弗里熊蜂蜜罐中糖液成分分析

蘇 睿,秦加敏,董 坤,宋文菲,賈紅偉,3,梁 鋮,*

(1.云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661100;2.云南農業(yè)大學,昆明 650201;3.紅河學院,云南蒙自 661100)

昆蟲綱(Insecta)膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)的物種，主要以花蜜和花粉為食物(吳燕如,2000)。其中以蜜蜂屬Apis的物種最為典型，能夠將采集的花蜜帶回巢內貯藏，進而釀造成蜂蜜，這一生物學行為有效保留了食物營養(yǎng)，防止變質，是其適應自然而進化出的重要生存策略(匡邦郁和匡海鷗,2003)。蜜蜂釀造蜂蜜是一段復雜的生物、化學和物理變化過程。蜜蜂在花蜜中添加生物酶，同時脫去多余的水分，在這一過程中花蜜中的蔗糖被生物酶轉化為葡萄糖和果糖，與花蜜相比，蜂蜜含水量降低，pH值和化學組成發(fā)生了改變，含有更多的生物活性物質，如蜂王漿主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)、氨基酸和酶(Lichtenberg-Kraag,2014;Eyeretal.,2016;Zhangetal.,2019)。目前在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)的化學成分超過180種，且大部分都是在蜂蜜釀造過程中產生的(Lichtenberg-Kraag,2014)。研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的化學組分與蜜蜂在采集花蜜和蜂蜜釀造過程中添加的酶有關，蜜蜂添加到蜂蜜中的生物酶是由其咽下腺和唾液腺產生的，其中最重要的酶包括淀粉酶(α-淀粉酶)、轉化酶(α-葡萄糖苷酶)和葡萄糖氧化酶，而添加的量及酶的活性取決于很多因素，如工蜂的日齡、飼料、蜜蜂的生理狀態(tài)、蜂群的強弱、溫度以及蜂群的進蜜量(Al-Sherifetal.,2017)。因此，不同蜂蜜中酶的活力存在很大差異。最近的研究報道了西方蜜蜂Apismellifera和東方蜜蜂Apiscerana釀造的蜂蜜中特異性蛋白質電泳條帶差異很大，且這種差異只與蜂種有關(Zhangetal.,2019)，表明不同蜂種釀造的蜂蜜成分存在一定差異。

熊蜂屬Bombus是蜜蜂科(Apidae)中的重要類群。目前全世界發(fā)現(xiàn)有熊蜂250種(Cameronetal.,2007)，中國有125種(黃家興和安建東,2018)，其中云南分布有36種(梁鋮等,2018)。熊蜂是眾多野生植物和農作物的重要傳粉昆蟲(王曉峰等,2013;Ahmadetal.,2015;Sherry and Strang,2015;Zhangetal.,2015;Sapiretal.,2019)，特別是對高山、高原植物及一些瀕危植物的傳粉具有重要作用(Kudoetal.,2011;Pradervandetal.,2014)，在維系植物區(qū)系、生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定，以及促進綠色農業(yè)發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用。熊蜂具有與蜜蜂相似的覓食生物學，但因其群勢小，貯藏在蜜罐中的花蜜較少，目前有關熊蜂釀蜜生物學方面的研究鮮有報道。隨著農業(yè)生產方式和種植結構的改變，繁育熊蜂為農作物授粉具有巨大的市場需求。國外已有多個熊蜂物種被人工馴化，用于設施農業(yè)授粉(Velthuis and Doorn,2006)。然而，目前中國對本土熊蜂的繁育和授粉應用尚處于發(fā)展階段，市場上用于農作物授粉的熊蜂以歐洲地熊蜂Bombusterrestris為主。采用外來蜂種授粉，存在物種入侵帶來的生態(tài)危機。據(jù)報道，外來蜂種授粉時與本土熊蜂搶奪食物資源和營巢場所，干擾生殖，傳播病蟲害，引發(fā)本土傳粉蜂數(shù)量和分布區(qū)域縮減等潛在影響(Inoueetal.,2008;張體銀等,2015;袁曉龍等,2018)。因此，加強對本土熊蜂的基礎研究迫在眉睫。

