姜倩倩，曹 慧，楊延紅，謝 麗

(濰坊學(xué)院 山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濰坊 261061)

作為重要的氣體信號(hào)分子，一氧化氮(NO)和硫化氫(H2S)在植物體生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)中的生理作用受到廣泛關(guān)注。已有研究表明，NO有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程[1-3]和調(diào)控植物抗逆應(yīng)答反應(yīng)[4-6]的多種生理功能。相對于NO，H2S的研究起步較晚，其生理功能近年來才被逐步發(fā)現(xiàn)。研究表明，H2S與NO具有相似的生物學(xué)活性，也可參與多種生長發(fā)育過程，并通過調(diào)節(jié)氣孔、激活抗氧化系統(tǒng)等提高植物的抗逆性[7-9]。并且，前人在不同物種、不同組織或不同脅迫條件下進(jìn)行的試驗(yàn)表明，NO和H2S之間存在多方面的生物學(xué)聯(lián)系，可能涉及多種途徑，共同調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程[10-11]。Zhu等[12]報(bào)道，組合施用外源H2S和NO可進(jìn)一步抑制桃果實(shí)的成熟。解夢潔等[13]發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下外源H2S可緩解內(nèi)源NO含量的上升，H2S和NO交叉互作提高了大白菜的耐高溫能力。Peng等[14]提出，H2S可能作為NO的下游信號(hào)分子參與玉米幼苗對水澇低氧脅迫的響應(yīng)。

鎘(Cd)是果園土壤重金屬污染的主要來源之一，其毒性強(qiáng)、難分解，是造成果樹傷害的非生物脅迫；鎘具有極大的遷移性，對果品安全和人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[15]。平邑甜茶(Malushupehensis(Pamp) Rehd. varpinyiensisJiang)是生產(chǎn)上常用的蘋果砧木，鎘脅迫嚴(yán)重影響其生長[16]。外源NO供體硝普鈉(SNP)和H2S供體硫氫化鈉(NaHS)均能增強(qiáng)平邑甜茶對鎘的耐受能力[16-17]。李燕歌[18]通過研究平邑甜茶根系鎘離子流發(fā)現(xiàn)，NO和H2S組合處理可減少鎘離子吸收，從而緩解鎘對植株的傷害。但二者在蘋果對鎘脅迫中的共同響應(yīng)關(guān)系尚不明確。本研究以平邑甜茶幼苗為材料，利用外源供體和抑制劑處理的方法，檢測鎘脅迫下平邑甜茶幼苗的生長情況，測定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)、根系細(xì)胞死亡數(shù)量、呼吸速率、呼吸關(guān)鍵酶活性、抗氧化系統(tǒng)活性等變化，探討二者在調(diào)控平邑甜茶抗鎘能力時(shí)的相互關(guān)系，以期為果樹抗逆應(yīng)用研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

硝普鈉(SNP)、硫氫化鈉(NaHS)、H2S清除劑亞?；撬?HT)和NO清除劑Carboxy-PTIO鹽(c-PTIO)均購于美國Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

平邑甜茶種子經(jīng)精選、消毒、洗凈浸泡后，4 ℃環(huán)境下濕砂中層積，待種子露白后，播種于裝有基質(zhì)(草炭、珍珠巖和蛭石按照體積比3∶1∶1配制)的營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)至5～6片真葉；選取生長基本一致的幼苗，置于Hoagland營養(yǎng)液(pH值6.5)中進(jìn)行水培，培養(yǎng)至12～13片真葉時(shí)，分別進(jìn)行以下8個(gè)試驗(yàn)處理：對照(CK)：正常Hoagland營養(yǎng)液；Cd(T1)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4；Cd+NaHS(T2)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+200 μmol/L NaHS；Cd+NaHS+HT(T3)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+200 μmol/L NaHS+100 μmol/L HT；Cd+NaHS+c-PTIO(T4)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+200 μmol/L NaHS+100 μmol/L c-PTIO；Cd+SNP(T5)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+100 μmol/L SNP；Cd+SNP+c-PTIO(T6)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+100 μmol/L SNP+100 μmol/L c-PTIO；Cd+SNP+HT(T7)：正常Hoagland營養(yǎng)液中添加200 μmol/L CdSO4+100 μmol/L SNP+100 μmol/L HT。

