宋 玄,王澤華,單 雙,張永軍,王山寧,*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所,北京 100097;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京 100193)

白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis，又名花曲柳窄吉丁、梣小吉丁，屬鞘翅目(Coleoptera)吉丁科(Buprestidae)，主要為害木犀科(Oleaceae)白蠟屬Fraxinus樹木(魏霞等,2004;趙同海等,2005)。該蟲原產(chǎn)于東亞，自2002年傳入北美，因其隱蔽性強(qiáng)，防治極為困難，迄今已造成北美地區(qū)數(shù)百萬白蠟樹死亡，嚴(yán)重威脅多種白蠟屬樹木的生存(Anulewiczetal.,2008;Herms and McCullough,2014;Wendyetal.,2018)。氣味分子介導(dǎo)的該蟲寄主識(shí)別和種間通訊已經(jīng)被證實(shí)。白蠟葉片揮發(fā)物中至少發(fā)現(xiàn)16種化合物能誘發(fā)成蟲觸角電位反應(yīng)，如順-3-己烯醇、乙酸順-3-己烯酯、反-2-己烯醛等，其中順-3-己烯醇對(duì)雄蟲有很強(qiáng)的誘集作用(Rodriguez-Saonaetal.,2006)。白蠟樹皮揮發(fā)物中的6種倍半萜，包括α-蒎烯、α-可巴烯、α-葎草烯等均對(duì)成蟲具有觸角活性，含有這些化合物的兩種植物油manuka oil和phoebe oil在野外對(duì)成蟲具有誘捕效果(Crooketal.,2008b)。白蠟窄吉丁雌蟲釋放的具有觸角活性的化合物(3Z)-lactone能夠吸引雄性，被認(rèn)為是該蟲的性信息素組分(Barteltetal.,2007)。目前已經(jīng)根據(jù)寄主植物揮發(fā)物和性信息素研制開發(fā)了白蠟窄吉丁的多種引誘劑(Crooketal.,2008b;Silketal.,2015,2019;Katieetal.,2020)。但是，人們對(duì)該蟲的化學(xué)通訊分子機(jī)制還不太了解。

昆蟲感知外界化學(xué)信息的過程中，氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(odorant receptors,ORs)和離子型受體(ionotropic receptors,IRs)等多種嗅覺相關(guān)蛋白發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Clyneetal.,1999;Coutoetal.,2005;Bentonetal.,2009;Leal,2013;Joseph and Carlson,2015)。昆蟲氣味結(jié)合蛋白(OBPs)是一類小分子的水溶性蛋白，此類蛋白廣泛分布在昆蟲的各類感受器官中(Pelosietal.,2018)。在昆蟲觸角中，OBP蛋白由位于化學(xué)感受器下方的輔助細(xì)胞合成，隨后被大量分泌到感器腔的淋巴液中，參與結(jié)合、溶解、運(yùn)輸疏水性氣味分子，在昆蟲感受外界環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)過程中發(fā)揮重要功能(Vogt and Riddiford,1981;Angelietal.,1999;Leal,2013;Pelosietal.,2014,2018)。

昆蟲氣味結(jié)合蛋白廣泛存在不同昆蟲中，參與昆蟲信息化合物的識(shí)別。在鞘翅目昆蟲大黑鰓金龜Holotrichiaoblita觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出29個(gè)OBP基因，其中HoblOBP9和HoblOBP13分別參與大黑鰓金龜雌蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物苯乙醇和反-2-苯烯醇的識(shí)別(Yinetal.,2019)。松墨天牛MonochamusalternatusMaltOBP1,MaltOBP3和MaltOBP5能夠與部分寄主植物揮發(fā)物結(jié)合，它們可能在松墨天牛的寄主選擇過程發(fā)揮功能(Gao and Wang,2015;Zhangetal.,2020)。蘋果小吉丁AgrilusmaliAmalOBP3在雌雄觸角中高表達(dá)，能夠結(jié)合醇類和醛類等多種寄主揮發(fā)物(Cuietal.,2018)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)白蠟窄吉丁基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，鑒定了11個(gè)氣味結(jié)合蛋白，組織表達(dá)譜結(jié)果表明AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3在雌雄成蟲觸角特異表達(dá)，熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明AplaOBP1和AplaOBP2能夠與多種寄主揮發(fā)物結(jié)合，它們?cè)诎紫炚〖闹髯R(shí)別中發(fā)揮功能(Wangetal.,2020;宋玄等,未發(fā)表數(shù)據(jù))，推測AplaOBP3同樣在白蠟窄吉丁嗅覺感受行為中發(fā)揮功能。

