王春艷，付博辰，郭書賢，彥培勛，李學思，李慧星*

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.長安大學 運輸工程學院，陜西 西安 710064；3.河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

中國傳統(tǒng)的濃香型白酒釀造以窖池中的窖泥為基礎(chǔ)，窖池中豐富的微生物菌群在發(fā)酵過程中進行著復(fù)雜的能量與物質(zhì)代謝，從而促進了窖泥的老熟以及白酒品質(zhì)的提高[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，真菌菌群在白酒釀造過程中起到至關(guān)重要的作用，是產(chǎn)酒精、產(chǎn)香的主要功能菌，也具有很高的糖化酶及酯化酶活力[3-4]。因此，對窖泥中真菌群落結(jié)構(gòu)組成的分析有助于了解濃香型白酒釀酒微生物菌群代謝特征，為白酒風味形成及品質(zhì)保證提供必要的依據(jù)。

傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)或聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）等技術(shù)存在分析數(shù)據(jù)量小，覆蓋率低等弊端，而高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)具有通量高、覆蓋廣泛、耗時短等特點，能夠更加準確、全面地揭示或預(yù)測微生物的群落結(jié)構(gòu)及功能，是微生物群落深入解析的強有力手段[5]。目前，對窖泥真菌菌群結(jié)構(gòu)研究的方法主要集中在可培養(yǎng)菌的分離篩選以及磷酸脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）生物標記和PCR-DGGE技術(shù)[6-8]，高通量測序技術(shù)更多的被應(yīng)用于分析白酒窖泥原核微生物[9-11]，而真菌群落結(jié)構(gòu)解析研究較少。于春濤等[12]研究發(fā)現(xiàn)河北某知名酒廠窖泥變質(zhì)前后真菌的種類和豐度均有顯著差異；孟雅靜等[13]分析了安徽某知名濃香型白酒企業(yè)新老窖泥的真核菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)屬水平上新老窖池窖底泥中假絲酵母（Candida）占絕對優(yōu)勢，新老池窖壁泥的真菌組成更接近且更豐富，Ca2+含量對窖底泥的真核菌群組成具有重要作用；LIU M K等[14]研究了不同窖齡窖泥內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）基因序列多樣性，結(jié)果顯示5年窖齡窖泥樣品中根霉菌（Rhizopus）、莖點菌（Phoma）和毛孢子菌（Trichosporon）相對較多，100年窖齡窖泥樣品中曲霉（Aspergillus）和假絲酵母的比例最高；王福楨[15]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團濃香型白酒窖泥真菌的群落組成較為簡單，而沈毅等[16]研究發(fā)現(xiàn)郎酒公司醬香型白酒窖泥中真核微生物豐富度和多樣性遠高于高溫大曲和酒醅。

微生物群落分布特征與其環(huán)境因素息息相關(guān)，生產(chǎn)實踐表明，窖泥越老，窖泥富集的有利微生物越多，參與形成的呈香物質(zhì)也越多，相同窖齡窖池的窖壁泥和窖底泥所處環(huán)境因子差異較大，這些因素勢必都會對真核微生物群落分布產(chǎn)生不同程度的影響[17]，因此針對不同窖齡窖壁泥和窖底泥中真菌群落特征及其分布情況的研究十分必要。宋河酒業(yè)是河南省濃香型白酒的代表，對其窖泥中真菌微生物的調(diào)查研究非常薄弱，本研究以宋河濃香型白酒不同窖齡窖壁泥和窖底泥為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對其真菌群落結(jié)構(gòu)進行全面分析，以期更加深入的認知釀酒微生物的作用機理，揭示“老窖產(chǎn)好酒”的秘密，為更好的穩(wěn)定白酒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥樣品：取自河南宋河酒業(yè)股份有限公司濃香型白酒生產(chǎn)廠，所選窖池窖齡分別為6年和16年。窖壁泥采用四點取樣法，4面池壁分別取距窖口約50 cm處的泥樣約50 g，充分混勻作為1個窖壁泥樣本，分別編號為W1（6年窖壁泥）和Y1（16年窖壁泥）；窖底泥采用五點取樣法，窖池底部中心點及四個角點分別取泥樣約50 g，充分混勻作為1個窖底泥樣本，分別編號為W2（6年窖底泥）和Y2（16年窖底泥）。所有樣品放入無菌采樣袋中低溫運回實驗室。