試驗(yàn)時(shí)，每個(gè)處理先用除CdSO4之外的其他試劑預(yù)處理24 h，然后向培養(yǎng)瓶中加 CdSO4溶液使其終質(zhì)量濃度為 200 μmol/L。每處理5株幼苗，重復(fù)3次，處理后第2天取葉片進(jìn)行葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)測定，取根系進(jìn)行細(xì)胞死亡數(shù)量、呼吸速率和抗氧化酶活性等指標(biāo)測定；處理后第8天取幼苗植株測定株高、莖粗、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量等生物量指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 植株生長指標(biāo) 參考曹慧等[16]的方法測定株高、莖粗以及地上部和地下部鮮質(zhì)量、干質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素含量 參照趙世杰等[19]的方法，采用乙醇萃取平邑甜茶幼苗第7～8片真葉的葉綠素，用分光光度計(jì)比色法測定。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 采用Imaging-PAM調(diào)制熒光成像系統(tǒng) (德國，Walz)，檢測獲得平邑甜茶幼苗第8片真葉的葉綠素?zé)晒鈪?shù)：潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)。

1.3.4 根系細(xì)胞死亡數(shù)量 參照Steffens等[20]的方法，稱取1 g生長根，用10 g/L的伊文思藍(lán)溶液染色30 min，隨后用純凈水洗凈根系表面色素后置于甲醇中萃取，用分光光度計(jì)測定萃取液在600 nm處的吸光度(A600)，用A600值反映根系細(xì)胞死亡數(shù)量，A600值越大，說明根系細(xì)胞死亡數(shù)量越多，否則越少。

1.3.6 根系呼吸速率 采用Chlorolab2+液相氧電極自動(dòng)測定系統(tǒng)(英國，Hansatech)測定。

1.3.7 根系呼吸相關(guān)酶活性 蘋果酸脫氫酶(MDH)、磷酸果糖激酶(PFK)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS和Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響

H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響如表1所示。由表1可知，與對照(CK)相比，重金屬Cd脅迫顯著抑制平邑甜茶幼苗生長。Cd脅迫下，分別添加外源H2S供體NaHS和NO供體SNP均緩解了Cd對平邑甜茶幼苗生長的抑制，其株高、莖粗和植株干、鮮質(zhì)量均顯著增加，二者緩解Cd脅迫的水平相當(dāng)；Cd脅迫下，添加NaHS的同時(shí)添加H2S清除劑HT或NO清除劑c-PTIO，抑制了外源H2S對平邑甜茶幼苗生長的緩解作用，平邑甜茶株高、莖粗、植株干、鮮質(zhì)量均比Cd脅迫下僅添加NaHS處理的顯著下降，與單獨(dú)Cd脅迫處理的抑制水平相當(dāng)；Cd脅迫下添加SNP的同時(shí)添加c-PTIO，抑制了SNP對Cd傷害的保護(hù)效應(yīng)；Cd+SNP+HT(T7)處理平邑甜茶幼苗的長勢與Cd+SNP(T5)處理差異不顯著，但明顯好于單獨(dú)Cd脅迫處理(T1)。

表1 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響Table 1 Effects of H2S and NO on growth of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.2 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫處理(T1)平邑甜茶幼苗葉綠素含量顯著降低。與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，添加NaHS、SNP均能顯著提高平邑甜茶幼苗葉片葉綠素含量，葉綠素a和葉綠素b含量分別增加了22.84%，29.66%和16.29%，29.52%；Cd+NaHS處理時(shí)，添加H2S清除劑HT或NO清除劑c-PTIO均抑制了Cd脅迫下NaHS對葉綠素的保護(hù)，葉綠素a和葉綠素b含量與單獨(dú)Cd處理差異不顯著；Cd+SNP處理，添加NO清除劑c-PTIO，抑制了Cd脅迫下SNP對葉綠素的保護(hù)；但添加H2S清除劑HT對Cd脅迫下SNP的作用幾乎無影響，葉綠素a和葉綠素b含量比單獨(dú)Cd脅迫處理顯著增加了19.63%和26.82%。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同 Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at the level of P=0.05, the same below圖1 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of H2S and NO on chlorophyll content of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.3 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h3>

