李鑫 喬欣 楊娟 楊毅清 馬樹杰 張利輝 董金皋

摘要 ：為了尋找高效安全的微生物除草劑，本研究以天然存在的黏質(zhì)沙雷氏菌 Ha1菌株為試驗材料，采用發(fā)酵液噴施法和顆粒劑封閉法（填埋法和撒施法）對玉米田常見雜草進行了室內(nèi)活性測定。發(fā)酵液噴施法、顆粒劑填埋法和撒施法對雜草的鮮重防效分別為47.88%，70.63%和76.82%。發(fā)酵液噴施法和顆粒劑封閉法均能有效防除雜草，顆粒劑封閉法優(yōu)于發(fā)酵液噴施法，顆粒劑撒施法優(yōu)于填埋法。

關(guān)鍵詞 ：黏質(zhì)沙雷氏菌; 除草活性; 鮮重防效

中圖分類號： S 482.7

文獻標識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019581

Determination of indoor herbicidal activity of Serratia marcescens Ha1 in corn fields

LI Xin1， QIAO Xin1， YANG Juan2， YANG Yiqing1， MA Shujie1， ZHANG Lihui1*， DONG Jingao1

（1. College of Plant Protection， Hebei Agricultural University， Baoding 071000， China; 2. College of Agronomy

and Biotechnology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066600， China）

Abstract ：In order to find efficient and safe microbial herbicides， indoor activity of the naturally occurring Serratia marcescens Ha1 strain on common weeds in maize field by fermentation broth spray method and granule sealing method （landfill method and spreading method）. The fresh weight control efficacies of fermentation broth spray method， granule filling method and spreading method on weeds were 47.88%， 70.63% and 76.82%， respectively. Both the fermentation liquid spraying method and the granule sealing method can effectively prevent weeds. The granule sealing method is superior to the fermentation liquid spraying method， and the granule spraying method is superior to the landfill method.

Key words ：Serratia marcescens; herbicidal activity; fresh weight control

自20世紀70年代化學除草劑大面積推廣以來，我國就逐漸形成了以化學防除為主的雜草防除技術(shù)體系[1]。雖然化學除草劑在雜草防治中具有諸多優(yōu)勢，但其長期使用所帶來的藥害、抗性、環(huán)境和藥物殘留等問題也不容忽視[2]。為了保障農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，農(nóng)業(yè)部提出到2020年化學農(nóng)藥使用量“零增長”計劃，廣大研究學者逐漸把目光轉(zhuǎn)向了資源豐富、環(huán)境友好的微生物除草劑。截至2016年底，我國已經(jīng)登記的生物源農(nóng)藥的有效成分有115個，產(chǎn)品有3 764個，分別約占整個農(nóng)藥登記的17%和9.9%。其中，已登記的微生物農(nóng)藥有效成分就有42個，產(chǎn)品495個，主要涉及細菌、真菌、病毒、原生動物等不同類別，產(chǎn)品數(shù)量較多的品種主要包括蘇云金桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌、木霉菌、白僵菌、綠僵菌、棉鈴蟲核型多角體病毒等[3]。目前，微生物農(nóng)藥的推廣使用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病蟲害防治上已經(jīng)略顯成效。

黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens又稱靈桿菌，是一種常見革蘭氏陰性菌，其在生長過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物——靈菌紅素在植物的病蟲害防治方面發(fā)揮了重要作用[4]。在害蟲生物防治上，黏質(zhì)沙雷氏菌是一種重要的昆蟲病原細菌，傅慧靜[5]研究了黏質(zhì)沙雷氏菌的木質(zhì)素降解功能以及與寄主松墨天牛Monochamus alternatus Hope的協(xié)同關(guān)系;牛洪濤等[6]報道了黏質(zhì)沙雷氏菌SJS1可以降低灰飛虱Laodelphax striatellus對殺蟲劑的抵抗能力;傅仁杰等[7]研究發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌SM1菌株能夠?qū)α帜竞οx白蟻起到毒殺作用。在植物病害防治方面，黏質(zhì)沙雷氏菌對多種病害有明顯的抑制作用，李鵬鵬[8]發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌FS14對植物病害真菌尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和核盤菌Sclerotinia sclerotiorum等有很強的拮抗作用;白騰飛等[9]發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌 YD25菌株對尖孢鐮刀菌、小麥根腐病菌Bipolaris sorokiniana、西瓜腐爛病菌Colletotrichum lagenarium、辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici、立枯絲核菌Rhizoctonia solani等具有較好的抑制作用;黏質(zhì)沙雷氏菌CFFSURB2 的次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素及幾丁質(zhì)酶可以抑制球腔菌Mycosphaerella孢子的萌發(fā)以及菌管的形成[10]。還有少量文獻報道黏質(zhì)沙雷氏菌能夠抑制植物生長，黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的代謝產(chǎn)物粗提物對馬唐Digitaria sanguinalis有一定的抑制作用[11]，部分黏質(zhì)沙雷氏菌及S.proteamaculan菌株能引起植物超敏反應(yīng)[12]，其次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素也具備一定的除藻活性[1314]。

本試驗在室內(nèi)條件下測定了黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵液和活體顆粒劑對6種玉米田常見雜草的除草活性，以期為今后篩選除草活性物質(zhì)和開發(fā)新型微生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供。

供試雜草：馬唐Digitaria sanguinalis、虎尾草Chloris virgata、反枝莧Amaranthus retroflexus、稗草Echinochloa crusgalli、苘麻Abutilon theophrasti、牽牛Ipomoea nil，以上雜草種子均于2017年9月在保定市南堤路采集。

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，瓊脂粉15 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，用NaOH將pH調(diào)至7～7.5。

發(fā)酵液培養(yǎng)基：不添加瓊脂粉的液體LB培養(yǎng)基。

試驗藥劑：蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;酵母膏，北京太陽生物科技有限公司;高嶺土，保定化輕公司;粗面粉，保定江城面粉廠。

試驗儀器：高溫濕熱滅菌鍋，北方華粵貿(mào)易有限公司;恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司;恒溫振蕩器，濕法制粒機，北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將保存在-80℃冰箱中的黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株的凍干菌粉接種到固體LB培養(yǎng)基上，放入溫度為28℃，濕度為24%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)48 h，待長出單菌落后備用。

1.2.2 菌懸液和發(fā)酵液的制備

用接種針挑取固體培養(yǎng)基上的 Ha1 菌株單菌落接入100 mL滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，作為菌懸液。

取1 mL培養(yǎng)48 h的菌懸液放入150 mL滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，作為發(fā)酵液。

1.2.3 發(fā)酵菌數(shù)的測定

平板計數(shù)法：取0.1 mL待測菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36 h后，測定單菌落數(shù)目。

1.2.4 顆粒劑的制備

將Ha1發(fā)酵液用無菌水進行梯度稀釋（10-1～10-8），之后分別吸取0.1 mL不同濃度的發(fā)酵液均勻涂布在固體LB培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況，找出制作顆粒劑最適的發(fā)酵液濃度，即1010 cfu/mL。將粗面粉和高嶺土置于171℃高溫干熱滅菌3 h，待其冷卻后，取400 g粗面粉，200 g高嶺土放入白瓷盤內(nèi)充分混勻，再向內(nèi)緩慢加入400 mL培養(yǎng)了24 h，含1010 cfu/mL的黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵液，充分混合制成生面團。將制作好的生面團放入濕法制粒機中，擠壓制造成顆粒劑，自然晾干后裝入自封袋中，在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 供試雜草的培養(yǎng)