1.1.2 主要試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind 土壤脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；2×Taq聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒：美國Beckman公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina Miseq PE250高通量測序儀：美國Illumina公司；T100 Thermal Cycler PCR儀：美國BIO-RAD公司；Invitrogen Qubit3.0熒光計：美國Life公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及PCR擴增

窖泥總DNA的具體提取步驟參照E.Z.N.ATM Mag-Bind土壤DNA提取試劑盒的使用說明書，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提樣本DNA進行完整性檢測。以DNA為模板，采用Illumina Miseq測序平臺的通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對窖泥樣品中真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列進行PCR擴增。PCR擴增體系及擴增條件參照文獻[18]。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測序及數(shù)據(jù)分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、純化回收后，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量。定量后的DNA樣品各取10 ng，1∶1等量混合后，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。測序結(jié)果首先按照標簽序列（barcode）識別區(qū)分各樣本序列，并對其進行質(zhì)量控制，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)，調(diào)用Usearch軟件去除非特異性擴增序列和嵌合體。按照97%序列相似性標準劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），使用R軟件的VennDiagram制作OTU分布韋恩圖。使用QIIME軟件，對樣本的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)以及覆蓋率（Coverage）進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到窖泥樣品W1、W2、Y1、Y2的原始序列數(shù)分別為67 962條、69 530條、139 774條和45 165條。剔除嵌合體和靶區(qū)域外序列后最終得到的有效序列數(shù)分別為67787條、69 350條、139573條和45063條，其平均堿基長度分別為240.95 bp、238.50 bp、267.62 bp和257.42 bp。在97%序列相似性水平下劃分OTU，4個窖泥樣品共得到2 238個OTUs，對其進行Alpha多樣性分析，結(jié)果見表1。

表1 窖泥樣品真菌的序列數(shù)、OTU數(shù)及Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Sequence number,OTU number and Alpha diversity index of fungi in pit mud samples

由表1可知，4個窖泥樣品的覆蓋率均＞99.0%，表明試驗的取樣合理，測序結(jié)果能真實反映樣本的實際情況。Alpha多樣性指數(shù)中香農(nóng)（Shannon）和辛普森（Simpson）指數(shù)是物種多樣性和均勻度的綜合指標，Chao1和ACE指數(shù)是物種豐富度指數(shù)，對稀有物種更為敏感。本研究中6年窖齡窖池窖壁泥樣品W1的香農(nóng)指數(shù)（3.41）最高，辛普森指數(shù)（0.08）最低，說明其真菌群落的多樣性最高，16年窖齡窖池窖壁泥樣品Y1的ACE指數(shù)（1 445.34）及Chao1指數(shù)（1 133.77）最高，說明其真菌群落物種的豐富度最大。進一步在OTU水平上對窖泥中真菌菌群的構(gòu)成進行解析，基于OTU水平的Venn圖見圖1。

圖1 基于OTU水平的Venn圖Fig.1 Venn diagram based on OTU level

由圖1可知，4個樣品的核心OTU為34個，獨有OTU分別為186（W1）、91（W2）、345（Y1）和153（Y2），結(jié)果表明隨著窖齡的增加，窖泥中稀有真菌物種均有所提高，這與豐富度指數(shù)計算結(jié)果相一致。以上數(shù)據(jù)分析還發(fā)現(xiàn)無論多樣性還是豐富度，窖泥樣品W1高于W2，Y1高于Y2，由此可見，相同窖齡的窖壁泥真菌多樣性及豐富度均高于窖底泥，這與孟雅靜等[13]的研究結(jié)果相一致。這可能是由于窖底泥常年處于黃水的浸泡中，更偏向為厭氧環(huán)境，從而不利于好氧型真菌的生存，而窖壁泥中氧氣的含量相對更多，這為真菌群落呈現(xiàn)更加豐富的多樣性提供了可能。