H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懭鐖D2所示。由圖2可知，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫下平邑甜茶幼苗潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和實(shí)際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)均顯著下降，分別降低了57.51%，31.99%和55.36%。Cd脅迫下分別添加外源NaHS或SNP均明顯抑制了平邑甜茶幼苗Fv/Fo、Fv/Fm和ΦPSⅡ的降低，二者之間差異不顯著。Cd+NaHS處理時(shí)，添加HT或c-PTIO均顯著抑制了Cd脅迫下NaHS對平邑甜茶葉片光合電子傳遞性能的保護(hù)作用。Cd+SNP處理時(shí)，添加c-PTIO也抑制了SNP的緩解作用；但添加HT對Cd脅迫下SNP的作用幾乎無影響，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm和ΦPSⅡ比單獨(dú)Cd脅迫處理分別顯著提高了25.22%，18.02%和30.66%。

圖2 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊慒ig.2 Effect of H2S and NO on chlorophyll fluorescence characteristics of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.4 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系細(xì)胞死亡的影響

由圖3可知，與CK相比，Cd處理導(dǎo)致平邑甜茶幼苗根系嚴(yán)重?fù)p傷。外源添加NaHS或SNP可顯著降低Cd脅迫下根系細(xì)胞的死亡數(shù)量，根系細(xì)胞死亡數(shù)量比單獨(dú)Cd脅迫處理分別減少了44.63%和33.64%。

圖3 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系細(xì)胞死亡數(shù)量的影響Fig.3 Effect of H2S and NO on cell death quantity in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

由圖3還可知，在Cd+NaHS處理時(shí)分別添加HT和c-PTIO，或Cd+SNP處理時(shí)添加c-PTIO，均可明顯促進(jìn)根系細(xì)胞死亡，抑制NaHS或SNP 對根系鎘損傷的緩解作用，根系細(xì)胞死亡數(shù)量分別比單獨(dú)Cd脅迫處理減少了13.96%，15.43%和21.33%。Cd+SNP處理時(shí)添加HT，SNP對根系鎘損傷的保護(hù)效應(yīng)未受影響，根系細(xì)胞死亡數(shù)量比單獨(dú)Cd脅迫處理減少了32.38%。

2.5 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系呼吸代謝的影響

植物根系的呼吸作用與植物的能量代謝和物質(zhì)吸收運(yùn)輸密切相關(guān)。如圖4-A所示，與CK相比，Cd脅迫處理平邑甜茶幼苗根系呼吸速率顯著降低了44.21%。Cd脅迫下添加NaHS或SNP均顯著提高了根系呼吸速率，分別比單獨(dú)Cd脅迫處理增加了46.33%和44.93%，但二者之間差異不顯著。而在Cd脅迫下進(jìn)行NaHS或SNP處理時(shí)，添加NO清除劑c-PTIO，可顯著抑制NaHS和SNP的緩解效用；添加H2S清除劑HT也顯著抑制了Cd脅迫下NaHS對根系呼吸速率的保護(hù)，根系呼吸速率比單獨(dú)Cd脅迫處理降低了1.78%，而HT對SNP的保護(hù)效應(yīng)影響無顯著變化。

生物體內(nèi)有多條呼吸代謝途徑，MDH、PFK和G-6-PDH是調(diào)節(jié)各呼吸途徑呼吸速率的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響呼吸速率的強(qiáng)弱。