弗里熊蜂Bombusfriseanus是云南優(yōu)勢物種，廣泛分布于海拔1 200-4 400 m的山地，是多種植物的泛化傳粉者(梁鋮等,2018)。近年來其周年繁育技術已在國內獲得成功，使得利用弗里熊蜂B.friseanus為農作物授粉成為可能(Liangetal.,2020)。在人工繁育研究過程中，發(fā)現(xiàn)弗里熊蜂B.friseanus會在蜜罐中存儲糖液，這為本研究提供了基礎。研究本土熊蜂的釀蜜生物學，了解其采集食物貯藏的特性和自身生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，對科學配制人工飼料，奠定規(guī)?；庇幕A，保護本土熊蜂的物種多樣性具有重要意義。本研究利用白砂糖溶液飼喂弗里熊蜂B.friseanus，收集并檢測了其貯藏在蜜罐中糖液的理化和生化指標，旨在解析熊蜂對其采集的食物是否具有釀造能力，為熊蜂生物學和繁育研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試蜂群：本實驗分別于2018和2019年的7-9月進行。弗里熊蜂B.friseanus由云南省農業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所農業(yè)授粉蜂研究實驗室提供。實驗蜂群放置于同一間暗室內飼養(yǎng)，暗室內溫度28±1℃，相對濕度60%±5%，蜂群9群，蜂王正常產卵，每群工蜂數(shù)量約60頭。

1.1.2設備與試劑：酶標儀(美國Bio-RAD xMarkTM)、電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)、數(shù)顯折射儀(ATAGO，Brix 0%～53%和58%～90%)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司)、α-淀粉酶試劑盒(Solarbio)、DNS試劑(Solarbio)、精密pH試紙(0.5-14)，氯化鈉、乙酸鈉、冰乙酸均為分析純，標準品果糖(C6H12O6)、葡萄糖(C6H12O6)、蔗糖(C12H22O11)、麥芽糖(C12H22O11·H2O)和海藻糖(C12H22O11·2H2O)購自Sigma公司。

1.2 實驗樣品制備

準確稱取500 g食品級一級白砂糖，加入500 g無菌純凈水，攪拌溶解煮沸，待冷卻后，用無菌純凈水定量至1 000 g，配制成50%的糖溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，4℃保存?zhèn)溆?。處理組實驗樣品的采集在飼養(yǎng)熊蜂的暗室內完成。預先用滅菌吸管移出實驗蜂群蜜罐中的原有糖液，移走飼喂瓶饑餓處理3 h，而后將配制好的50%的糖溶液放入滅菌飼喂瓶內，飼喂實驗蜂群直至采樣。同時用相同配方的花粉飼喂蜂群以滿足幼蟲發(fā)育所需的蛋白質(蜂群中有大量幼蟲存在時工蜂才會積極貯藏糖液)。24 h后用無菌吸管吸取工蜂貯藏在蜜罐中的糖液(圖1)，放入1.5 mL離心管。每次取樣時每群熊蜂單獨使用一支新的滅菌吸管，并且取完蜜罐中的所有糖液。每次采樣時移走飼喂瓶停止飼喂，以免蜜罐中可能混入熊蜂剛剛貯藏的糖液，樣品采集完成后再飼喂蜂群直至下一次采樣。分別間隔1,2,3,4,5,6和7 d，歷時28 d收集7組樣品。同時在1.5 mL滅菌離心管中盛放上述50%的糖溶液，放置在同一蜂箱中，排除熊蜂取食，作為對照組。采集好的樣品放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 弗里熊蜂的蜂巢及其貯藏的糖液Fig.1 Comb and sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus

1.3 pH值和總糖濃度檢測

用1 mL吸管取1滴樣品滴至pH試紙上，檢測樣品的pH值。用數(shù)顯折射儀測定總糖濃度。

1.4 糖組分檢測

處理組和對照組樣品中糖種類及含量委托中國科學院昆明植物研究所分析測試中心進行檢測。以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖作為標準物質。色譜條件如下：Agilent 1100，配置蒸發(fā)光散射檢測器ELSD；色譜柱：Waster Carbohydrate Analysis Column,4.6 mm×250 mm，4 μm；流動相：乙腈∶水(75∶25,v/v)等梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；蒸發(fā)溫度：80℃；霧化溫度：60℃；載氣：氮氣，流速 1.7 mL/min；進樣量：2 μL。以質量體積比濃度(mg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。根據(jù)標準品的保留時間確定樣品中糖的種類，以外標法計算糖的含量。