2.2 基于門水平窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對OTU注釋，共得到5個門，其中優(yōu)勢菌門（相對豐度≥1%）共4個，其余門和未注釋到門的OUT歸為others，結(jié)果見圖2。由圖2可知，子囊菌門（Ascomycota）在4個窖泥樣品中占據(jù)絕對優(yōu)勢，且在6年窖齡窖池窖壁泥、窖底泥中相對豐度（69.1%、68.7%）均小于16年（86.2%、81.1%），同樣的隨著窖齡的增加，毛霉菌門（Mucoromycota）在窖壁泥、窖底泥中相對豐度分別從1.9%和0.3%增加至4.4%和5.8%。被孢霉門（Mortierellomycota）有著不同的變化趨勢，6年窖齡窖池窖壁泥、窖底泥的相對豐度高達6.7%和13.8%，16年窖齡窖池窖泥中卻消失未檢出，擔子菌門（Basidiomycota）僅在16年窖齡窖池窖壁泥中占據(jù)優(yōu)勢（2.5%），其他樣品均未檢出。相較于孟雅靜等[13-14]的相關(guān)研究結(jié)果，宋河酒業(yè)窖泥中絕對優(yōu)勢菌門相同，毛霉菌門和被孢霉門是特有菌門，擔子菌門的豐度顯著偏少。

圖2 基于門水平窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of fungi community structure in pit mud based on phylum level

2.3 基于屬水平窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對OTU注釋，共得到124個屬，其中優(yōu)勢菌屬（相對豐度≥1%）共15個，其余非優(yōu)勢菌屬和未注釋到屬的OTU歸為others，結(jié)果見圖3。由圖3可知，窖泥中的真核微生物主要由酵母菌和霉菌組成。6年窖齡窖池窖壁泥、窖底泥中青霉屬（Penicillium）、氈盤菌屬（Byssonectria）、被孢霉屬（Mortierella）和伽穆孢屬（Gamsia）作為優(yōu)勢菌屬，其相對豐度分別為26.1%和40.3%、8.7%和16.3%、6.7%和13.8%、5.0%和1.5%。隨著窖齡的延長，16年窖齡窖池窖泥中青霉屬相對豐度顯著下降，低至5.1%和4.5%，氈盤菌屬、被孢霉屬和伽穆孢屬在16年窖齡窖池窖壁泥中消失未被檢出，在16年窖齡窖池窖底泥中有檢出但相對豐度均＜1%成為非優(yōu)勢菌。相反的，嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）和根毛霉屬（Rhizomucor）在6年窖齡窖池窖壁泥、窖底泥的相對豐度較低，分別為1.7%和0.4%、3.8%和5.4%、0.9%和0.2%，16年窖齡窖池窖齡窖泥中相對豐度顯著增加至20.2%和21.7%、10.9%和14.3%以及2.6%和4.6%，成為16年窖齡窖池窖齡窖泥的優(yōu)勢真菌屬。除此之外，高通量測序結(jié)果顯示嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、綠僵菌屬（Metarhizium）和根霉屬（Rhizopus）僅為16年窖壁泥的優(yōu)勢屬，而在其他3個樣品中相對豐度極低。孟雅靜等[13]研究發(fā)現(xiàn)，窖池的真菌群落結(jié)構(gòu)主要由窖壁泥和窖底泥所處的理化環(huán)境差異所決定，窖壁泥與窖底泥真菌組成差異較大，而新老窖泥差異并不顯著。LIU M K等[14]的研究有著不同的結(jié)論，實驗結(jié)果揭示低齡和百年窖泥優(yōu)勢真核菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。本研究結(jié)果表明，相同窖齡窖池窖壁泥和窖底泥的真菌群落結(jié)構(gòu)分布較為接近，不同窖齡窖池窖泥在優(yōu)勢真菌類別上存在較大差異，窖池內(nèi)不同位置的環(huán)境差異可能會導(dǎo)致“稀有種”的出現(xiàn)，但是絕對優(yōu)勢菌的類別沒有顯著區(qū)別。由此可見，窖齡及窖泥位置的理化環(huán)境均可不同程度的影響真菌群落結(jié)構(gòu)分布，本研究中窖齡是影響的主導(dǎo)因素。

