劉 冰，李 敏，李雪賢，尹桂軍，王 濤，于 杰，李 楠，楊 峰，劉桂芹，吳帥帥,*

（1.國(guó)家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東東阿 252201；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東省驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，山東聊城 252059）

隨著驢產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，我國(guó)驢集約化飼養(yǎng)程度也越來越高，但繁殖理論和技術(shù)水平落后已成為影響驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸因素[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)母驢生殖生理研究較少，驢繁殖技術(shù)總體落后于其他家畜。目前，國(guó)內(nèi)外驢的人工授精技術(shù)方案主要借鑒馬的相關(guān)研究，但和母馬相比，母驢的發(fā)情時(shí)間隨季節(jié)變化而不同，其發(fā)情和排卵時(shí)間規(guī)律難以掌握，增加了配種技術(shù)人員的工作難度。對(duì)于規(guī)?；B(yǎng)驢場(chǎng)而言，只能靠增加技術(shù)人員數(shù)量，才能在規(guī)定時(shí)間完成配種任務(wù)，但會(huì)增加投入、降低經(jīng)濟(jì)效益。目前，驢的鮮精人工授精技術(shù)在我國(guó)部分地方得到推廣應(yīng)用[2]，而有關(guān)驢凍精的應(yīng)用情況在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。凍精輸精技術(shù)是絕大多數(shù)家畜遺傳改良的主要技術(shù)手段[3]。據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，優(yōu)質(zhì)種公牛的精液冷凍和人工授精技術(shù)對(duì)美國(guó)奶牛群體遺傳改良的貢獻(xiàn)高達(dá)97%[4]。因此，利用驢的定時(shí)輸精技術(shù)就成為必然趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)在規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化德州驢養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)開展驢凍精定時(shí)輸精試驗(yàn)，以期提高驢凍精使用效率，確保最佳定時(shí)輸精方法，規(guī)范人工授精技術(shù)、指導(dǎo)驢養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)，為更深入探討驢發(fā)情期的繁殖機(jī)理提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 B 超機(jī)（KX 5600，5.0 MHz）購(gòu)自徐州凱信電子設(shè)備有限公司；精子電腦數(shù)位分析系統(tǒng)（AnDro Vision）購(gòu)自德國(guó)MINITUBE 公司；精子密度儀（RS 232）購(gòu)自德國(guó)MINITUBE 公司；精子程序冷凍儀（Digitcool）購(gòu)自德國(guó)MINITUBE 公司；電熱恒溫水槽（DK-8B）購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2017—2018 年在山東東阿國(guó)家黑毛驢繁育中心（北緯 36°33'，東經(jīng) 116°25'）篩選253 頭3～7 歲健康德州母驢和5 頭3～5 歲體格健碩、體重在400～450 kg 的能繁種公驢開展試驗(yàn)。

1.3 公驢凍精制作 通過假陰道法采集種公驢精液，將精液濾除凝膠部分后置于38℃預(yù)熱的量筒中，讀取精液體積。用精子密度儀測(cè)量精子密度，先加入3 mL 生理鹽水于比色皿中，歸零，后于精液液面下中部取120 μL原精液加入比色皿中，混合均勻，測(cè)量密度。同時(shí)，精液液面以下中間部位取7 μL 原精液置于預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于帶有38℃恒溫板的顯微鏡下用計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀（Computer-assisteD Sperm Analysis，CASA）檢測(cè)精液活力。每個(gè)樣本檢測(cè)5 個(gè)視野，記錄前進(jìn)式活力和快速前進(jìn)式活力。檢測(cè)密度≥1.5×108個(gè)/mL，直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)式活力≥0.7 的精液用于凍精制作。向原精液中按1:1 的比例加入商用馬屬動(dòng)物專用稀釋液，1 850 r/min 離心10 min，取全部上清液留用。使用精液凍存液重懸精子[5]，使用細(xì)管灌裝打印機(jī)分裝精液至0.5 mL 凍精細(xì)管中，4℃冷藏柜中平衡2～3 h，使用全自動(dòng)冷凍儀快速冷凍精子，制作好的凍精規(guī)格為每支0.5 mL，總精子數(shù)為1 億個(gè)。經(jīng)隨機(jī)抽檢，38℃水浴解凍30 s 后的解凍活力＞0.35 視為合格，并投入液氮長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?，使用前進(jìn)行隨機(jī)抽檢。

1.4 外源性GnRH 藥物促排處理 繁殖季節(jié)內(nèi)每日10:00，通過B 超機(jī)檢測(cè)試驗(yàn)?zāi)阁H的卵泡發(fā)育情況，具體方法：將母驢保定在四柱欄內(nèi)，技術(shù)人員手戴長(zhǎng)臂手套掏凈直腸內(nèi)糞便，手持B 超機(jī)探頭進(jìn)入直腸，找到卵巢所在位置，檢測(cè)卵巢內(nèi)卵泡大小和觀察子宮形態(tài)。根據(jù)超聲波圖像取2 條垂直直徑的平均值作為卵泡直徑。試驗(yàn)選取卵泡直徑≥30 mm 的發(fā)情母驢51 頭，隨機(jī)分為2 組，其中31 頭母驢進(jìn)行肌肉注射GnRH 藥物（由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）0.8 mL，當(dāng)天記為第0 天（D010:00）；另外20 頭母驢作為對(duì)照組，肌肉注射0.8 mL生理鹽水。技術(shù)人員于D110:00、D120:00、D210:00對(duì)2 組母驢進(jìn)行排卵檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析不同時(shí)間段驢群的排卵率。