1.5 α-淀粉酶活性檢測

采用試劑盒檢測α-淀粉酶活性。α-淀粉酶活性單位定義為：每g樣品每分鐘轉化產生1 mg還原糖為1個酶活力單位(U/g FW)。預先配制pH 5.30的乙酸鈉緩沖液：稱取8.70 g乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)、1.45 g氯化鈉，加蒸餾水充分溶解，冰乙酸調節(jié)pH，定容至50 mL。稱取0.01 g樣品，加入0.5 mL乙酸鈉緩沖液，蒸餾水定容至10 mL，室溫靜置10 min，充分提取，稀釋1倍即為待測樣品原液。測定步驟依α-淀粉酶檢測試劑盒進行。

1.6 轉化酶活性檢測

以0.1 g/mL的蔗糖溶液為轉化酶底物，葡萄糖為標準物質制作標準曲線，參照張忠義等(2002)研究方法并改進。首先配制pH 4.60的HAc-NaAc緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00 mg葡萄糖，蒸餾水稀釋成1,0.5,0.25,0.125,0.0625和0.03125 mg/mL的葡萄糖標準溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。稱取0.05 g樣品加入5 mL HAc-NaAc緩沖液，室溫靜置10 min，充分提取，蒸餾水定容至100 mL，制成待測樣品原液。

分別設空白管、標準管、對照管和測定管，測定步驟如下：①向6支標準管中分別加入75 μL葡萄糖標準溶液，空白管中加75 μL蒸餾水；②對照管和測定管中分別加入75 μL待測樣品原液，并將其與蔗糖溶液置于45℃水浴10 min；③對照管中加入150 μL DNS試劑，其余管中分別加入75 μL蔗糖溶液，45℃水浴準確反應10 min；④對照管中加入75 μL蒸餾水，其余各管分別加入150 μL DNS試劑，90℃水浴10 min終止反應，立即用酶標儀測定A540。轉化酶活性單位定義為：每g樣品每分鐘轉化產生1 mg還原糖為1個酶活力單位(U/g FW)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，用Excel 2010和SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)。采用one-way ANOVA方差分析，用LSD多重比較法分析不同貯藏天數(shù)樣品中濃度、糖組分、pH和兩種酶活性的差異顯著性，顯著或極顯著水平分別設為P<0.05或P<0.01；采用t檢驗分析貯藏在蜜罐中的糖液和對照組糖液的pH差異顯著性；采用二元變量的Pearson系數(shù)分析糖組分含量與蔗糖或貯藏時間的相關性。

2 結果

2.1 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時間的糖液pH值和濃度

熊蜂貯藏在蜜罐中1～7 d的糖液pH值平均為3.74±0.13(n=28)，t檢驗發(fā)現(xiàn)，其極顯著低于對照組(6.55±0.15,n=28,P<0.01)，表明糖液經熊蜂貯藏后pH顯著降低。糖液在蜜罐中貯藏1～7 d后，濃度由50.00%升高到61.20%～81.10%，平均濃度75.07%±5.29%(n=126)。單因素方差分析結果表明，貯藏6 d的平均糖濃度為78.43%±1.81%，與貯藏4,5和7 d時的糖濃度差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于貯藏1,2和3 d時的濃度(P<0.05)(圖2)；Pearson相關性分析表明，濃度與貯藏時間顯著正相關(Pearsonr=0.40,P<0.01,n=126)，隨貯藏時間延長濃度升高。

2.2 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時間的糖液糖組分

對實驗收集的樣品進行糖組分檢測，結果顯示熊蜂貯藏在蜜罐中的糖液與對照組相比，糖組分及含量發(fā)生了顯著改變(圖3)。經過HPLC檢測分析，對照組1～7 d的糖溶液中只檢出蔗糖，且含量恒定為50.00%，而蜜罐中貯藏1～7 d的糖液樣品中均檢測到果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和海藻糖5種糖。以貯藏3 d時為例，蜜罐和對照組的糖組分色譜圖分別如圖3(B)和圖3(C)所示。

貯藏在蜜罐中不同時間的糖液組分含量如表1所示。單因素方差分析表明，貯藏4 d后果糖含量最高(26.97%±0.69%)，貯藏5 d后葡萄糖含量最高(20.87%±0.10%)，二者極顯著高于其他貯藏時間(P<0.01)；貯藏1 d時的蔗糖含量最低(16.94%±0.89%)，極顯著低于貯藏6 d時(35.78%±0.06%,P<0.01)；貯藏1～4 d時的麥芽糖含量極顯著高于貯藏 5～7 d時的(P<0.01)，而貯藏1～4 d時的海藻糖含量極顯著低于貯藏5～7 d時(P<0.01)。貯藏4～5 d后己糖(葡萄糖和果糖)含量(平均41.73%)極顯著高于貯藏1～3 d和6～7 d時的(P<0.01)。

圖2 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同天數(shù)的糖液平均濃度Fig.2 Average concentrations of sugar solution in wax cells stored by Bombus friseanus for different days圖中誤差線下方標注的不同小寫字母表示貯藏不同天數(shù)的糖液平均糖濃度經LSD法檢驗差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters below the error bars show that the average sugar concentrations of sugar solution during different storage days were significantly different (P<0.05) by LSD test.

