，掃描時間5000 ms。

2.3.2原煙樣品的前處理

準確稱取磨粉后的原煙空白樣品0.5 g于離心管中，分別添加農(nóng)藥標準品至濃度為0、0.5、1、3、5、7 mg/kg，自然晾干，備用。然后取上述待測樣品0.5 g，加入4 mL有機試劑(乙腈和甲苯按5∶1的比例混合)，將煙絲用有機試劑完全浸濕，然后超聲振蕩2 min，再將有機層取出置于新離心管(離心管中含有0.2 g無水硫酸鎂和0.025 g PSA(N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑)，振蕩、離心，取上層有機層吹干，加入500 μL純水和250 μL環(huán)己烷復溶，離心分層，得到上層多菌靈待測液，下層甲基硫菌靈待測液。

2.3.2SERS檢測

多菌靈的檢測：取100 μL上層待測液于樣品管中，按上述標準品的檢測方法進行檢測，獲得拉曼圖譜，并與多菌靈標準品SERS譜對比；

甲基硫菌靈的檢測：取200 μL下層待測液于樣品管中，按上述標準品的檢測方法進行檢測，獲得拉曼圖譜，并與甲基硫菌靈標準品SERS譜對比。

圖1 煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈的檢測示意圖

3 結(jié)果與討論

3.1 多菌靈、甲基硫菌靈的拉曼光譜分析

由于拉曼光譜的峰位移、強度及拉曼峰形狀反映物質(zhì)化學鍵的振動或轉(zhuǎn)動頻率，是確定化學鍵、官能團的重要依據(jù)，因此通過分子的拉曼光譜可以確定分子的結(jié)構(gòu)。首先，分別采集多菌靈的固體譜和SERS譜，結(jié)果如圖2a所示。由圖可知，多菌靈的固體譜和SERS譜的主要特征峰位置基本相符且與文獻報道的相一致[15]，證明了獲得的SERS譜即為多菌靈的SERS譜。同時，根據(jù)之前的文獻報道在625 cm-1處的多菌靈的拉曼信號，為C-C-C的面內(nèi)彎曲振動，而756 cm-1、940 cm-1則歸屬于苯環(huán)中C-H 的面外彎曲振動，1006 cm-1和1224 cm-1分別歸屬于苯環(huán)的變形振動和N-H 的面內(nèi)彎曲振動，1263 cm-1歸屬于C-N的伸縮振動和C-H面內(nèi)彎曲振動的耦合。同時，上述特征峰峰強較為明顯，可作為SERS光譜檢測多菌靈的判別依據(jù)。

類似的，我們分別對甲基硫菌靈的固體譜和SERS譜進行采集，得到圖2b所示拉曼譜圖，并且甲基硫菌靈的固體譜和SERS亦是相對應(yīng)的。其中在605 cm-1處的拉曼信號，為N-H 的變形振動，在712 cm-1、1039cm-1處的拉曼信號，可歸屬于苯環(huán)上的C-H的變形振動，在961 cm-1和1189 cm-1處的拉曼信號，分別歸屬于苯環(huán)上的C-H的變形振動和分子中-CH3的變形振動，以及-CH3的變形振動，在1259 cm-1處的拉曼信號，則為N-H和C-H的變形振動。因此，上述特征峰可作為SERS光譜檢測甲基硫菌靈的判別依據(jù)。

圖2 (a)多菌靈的分子式、常規(guī)拉曼光譜及其表面增強拉曼光譜；(b)甲基硫菌靈的分子式、常規(guī)拉曼光譜及其表面增強拉曼光譜

圖3所示的拉曼光譜圖為不同濃度(0.2 mg/kg、0.1 mg/kg、0.05 mg/kg、0.01 mg/kg、0 mg/kg)的多菌靈和甲基硫菌靈標準溶液的SERS譜圖，由圖可知，多菌靈和甲基硫菌靈的SERS譜中特征峰峰強隨著濃度的減小而減小，且均在濃度低至0.01 mg/kg時仍能明顯識別。表明，該方法對多菌靈和甲基硫菌靈標準溶液的檢出濃度均可達到0.01 mg/kg。