將顆粒飽滿、無損傷的馬唐、反枝莧、稗草、虎尾草、牽牛、苘麻種子進行催芽。各取30～50粒上述雜草種子置于培養(yǎng)皿中，加入適量的1.5%次氯酸鈉消毒7 min，倒掉次氯酸鈉，用滅菌的蒸餾水沖洗3次，最后將消毒的雜草種子放入鋪有滅菌濾紙片的培養(yǎng)皿中，加入適量清水浸沒種子，置于光照培養(yǎng)箱中，待種子發(fā)芽后備用。在長×寬×高為7 cm×7 cm×8 cm的小花盆中放入30 g左右的蛭石，將盛有蛭石的小花盆放到長×寬×高為32 cm×45 cm×15 cm的塑料盒中，在塑料盒中加入約3 L自來水，待小花盆中的蛭石浸濕后用鑷子點種雜草種子，每個小花盆中均勻埋入10粒出芽整齊的種子，深度約為1 cm。將塑料盒用保鮮膜封口，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃，光周期L∥D=12 h∥12 h，相對濕度75%。

1.2.6 Ha1菌株發(fā)酵液的除草活性測定

將發(fā)酵72 h的黏質(zhì)沙雷氏菌菌液進行121℃滅菌和不滅菌兩種處理。取2 mL不同處理的菌液均勻地噴灑到2～3葉期的馬唐、稗草、反枝莧、虎尾草、苘麻和牽牛的莖和葉片上，設(shè)置清水處理作為空白對照，每個處理設(shè)4組重復。7 d后觀察雜草莖和葉片的受害癥狀并測量鮮重，根據(jù)以下公式計算鮮重防效。

鮮重防效=（對照組鮮重-處理組鮮重）對照組鮮重×100%。

1.2.7 Ha1菌株活體顆粒劑的除草活性測定

顆粒劑填埋法：將制備好的顆粒劑與滅菌蛭石按照體積比6∶10的比例攪拌均勻，每個小花盆內(nèi)裝入48 g顆粒劑與蛭石的混合物，即每個小花盆內(nèi)含有18 g顆粒劑和30 g滅菌蛭石，然后放入塑料盒中，加入3 L自來水，待蛭石充分浸濕后，每個小花盆內(nèi)均勻點種10粒已發(fā)芽的雜草種子。每個處理設(shè)4次重復，設(shè)置無活體顆粒劑的蛭石種植雜草作為空白對照，待空白對照雜草生長至2～3葉期后測量鮮重防效。

顆粒劑撒施法：在每一顆雜草種子周圍撒施0.05 g顆粒劑，每個處理設(shè)4次重復，設(shè)置無活體顆粒劑蛭石種植的雜草作為空白對照。待空白對照雜草生長至2～3葉期時測量鮮重防效，鮮重防效計算公式同1.2.6。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 軟件和DPS軟件進行數(shù)據(jù)整理和差異顯著性方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ha1菌株發(fā)酵液的除草活性測定

Ha1菌株發(fā)酵液莖葉噴霧處理的雜草3～5 d后出現(xiàn)萎蔫失綠和干枯等癥狀。未滅菌處理與滅菌處理的黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵液對供試的6種玉米田常見雜草的平均防效分別為47.88%和47.42%，差異并不顯著（表1）。未滅菌處理的Ha1菌株發(fā)酵液對反枝莧、馬唐、苘麻的防效分別為75.55%、62.10%、52.67%;滅菌處理的Ha1菌株發(fā)酵液對反枝莧、馬唐、苘麻的防效分別為68.36%、50.18%、55.72%。對Ha1菌株發(fā)酵液對雜草鮮重的防效進行方差分析得出（表2），未滅菌和滅菌兩種處理組間，處理組內(nèi)亞組間差異顯著水平均大于0.05，說明本試驗處理組間以及處理組內(nèi)各亞組間差異均不顯著。本試驗測定的6種玉米田常見雜草對黏質(zhì)沙雷氏菌Ha1菌株發(fā)酵液的敏感性依次為：反枝莧、馬唐、苘麻、牽牛、稗草和虎尾草。