相關性分析表明，總糖中果糖、己糖(果糖和葡萄糖)、麥芽糖含量分別與蔗糖含量具有極顯著負相關關系(果糖:Pearsonr=-0.976,P=0.000;己糖:Pearsonr=-0.738,P=0.001;麥芽糖:Pearsonr=-0.719,P=0.001)，換言之，在釀蜜過程中果糖和麥芽糖含量隨著蔗糖含量的升高而降低。然而，葡萄糖和海藻糖含量與蔗糖含量變化不相關(葡萄糖:Pearsonr=0.109,P=0.676;海藻糖:Pearsonr=0.403,P=0.108)。另外，總糖中果糖和麥芽糖含量與貯藏時間極顯著負相關(果糖:Pearsonr=-0.768,P=0.000;麥芽糖:Pearsonr=-0.875,P=0.000)，隨貯藏時間的延長含量降低；葡萄糖、蔗糖和海藻糖含量分別與貯藏時間呈極顯著正相關(葡萄糖:Pearsonr=0.684,P=0.002;蔗糖:Pearsonr=0.665,P=0.004;海藻糖:Pearsonr=0.672,P=0.003)，隨貯藏時間的延長含量升高。

圖3 貯藏在弗里熊蜂蜜罐中3 d的糖液和對照組第3天糖液的碳水化合物色譜圖Fig.3 Chromatograms of carbohydrates in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus and in the control group for 3 dA:糖的標準品色譜圖Chromatogram of standard sugar;B:熊蜂在蜜罐中貯藏3 d的糖液的碳水化合物色譜圖Chromatogram of carbohydrates in sugar solution stored in wax cells of bumblebees for 3 d;C:對照組第3天糖液的碳水化合物色譜圖Chromatogram of carbohydrates in sugar solution in the control group for 3 d.波峰Peaks:1:果糖Fructose;2:葡萄糖Glucose;3:蔗糖Sucrose;4:麥芽糖Maltose;5:海藻糖Trehalose.

表1 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同天數(shù)的糖液中糖組分含量(%)變化Table 1 Changes in the contents (%) of sugar components in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus for different days

2.3 弗里熊蜂蜜罐中貯藏不同時間的糖液中α-淀粉酶和轉化酶的活性

分析發(fā)現(xiàn)貯藏6 d的糖液中α-淀粉酶活性高達82.86 U/g FW(n=131)，極顯著高于貯藏1～5 d和7 d時的樣品(P<0.01)；除了貯藏6 d的糖液樣品，其余樣品中α-淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)(表2)。

貯藏在蜜罐中1～7 d時的糖液，轉化酶活性差異不顯著(P>0.05，表2)，所有樣品轉化酶活性在21.17～38.05 U/g FW之間(n=126)，轉化酶活性平均為27.01～28.85 U/g FW。

表2 貯藏在弗里熊蜂蜜罐中不同天數(shù)的糖液中α-淀粉酶和轉化酶的活性(U/g FW)Table 2 The α-amylase and invertase activities (U/g FW) in sugar solution stored in wax cells of Bombus friseanus for different days