為深入解析氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受中的功能，本研究進(jìn)一步對(duì)AplaOBP3蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，利用免疫組化技術(shù)檢測了該蛋白的亞細(xì)胞定位，通過熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)AplaOBP3重組蛋白與58種化合物的結(jié)合特性進(jìn)行了分析，并對(duì)3種氣味結(jié)合蛋白(AplaOBP1-3)的表達(dá)及配體結(jié)合特性進(jìn)行比較，以期為闡明白蠟窄吉丁氣味結(jié)合蛋白參與寄主識(shí)別的化學(xué)感受機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

于北京郊區(qū)白蠟林地，將受害白蠟樹截成約50 cm的木段帶回室內(nèi)，置于養(yǎng)蟲籠罩內(nèi)待白蠟窄吉丁成蟲自然羽化，成蟲羽化后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒內(nèi)，飼喂白蠟樹葉片進(jìn)行飼養(yǎng)，成蟲飼養(yǎng)條件為溫度25±0.5℃，相對(duì)濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 AplaOBP3重組蛋白的表達(dá)與純化

利用SignalP 3.0 Server在線程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白(GenBank登錄號(hào):XM_025977151.1)信號(hào)肽序列，去信號(hào)肽后的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行化學(xué)合成并克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)。將單克隆陽性菌株接種于含100 mg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，在18℃ 160 r/min搖床中誘導(dǎo)16 h。超聲破碎后分別收集上清及包涵體。參照Prestwich (1993)的方法，進(jìn)行包涵體的復(fù)性和重折疊，即用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)沖洗包涵體，隨后將包涵體溶解在6 mol/L的鹽酸胍中，經(jīng)氧化還原處理后獲得可溶性蛋白。利用親和層析鎳柱純化，純化的重組蛋白經(jīng)腸激酶25℃孵育過夜處理后，再次用親和層析鎳柱純化，超濾濃縮后得到無His標(biāo)簽的AplaOBP3重組蛋白。通過4%～20% SDS-PAGE電泳檢測各階段目的蛋白的表達(dá)及純化情況。純化的目的蛋白送北京信諾晶科生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體。

1.3 Western blot檢測

收集白蠟窄吉丁成蟲觸角，使用組織蛋白抽提試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)提取觸角組織粗蛋白。采用4%-20% SDS-PAGE電泳對(duì)觸角組織粗蛋白和純化的重組蛋白AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3進(jìn)行分離，其中AplaOBP1和AplaOBP2重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)獲得(Wangetal.,2020;宋玄等,數(shù)據(jù)未發(fā)表)。采用One Step Western Kit HRP(Rabbit)(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)進(jìn)行Western blot，檢測AplaOBP3多克隆抗體的特異性；通過高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)進(jìn)行發(fā)光檢測；使用化學(xué)發(fā)光成像分析儀(AI680,GE,美國)進(jìn)行曝光及圖像采集。

1.4 免疫組織化學(xué)定位檢測

1.3節(jié)收集的白蠟窄吉丁觸角樣品送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所電鏡室進(jìn)行固定、制樣包埋、切片、免疫染色及電鏡觀察。1.2節(jié)制備的AplaOBP3多克隆抗體按照1∶5 000 (v/v)稀釋使用，以未免疫的兔血清代替抗體作為陰性對(duì)照，詳細(xì)步驟參照本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道(Wangetal.,2020)，檢測AplaOBP3在白蠟窄吉丁觸角感器中的表達(dá)定位。

1.5 熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

為了與前期報(bào)道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的配體結(jié)合特性進(jìn)行比較，本研究選取了58種相同的化合物作為候選配體(表1)，其中27種揮發(fā)物的選擇是來自于白蠟窄吉丁為害的寄主植物。使用F-380熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)進(jìn)行熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，激發(fā)波長337 nm，掃描發(fā)射波長范圍370～550 nm。采用N-苯基-1-萘胺 (N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作為熒光探針。候選配體和熒光探針用色譜級(jí)甲醇溶解，配制成濃度為1 mmol/L的工作液。于PBS緩沖液(pH 7.4)中加入AplaOBP3重組蛋白，終濃度為2 μmol/L，再加入1-NPN，使探針濃度從2 μmol/L遞增至12 μmol/L，重復(fù)3次，測定熒光強(qiáng)度變化，計(jì)算AplaOBP3與探針的結(jié)合能力曲線和解離常數(shù)。將AplaOBP3加入PBS緩沖液(pH 7.4)中，終濃度為2 μmol/L，加入相同濃度的1-NPN，記錄熒光強(qiáng)度，隨后加入待測配體，濃度從2 μmol/L開始遞增至20 μmol/L，記錄熒光強(qiáng)度變化，重復(fù)3次。計(jì)算得出使熒光強(qiáng)度降低一半時(shí)的配體濃度，即IC50值。利用下列公式計(jì)算出配體解離常數(shù)KD∶KD=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN)，[1-NPN]是未結(jié)合的1-NPN的濃度，K1-NPN為AplaOBP3與1-NPN的解離常數(shù)(Guetal.,2011)。