圖3 (a)不同濃度多菌靈標準溶液SERS譜(b)不同濃度甲基硫菌靈標準溶液SERS譜

3.2 原煙樣品中多菌靈和甲基硫菌靈的檢測

煙草樣品成分的多樣性和復雜性，為表面增強拉曼光譜的檢測帶來一定的干擾。本文首先采用N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(PSA)和無水硫酸鎂作為凈化劑，除去原煙樣品中色素及多酚等的干擾影響(詳細前處理步驟如實驗部分2.3.2所示)。因甲基硫菌靈在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈，故在噴灑過甲基硫菌靈農(nóng)藥的原煙樣品中通常同時存在多菌靈和甲基硫菌靈殘留。為了排除多菌靈和甲基硫菌靈分子在表面增強拉曼基底表面的競爭吸附，我們將多菌靈與甲基硫菌靈分離于同一處理液的不同溶液層中，進而分別得到原煙樣品中多菌靈和甲基硫菌靈的SERS光譜(見圖4)，實現(xiàn)多通道檢測。由圖4a可知，原煙中多菌靈的濃度為1 mg/kg時，625 cm-1、940 cm-1、1006 cm-1、1224 cm-1和1263 cm-1等多菌靈SERS特征峰仍能明顯識別，當濃度低至0.5 mg/kg時，所得的SRES光譜與空白原煙樣品相似。實驗結(jié)果表明，該檢測方法對原煙中多菌靈農(nóng)藥殘留的最低檢出濃度可達到1 mg/kg。相似的，在甲基硫菌靈的加標樣檢測中，當原煙的加標濃度為1 mg/kg時，甲基硫菌靈在605 cm-1、712 cm-1、961 cm-1和1189 cm-1處的特征峰可以明顯識別。當濃度低至0.5 mg/kg時，所得的SRES光譜與空白原煙樣品的相似，說明該檢測方法對原煙中甲基硫菌靈農(nóng)藥殘留的最低檢出濃度可達到1 mg/kg。

圖4 (a)不同濃度的原煙多菌靈提取液的表面增強拉曼光譜；(b)不同濃度的原煙甲基硫菌靈提取液的表面增強拉曼光譜

4 結(jié)論

本文建立了一種利用表面增強拉曼光譜技術(shù)，多通道快速檢測煙草中多菌靈和甲基硫菌靈的方法。該方法首先采用環(huán)己烷和純水將多菌靈與甲基硫菌靈分離于不同的溶液層中，然后以便攜式拉曼光譜儀分別進行檢測，得到相應(yīng)的SERS光譜。該方法前處理簡單，一次前處理便可滿足多菌靈和甲基硫菌靈的同時檢測。測試結(jié)果表明，煙葉中多菌靈和甲基硫菌靈殘留量的檢測靈敏度均為1 mg/kg，檢測時間為10～15 min。為煙葉中痕量農(nóng)藥的檢測提供一種快速、準確、靈敏的分析檢測途徑。煙草中對于農(nóng)殘的檢測不僅僅包括母體化合物，還有其同系物、分解產(chǎn)物等等。同時，農(nóng)殘樣品的最大殘留量不斷下降，新型農(nóng)藥的不斷研制和應(yīng)用，這些都對農(nóng)殘的檢測提出了新的要求與目標。因此，發(fā)展穩(wěn)定性好、靈敏度高、適用范圍廣，而且可以同時進行快速及多元化的檢測技術(shù)以及分析方法是未來的發(fā)展趨勢與難點。而光譜技術(shù)可以實現(xiàn)對樣品的大批量、快速檢測，可以實現(xiàn)對煙草生產(chǎn)和銷售環(huán)節(jié)的快速篩查，因此加快光譜分析技術(shù)的研究與發(fā)展，逐步實現(xiàn)對煙草農(nóng)殘檢測的大批量快速、無損檢測具有重要意義和發(fā)展前景。