3 討論

蜜蜂科中，熊蜂和蜜蜂是親緣關系較近的兩個屬(Hines,2008)，但熊蜂的貯蜜量及貯蜜積極性遠不如蜜蜂，可能是由于二者的生物學差異所致。蜜蜂為社會性昆蟲，貯藏蜂蜜有兩方面的重要意義：(1)確保蜂群安全越冬；(2)度過漫長的惡劣環(huán)境，例如缺乏蜜源的高溫夏季；而熊蜂為不完全社會性昆蟲，以交尾后的子代蜂王滯育越冬，貯藏蜂蜜僅僅是為了度過短期低溫陰雨天氣。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂50%的白砂糖溶液后，弗里熊蜂B.friseanus積極取食并將糖液貯藏在蜜罐中，當蜂群壯大至80頭工蜂時，貯藏糖液的蜜罐多達120個，盡管貯藏糖液的蜜罐比例大約只有30%～60%，但每個蜜罐中貯藏的糖液的體積在0.1～2.0 mL間，其中貯藏在工蜂巢房中的糖液較少，而貯藏在工蜂筑造的蜜罐中的糖液較多。弗里熊蜂B.friseanus在云南的垂直分布范圍最廣，主要采集豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)和菊科(Asteraceae)植物的花蜜和花粉(Liangetal.,2020)，面臨的生境更加復雜，貯蜜可能是其在進化過程中適應極端天氣的重要生存策略。

在流蜜期，花蜜經蜜蜂釀制后，含水量降至18%左右，成熟蜂蜜中的總糖含量升高至75%以上，主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖及少量的松三糖和棉籽糖等(邢晶晶,2009)。本實驗中，蜜罐中糖液的糖組分比對照組更加豐富，由單一的蔗糖變成了果糖、葡萄糖、麥芽糖和海藻糖，濃度由50.00%升高至81.10%，pH值由6.55降至3.74，表明糖液經熊蜂取食并貯藏在蜜罐后發(fā)生了一系列復雜的物理和化學變化。研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜的高滲環(huán)境可使細胞脫水，造成生理干燥，從而抑制病菌生長(Mandal and Mandal,2011;Kwakman and Zaat,2012;Libonattietal.,2014)。弗里熊蜂B.friseanus釀造后的糖液濃度很高，具有高滲特性，因此釀造后的糖液可能也有一定的抑菌作用，這對于糖液的短期保存與防腐具有重要意義。

據(jù)報道，蜜蜂釀蜜初始蔗糖含量越高，蔗糖降解速率越快(Lichtenberg-Kraag,2012)。本實驗中，與蔗糖的起始含量50%相比，熊蜂貯藏1 d后的糖液中蔗糖含量下降最快，與蜜蜂釀蜜生物學相似。西方蜜蜂A.mellifera和東方蜜蜂A.cerana釀造的蜂蜜以果糖和葡萄糖為主，糖組分一般包括約38%的果糖、31%的葡萄糖，低于5%的蔗糖以及其他的二糖和三糖(Doner,1977)。黃紋無刺蜂Trigonaventralis蜂蜜中蔗糖含量僅0.80%(梁馨文等,2018)。本研究發(fā)現(xiàn)，糖液經弗里熊蜂B.friseanus貯藏4～7 d后，其中蔗糖平均含量為28.27%，果糖為17.58%，葡萄糖為16.67%，表明弗里熊蜂B.friseanus釀造的蜂蜜中蔗糖仍占優(yōu)勢，進一步表明蜂蜜中的糖組分及其比例與物種有關。此外，弗里熊蜂B.friseanus釀造蜂蜜的后期蔗糖含量不降反升，可能是由于糖液貯藏后期熊蜂群發(fā)育快速，內勤蜂消耗了蜜罐中的糖液，外勤蜂重新將飼喂瓶中的新鮮糖溶液添加到蜜罐中，導致樣品中的蔗糖含量波動，進而影響其他糖組分的含量變化。綜上所述，顯示蜜蜂科的不同物種釀蜜生物學不同。