2 結(jié)果

2.1 AplaOBP3的重組表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果表明，氣味結(jié)合蛋白AplaOBP3重組蛋白在包涵體中表達(dá)(圖1)，對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，通過親和層析獲得重組蛋白，腸激酶切去His標(biāo)簽后得到分子量約為14 kD的目的蛋白，用于抗體制備及競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

2.2 Western blot檢測

Western blot檢測了AplaOBP3多克隆抗體與白蠟窄吉丁觸角粗蛋白以及純化的AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3重組蛋白的結(jié)合特異性，結(jié)果表明，僅在觸角粗蛋白和AplaOBP3蛋白樣品中檢測到分子量約14 kD特異性條帶，表明AplaOBP3多克隆抗體僅與AplaOBP3蛋白結(jié)合，可以滿足后續(xù)的免疫組織化學(xué)檢測(圖2)。

2.3 AplaOBP3在觸角中的表達(dá)定位

免疫組化結(jié)果表明，黑色膠體金顆粒標(biāo)記的AplaOBP3蛋白分布在白蠟窄吉丁錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器下方(圖3)。錐形感器類型Ⅰ的感器壁具有明顯的微孔，是嗅覺感受器，推測AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受過程中發(fā)揮著重要的作用。

圖1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;1:未誘導(dǎo)的大腸桿菌菌體Non-induced Escherichia coli;2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)16 h的大腸桿菌菌體E.coli induced by 1 mmol/L IPTG for 16 h;3:上清液Supernatant;4:包涵體蛋白Inclusion body protein;5:帶His標(biāo)簽重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 with His-tag;6:無His標(biāo)簽的重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 without His-tag.

圖2 白蠟窄吉丁AplaOBP3多克隆抗體的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)檢測Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the polyclonal antibody against AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;1:提取自白蠟窄吉丁的觸角粗蛋白Crude protein extracted from antennae of A.planipennis;2:AplaOBP1重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP1;3:AplaOBP2重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP2;4:AplaOBP3重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP3.

圖3 AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁觸角的表達(dá)定位Fig.3 Expression localization of AplaOBP3 protein in the antenna of Agrilus planipennisA:顯示黑色顆粒標(biāo)記的AplaOBP3蛋白分布在錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器基部的縱切圖Longitudinal section showing that AplaOBP3 proteins labeled with black spots are distributed in the hair lumen and the base of the sensilla basiconica type I;B:錐形感器類型Ⅰ的感器腔Hair lumen of the sensilla basiconica type I;C:錐形感器類型Ⅰ的感器基部Base of the sensilla basiconica type I；D:顯示AplaOBP3蛋白在錐形感器類型Ⅰ的感器腔中表達(dá)的橫切圖,箭頭表示感器上的壁孔Cross section showing the expression of AplaOBP3 protein at the hair lumen of sensilla basiconica type I,arrows indicating the wall pores on the sensillum;E:顯示未免疫的兔血清陰性對(duì)照未被標(biāo)記的縱切圖Longitudinal section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled;F:顯示未免疫的兔血清陰性對(duì)照未被標(biāo)記的橫切圖Cross section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled.

2.4 AplaOBP3重組蛋白配體結(jié)合特征

熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AplaOBP3與熒光探針1-NPN的解離常數(shù)為0.4 μmol/L，1-NPN和重組蛋白AplaOBP3的結(jié)合曲線及Scatchard方程見圖4 (A)。AplaOBP3與候選配體的結(jié)合曲線(圖4:B)和解離常數(shù)(表1)可以看出，在58種氣味揮發(fā)物中，AplaOBP3可以特異性結(jié)合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、β-紫羅蘭酮和羅勒烯，AplaOBP3與β-紫羅蘭酮結(jié)合能力最強(qiáng)，解離常數(shù)為1.72 μmol/L，與苯甲醛的結(jié)合能力次之，其解離常數(shù)為4.03 μmol/L，與反-2-己烯醛的結(jié)合能力最弱，其解離常數(shù)為6.20 μmol/L。

2.5 AplaOBP3與AplaOBP1和AplaOBP2的表達(dá)及配體結(jié)合特性比較

AplaOBP3與前期報(bào)道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的表達(dá)及配體結(jié)合特性(表2)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，AplaOBP3與AplaOBP2具有相似的表達(dá)及配體結(jié)合特性，但與AplaOBP1的明顯不同。AplaOBP3和AplaOBP2均在觸角錐形感器類型I表達(dá)，而AplaOBP1在錐形感器類型I和III均表達(dá)。在58種候選配體中，共有15種化合物至少與一種AplaOBP重組蛋白結(jié)合。與AplaOBP3結(jié)合的5種配體中，其中4種(反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮)也與AplaOBP2結(jié)合，而與AplaOBP1結(jié)合的多數(shù)配體與AplaOBP3和AplaOBP2不結(jié)合，其中僅羅勒烯與AplaOBP3結(jié)合。

圖4 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的結(jié)合特征Fig.4 Binding properties of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisA:1-NPN和AplaOBP3的結(jié)合曲線及Scatchard方程Binding curve and Scatchard plot of 1-NPN to AplaOBP3;B:AplaOBP3與候選配體的結(jié)合曲線Binding curves of AplaOBP3 to candidate ligands.