圖3 基于屬水平窖泥中真菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of fungi community structure in pit mud based on genus level

真菌是窖泥微生物的重要組成部分，已報道的不同窖泥樣本中的真菌多樣性有高有低，本研究窖泥呈現(xiàn)出豐富的真核微生物多樣性，與該樣本的細菌群落中少數(shù)幾個優(yōu)勢菌屬相對含量＞80%的現(xiàn)象存在顯著差異[19]。6年窖齡窖池窖泥的優(yōu)勢真菌主要為青霉屬、氈盤菌屬和被孢霉屬等，16年窖齡窖池窖泥為未分類酵母菌、嗜熱真菌屬和曲霉菌屬，這些優(yōu)勢真菌屬同樣存在于已報道的其他白酒真核微生物組成中[12，15]，是白酒釀造過程中復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝的重要參與者。酵母菌對于酒精發(fā)酵以及相關(guān)酶系的產(chǎn)生起著重要作用[20]，曲霉、根霉等具有較強的產(chǎn)酶能力，能夠分泌葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶，促進酵母菌的生長繁殖，進而產(chǎn)生更多的酒精，這對白酒品質(zhì)、風味的提升有著積極的影響[21]，而有些菌類（如青霉菌等）通過消耗酒精底物產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致酒糟pH值增加，從而影響酒類口味[22-23]。于春濤等[12]對濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后真菌群落差異分析發(fā)現(xiàn)，變質(zhì)后的窖泥中青霉屬成為主要調(diào)節(jié)者（相對豐度為76.56%）。本研究中出酒品質(zhì)相對較差的6年窖齡窖池窖泥中青霉屬相對豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢，而出酒品質(zhì)較好的16年窖齡窖池窖泥中青霉屬相對豐度顯著降低，青霉屬相對豐度的變化可能成為窖泥質(zhì)量變化的指示性真核微生物，這有待于認識窖泥微生物全貌再作綜合分析。

3 結(jié)論

本研究運用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析了河南宋河濃香型白酒新（6年）老（16年）窖池窖壁泥和窖底泥的真菌群落結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，老窖池窖壁泥和窖底泥中真菌菌群物種豐富度均高于新窖池，老窖池窖底泥真菌菌群多樣性高于新窖池，但窖壁泥多樣性低于新窖池；窖壁泥中真菌菌群物種多樣性和豐富度均高于窖底泥。在門水平上，新老窖池窖泥的絕對優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，相對含量為68.7%～86.2%。在屬水平上，相同窖齡窖池窖壁泥和窖底泥的真菌群落結(jié)構(gòu)分布較為接近，不同窖齡窖泥真菌微生物在優(yōu)勢物種組成上發(fā)生了改變，新窖池窖泥的優(yōu)勢真菌群（相對豐度≥1%）主要有青霉屬、氈盤菌屬和被孢霉屬等，老窖池窖泥的優(yōu)勢真菌群為嗜熱真菌屬、曲霉菌屬和根毛霉屬等。相較于其他3個樣本，嗜熱子囊菌屬、綠僵菌屬和根霉屬僅為老窖池窖壁泥的優(yōu)勢屬。窖齡及窖泥位置的理化環(huán)境均可不同程度的影響真菌群落結(jié)構(gòu)分布，本研究中窖齡可能是影響的主導(dǎo)因素。