由圖4-B和4-C可知，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫處理下平邑甜茶幼苗根系PFK、MDH活性均顯著下降，分別比CK處理降低了18.19%和37.14%；添加NaHS或SNP處理PFK、MDH活性分別較單獨(dú)Cd脅迫處理提高了11.29%，27.17%和13.70%，17.48%。與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，Cd+NaHS+c-PTIO處理PFK、MDH活性無顯著變化；而Cd+SNP+c-PTIO處理MDH活性無顯著變化，PFK活性顯著降低了12.71%；Cd+NaHS+HT處理PEK活性無顯著變化，而MDH活性顯著提高12.54%，比Cd+NaHS處理降低了7.81%，但二者之間差異不顯著。Cd+SNP+HT處理PFK、MDH活性與單獨(dú)Cd處理相比分別提高了6.95%和14.64%，與Cd+SNP處理相比均無顯著變化。

由圖4-D可知，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫處理G-6-PDH活性顯著提高了19.59%。Cd+NaHS和Cd+SNP處理G-6-PDH活性較單獨(dú)Cd脅迫處理分別降低了13.82%和16.98%。Cd脅迫下進(jìn)行NaHS或SNP處理時(shí)，添加NO清除劑c-PTIO或H2S清除劑HT與否，G-6-PDH活性均無顯著變化。

圖4 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系呼吸速率和關(guān)鍵酶活性的影響Fig.4 Effect of H2S and NO on respiration rate and key enzyme activities in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.6 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

由圖5還可知，各處理平邑甜茶根系H2O2含量變化與超氧陰離子產(chǎn)生速率的變化趨勢基本一致。單獨(dú)Cd脅迫處理根系H2O2含量較高；Cd+NaHS和Cd+SNP處理H2O2含量分別比單獨(dú)Cd處理顯著降低了27.49%和26.66%，但二者之間差異不顯著；Cd+NaHS+HT、Cd+NaHS+c-PTIO處理H2O2含量比Cd+NaHS處理分別顯著提高了23.96%和20.38%。Cd+SNP+c-PTIO處理H2O2含量比Cd+ SNP處理顯著提高了22.52%，而Cd+SNP+HT處理H2O2含量與Cd+ SNP處理相比無顯著變化。Cd脅迫下用NaHS或SNP處理時(shí)，添加了HT或c-PTIO后根系H2O2含量均顯著低于單獨(dú)Cd脅迫處理。

圖5 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響Fig.5 Effect of H2S and NO on production rate and H2O2 content in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.7 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影響

如圖6所示，與CK相比，單獨(dú)Cd脅迫致使平邑甜茶根系SOD、POD和CAT活性均顯著升高，分別比CK提高了74.73%，300.7%和77.06%；與單獨(dú)Cd脅迫處理相比，Cd+NaHS或Cd+SNP處理平邑甜茶根系SOD、POD和CAT活性分別顯著提高了41.52%，82.22%，49.29和34.87%，98.90%，78.72%。在Cd+NaHS處理時(shí)添加HT和c-PTIO，或Cd+SNP處理時(shí)添加c-PTIO，均可顯著降低平邑甜茶根系SOD、POD和CAT活性。Cd+SNP+HT處理平邑甜茶根系SOD活性較Cd+SNP處理略有下降，但二者之間差異不顯著，POD和CAT活性分別較Cd+SNP處理顯著降低了19.43%和17.30%。

圖6 H2S和NO對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系SOD、POD、CAT活性的影響Fig.6 Effect of H2S and NO on SOD,POD and CAT activities in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