3 討論

白蠟窄吉丁觸角上分布有3種多孔的錐形感器，在雌雄成蟲感受外界嗅覺刺激信號(hào)中發(fā)揮著重要的作用(Crooketal.,2008a)。免疫組化結(jié)果表明，AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁錐形感器類型I中表達(dá)，推測AplaOBP3可能與嗅覺感受有關(guān)。本研究選擇58種揮發(fā)物作為候選配體，其中包括27種寄主揮發(fā)物，AplaOBP3重組蛋白能與多種揮發(fā)物結(jié)合，其中與AplaOBP3重組蛋白結(jié)合的5種配體中，3種配體即羅勒烯、反-2-己烯醛和4′-乙基苯乙酮屬于白蠟窄吉丁寄主植物白蠟樹的葉片揮發(fā)物，它們可以引起白蠟窄吉丁EAG反應(yīng)，并且反-2-己烯醛對(duì)白蠟窄吉丁具有吸引作用(Rigsbyetal.,2017;Wangetal.,2020;宋玄等,未發(fā)表數(shù)據(jù))，表明AplaOBP3可能在白蠟窄吉丁選擇寄主植物過程中發(fā)揮重要嗅覺感受功能。AplaOBP3和AplaOBP2表現(xiàn)出大致相同的表達(dá)及配體結(jié)合特征，它們均可結(jié)合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮。Zhong等(2018)的研究發(fā)現(xiàn)茶翅蝽5種OBPs與報(bào)警信息素組分反-2-癸烯醛具有強(qiáng)的結(jié)合能力。蘋果小吉丁OBP2和OBP8與十二醇、橙花醇、法尼醇和十二烷等多種配體均具有強(qiáng)的結(jié)合能力(Cuietal.,2018)。因此，昆蟲中不同種類的氣味結(jié)合蛋白能夠結(jié)合同一種揮發(fā)物，推測可能共同參與某種化合物的識(shí)別。

表1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3與候選配體結(jié)合能力Table 1 Binding capabilities of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennis to candidate ligands

續(xù)表1 Table 1 continued

表2 3種AplaOBP蛋白表達(dá)及配體結(jié)合特征比較Table 2 Comparison of expression and ligand binding characteristics of three AplaOBP proteins

順-3-己烯醇是白蠟葉片揮發(fā)物重要組分，其可以引起白蠟窄吉丁的EAG反應(yīng)，且對(duì)白蠟窄吉丁具有誘集活性，已應(yīng)用于商業(yè)化誘餌關(guān)鍵組分(Rodriguez-Saonaetal.,2006;Grantetal.,2010,2011)。目前，未發(fā)現(xiàn)一種AplaOBP蛋白能夠與順-3-己烯醇結(jié)合。白蠟窄吉丁11個(gè)AplaOBPs中，除觸角特異表達(dá)的3個(gè)AplaOBPs以外，AplaOBP6和AplaOBP7基因在觸角的表達(dá)量高于其他組織(Wangetal.,2020)，它們是否能夠與順-3-己烯醇結(jié)合還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。另外，其他水溶性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如化學(xué)感受蛋白(CSPs)也可能參與寄主揮發(fā)物的識(shí)別。Andersson等(2019)對(duì)白蠟窄吉丁基因組進(jìn)行分析，共注釋了14個(gè)AplaCSPs基因。目前，關(guān)于AplaCSPs在白蠟窄吉丁化學(xué)感受中的功能未見報(bào)道。我們推測觸角特異或高表達(dá)的AplaCSPs也很有可能參與順-3-己烯醇等寄主揮發(fā)物的識(shí)別。

綜上，本研究對(duì)白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白在觸角感器中的定位進(jìn)行了解析，通過體外功能研究的方法證明AplaOBP3可能參與白蠟窄吉丁對(duì)寄主植物揮發(fā)物的識(shí)別，同時(shí)比較了AplaOBP3與已報(bào)道的AplaOBP1和AplaOBP2的配體結(jié)合異同，為闡明氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識(shí)別中的功能奠定了一定基礎(chǔ)，也為基于氣味結(jié)合蛋白的功能篩選白蠟窄吉丁新的信息化合物提供了依據(jù)。然而，對(duì)于氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識(shí)別中的具體生理功能還需進(jìn)一步通過基因干擾或基因編輯進(jìn)行驗(yàn)證。