本實驗蜜罐中的麥芽糖含量隨著蔗糖含量的增加而顯著降低(Pearsonr=-0.72,P<0.01)，尤其貯藏5,6和7 d的樣品最明顯(表1)，可能是熊蜂分泌并添加了某種異構酶使得蔗糖和麥芽糖相互轉化。據(jù)報道，單糖被昆蟲吸收到血液后，會在脂肪體細胞中合成海藻糖，同時轉化成糖原貯藏在細胞中(Kuniedaetal.,2006)。另外，酵母、霉菌、藻類、低等維管植物等生物體中也廣泛存在海藻糖，已經證實海藻糖對多種生物活性物質具有非特異性保護作用(趙曉峰和吳榮書,2004)。一些微生物體內存在海藻糖合酶，可以將麥芽糖轉化成海藻糖和葡萄糖(吳傲等,2019)。因此，本研究在蜜罐中檢測到的海藻糖可能來源于熊蜂體內，通過熊蜂吞吐糖液而添加，也可能來源于熊蜂消化道內的共生菌。處理組均檢測到α-淀粉酶和轉化酶，對照組均未檢測到這兩種酶，說明蜜罐糖液中的生物酶是由弗里熊蜂B.friseanus在取食糖液或者釀造蜂蜜的過程中添加的。蜜蜂的工蜂在采集花蜜和釀造蜂蜜的過程中，混入其唾液腺和咽下腺的分泌物，其中淀粉酶和轉化酶使得蜂蜜的化學組分高度復雜(Al-Sherifetal.,2017)。淀粉酶能提高蜜蜂對二糖的利用率，使工蜂飛行更長的時間，對花粉的預消化也十分重要(Hrassniggetal.,2005)。前人研究表明，蜂蜜中轉化酶的本質為α-葡萄糖苷酶(White and Maher,1953)，具有水解蔗糖、麥芽糖和海藻糖的作用，將其轉化為葡萄糖和果糖(Kubotaetal.,2004;Parvanovetal.,2012)，且在蜂蜜貯藏過程中繼續(xù)作用，使蔗糖含量持續(xù)下降，轉化糖含量相應升高，增加蜂蜜的滲透壓。因此，本研究蜜罐樣本中檢測到的果糖和葡萄糖是由于熊蜂添加的轉化酶的作用。

Lichtenberg-Kraag(2014)論證了在蜜蜂釀造的蜂蜜成熟過程中蔗糖濃度與轉化酶活性之間存在極顯著相關性，蜂蜜中剩余的蔗糖含量越高，檢測到的轉化酶活性就越低。本研究弗里熊蜂B.friseanus貯藏在蜜罐1～7 d的糖液中轉化酶活性差異不顯著(P>0.05)，平均27.01～28.85 U/g FW，而蔗糖含量卻隨貯藏時間的延長顯著升高(表2)，推測弗里熊蜂B.friseanus貯藏在蜜罐中的糖液的蔗糖濃度與轉化酶活性之間可能不存在顯著相關性；此外，除了貯藏6 d后的糖液中α-淀粉酶活性顯著升高至82.86 U/g FW外，其余幾天的樣品α-淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)(表2)。但東方蜜蜂A.cerana和西方蜜蜂A.mellifera釀造的蜂蜜中淀粉酶和轉化酶含量在工蜂采集花蜜以及隨著在蜂巢中釀造時間(7 d內)的延長而顯著增加(宗德琴等,2015;葉夢迪等,2017)。Al-Sherif等(2012)對咽下腺的研究表明，卡尼鄂拉蜂Apismelliferacarnica和埃及蜜蜂Apismelliferalamarckii的工蜂在不同的生活階段，咽下腺分泌的轉化酶、葡糖氧化酶和淀粉酶的量不同。已有研究人員提出花蜜的粘度決定了蜜蜂分泌的唾液量，從而影響酶的分泌量(Lichtenberg-Kraag,2014)。另外，蜂群內的條件如空間大小、蜂群密度以及蜜蜂的遺傳差異也能夠影響蜂群之間轉化酶和淀粉酶的活性差異(Lichtenberg-Kraag,2014)。因此，本研究蜜罐中糖液的α-淀粉酶和轉化酶的活性整體上沒有隨著在蜂巢中貯藏時間的延長而顯著升高或者下降，可能是因為熊蜂的酶體系與蜜蜂存在很大差異，分泌酶的活動更加復雜以及熊蜂的個體遺傳差異和特殊的貯蜜行為。據(jù)報道，熊蜂能夠快速評估糖濃度發(fā)生改變的花朵，并能夠快速地將花朵的顏色、氣味等信號與花朵的熱量值或“可獲得的凈能量”聯(lián)系起來(Cnaanietal.,2006;Nachevetal.,2013)。實驗中觀察到，與蜜蜂持續(xù)性貯蜜不同，熊蜂為階段性貯蜜，在蜜罐中貯藏3～4 d后，熊蜂會選擇性地取食濃度較高的糖液，繼而再次將飼喂瓶中新鮮的濃度較低的糖溶液貯藏到空的蜜罐中，這種特殊的貯蜜方式決定了蜜罐樣品中糖液的濃度、糖組分及α-淀粉酶和轉化酶活性是波動變化的，而不是線性升高或下降。

總而言之，弗里熊蜂B.friseanus將蔗糖溶液貯藏在蜜罐中，脫去多余水分，添加生物酶，經過一段時間轉化成含有多種糖組分、成分多樣的糖溶液，表明其具有釀造蜂蜜的能力。