3 討 論

鎘脅迫會(huì)影響植物根系活動(dòng)，導(dǎo)致葉片失水，進(jìn)而影響光合色素生成，加速葉綠素分解，最終植株黃化、生長緩慢，直至死亡[16]。本試驗(yàn)中，用200 μmol/L CdSO4脅迫2 d后，平邑甜茶幼苗葉片葉綠素含量及光合能力均下降，根系細(xì)胞大量死亡，幼苗生長受到抑制。作為氣體信號(hào)分子，H2S與NO可以通過調(diào)節(jié)氣孔、激活抗氧化系統(tǒng)等提高植物的抗逆性[7-9]，單獨(dú)施用生理濃度的外源H2S和NO都可緩解植物的非生物脅迫傷害[6,10]。在鎘脅迫條件下，H2S信號(hào)可激活植物體內(nèi)的抗氧化酶促和非酶促系統(tǒng)，以清除細(xì)胞內(nèi)H2O2。H2S對Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)和液泡區(qū)式化的調(diào)節(jié)，降低了體內(nèi)Cd2+的濃度，通過抑制鎘離子內(nèi)流降低擬南芥體內(nèi)的鎘毒性[22]。本研究結(jié)果表明，外源添加H2S或NO均可減輕鎘脅迫對平邑甜茶幼苗的損傷和生長抑制作用。這表明，氣體信號(hào)分子H2S和NO參與了平邑甜茶幼苗對重金屬鎘的脅迫響應(yīng)。

根系呼吸是植物地下部代謝的中心，與根系功能和脅迫響應(yīng)等密切相關(guān)。植物體內(nèi)存在多條呼吸代謝途徑，其中，以糖酵解途徑(EMP)進(jìn)入三羧酸循環(huán)(EMP-TCA)途徑為主，為植物提供生長發(fā)育所需的能量和物質(zhì)[21,24]。當(dāng)EMP-TCA途徑受阻時(shí), 另一重要途徑戊糖磷酸途徑(PPP)可代替正常的有氧呼吸，協(xié)調(diào)植物對環(huán)境的適應(yīng)，其與各種逆境脅迫密切相關(guān)[25]。在植物呼吸代謝中，磷酸果糖激酶(PFK)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)分別作為調(diào)控EMP途徑、TCA途徑和PPP途徑的關(guān)鍵酶，其活性與呼吸速率高低密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，與CK相比，Cd脅迫導(dǎo)致PFK、MDH活性顯著下降了18.19%和37.14%，G-6-PDH活性則顯著升高了19.59%，說明鎘脅迫導(dǎo)致平邑甜茶根系基礎(chǔ)呼吸途徑發(fā)生改變，EMP-TCA途徑受阻，而PPP途徑發(fā)揮重要作用，以響應(yīng)鎘脅迫。Cd脅迫下添加外源H2S和NO時(shí)，PFK、MDH活性分別較單獨(dú)Cd脅迫提高了11.29%，27.17%和13.70%，17.48%；G-6-PDH活性分別降低了13.82%和16.98%。這說明H2S和NO減輕了鎘脅迫對平邑甜茶幼苗主要呼吸途徑的抑制，在一定程度上使呼吸代謝恢復(fù)正常，提高平邑甜茶幼苗對鎘脅迫的適應(yīng)能力。

解夢潔等[13]研究表明，H2S和NO交互作用參與大白菜抵御高溫脅迫，且H2S對高溫脅迫的響應(yīng)優(yōu)先于NO，外源H2S會(huì)抑制NO的產(chǎn)生，而NO對H2S的含量變化無明顯影響。而Shi等[26]指出，草坪草狗牙根在響應(yīng)鎘脅迫時(shí)，NO的產(chǎn)生先于H2S，NO會(huì)通過上調(diào)H2S的合成增強(qiáng)植物的抗鎘性。本研究中，施用NO清除劑c-PTIO能抑制外源H2S和NO對平邑甜茶幼苗鎘損傷的緩解；施用H2S清除劑HT僅能抑制外源H2S對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗的保護(hù)效應(yīng)，而對外源NO的作用基本無影響。這表明平邑甜茶幼苗遭受鎘脅迫時(shí)H2S和NO有交互作用，H2S的產(chǎn)生先于NO，這與李燕歌[18]的研究結(jié)果相吻合。由此推測，氣體信號(hào)分子H2S和NO并不是簡單的上下游關(guān)系，二者的相互作用在不同植物中的響應(yīng)機(jī)制有差異。