1.5 人工授精 將待配母驢的外陰清洗消毒并用無菌擦手紙擦干后，技術(shù)人員手戴無菌的長(zhǎng)臂手套，將輸精管頭部攥于手心，手背涂抹無菌的潤(rùn)滑劑后伸入陰道穹隆內(nèi)，輸精管穿過子宮頸進(jìn)入子宮體。技術(shù)人員將佩戴長(zhǎng)臂手套的手臂抽出并伸入直腸內(nèi)。通過直腸把握的方法，將輸精管頭部引導(dǎo)至與優(yōu)勢(shì)卵泡同側(cè)的子宮角處進(jìn)行輸精[6]。當(dāng)兩側(cè)卵巢均存在優(yōu)勢(shì)化卵泡時(shí)，選擇卵泡直徑最大的一側(cè)。經(jīng)B 超檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有生殖系統(tǒng)疾病的母驢不進(jìn)行配種。

1.6 驢凍精不同輸精方法

1.6.1 單次輸精時(shí)，不同輸精時(shí)間點(diǎn)及輸精劑量對(duì)母驢情期受孕率的影響 參考馬屬動(dòng)物輸精后建立輸卵管精子庫(kù)的時(shí)間[7]，結(jié)合1.4 中GnRH 藥物促排卵規(guī)律性，本研究在驢群集中排卵發(fā)生前的4 h（D116:00）、2 h（D118:00）、0 h（D120:00）分別對(duì)母驢群開展不同輸精劑量的單次輸精試驗(yàn)（10、5、2 支/頭）。

1.6.2 2 次輸精時(shí)，不同輸精劑量對(duì)母驢情期受孕率的影響 參考GnRH 藥物促排卵的規(guī)律性，試驗(yàn)將單次輸精法改為2 次輸精法，具體方法為將在D120:00 的單次輸精改為在D120:00 和D204:00 各進(jìn)行1 次輸精。根據(jù)2 次輸精中分別使用的凍精細(xì)管支數(shù)n1、n2，將試驗(yàn)組記為n1+n2組。本試驗(yàn)的分組記為5+5 支組（31 頭）、2+2 支組（32 頭）、1+1 支組（21 頭）。

同時(shí)，考慮到自然狀態(tài)下母驢群無法實(shí)現(xiàn)集中發(fā)情配種，試驗(yàn)將規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)情、排卵并采用同一方法輸精的母驢視為同一試驗(yàn)組。試驗(yàn)在第1 次輸精前和D212:00 對(duì)輸精母驢進(jìn)行排卵檢測(cè)，提前排卵和未排卵母驢不計(jì)入試驗(yàn)組。

1.7 妊娠診斷 妊娠診斷在輸精母驢排卵后的第14 天進(jìn)行，排卵后16 D 進(jìn)行復(fù)檢妊娠狀況[8]。未孕母驢進(jìn)入下一次發(fā)情期后，繼續(xù)參與后續(xù)試驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 軟件中的卡方檢驗(yàn)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 外源性GnRH 藥物注射對(duì)母驢情期排卵的影響 卵泡直徑≥30 mm 的母驢經(jīng)GnRH 藥物處理后在不同時(shí)間段的區(qū)間排卵率如表1 所示，GnRH 注射組34～48 h（D120:00—D208:00）排卵率高達(dá)80.65%，顯著高于對(duì)照組。而＞48 h 時(shí)，對(duì)照組的排卵率與GnRH 注射組無顯著差異。

表1 經(jīng)GnRH 藥物處理后母驢在不同時(shí)間段的區(qū)間排卵率

如圖1 所示，在34～48 h 每2 h 的排卵率分布為4.00%（1/25）、12.00%（3/25）、24.00%（6/25）、28.00%（7/25）、20.00%（5/25）、8.00%（8/25）、4.0%（1/25），各時(shí)間段無顯著性差異。

圖1 GnRH 處理后34～48 h 不同時(shí)間段的排卵率分布

2.2 單次輸精法的情期受孕率研究 如圖2 所示，在D116:00，不同凍精細(xì)管使用支數(shù)（10、5、2 支/ 頭）對(duì)應(yīng)的情期受孕率分別為13.64%（3/22）、9.52%（3/21）、10.53%（2/19）。在D118:00，不同凍精細(xì)管使用支數(shù)（10、5、2 支/頭）對(duì)應(yīng)的情期受孕率分別為21.05%（4/19）、15.38%（4/26）、13.04%（3/23）。D120:00 不同凍精細(xì)管使用支數(shù)（10、5、2 支/頭）對(duì)應(yīng)的情期受孕率分別為29.41%（10/34）、23.81%（5/21）、14.71%（5/34）。輸精時(shí)間距集中排卵期（D120:00—D210:00）越近，母驢單次輸精后的情期受孕率呈增加趨勢(shì)。但可能因?yàn)閰⑴c試驗(yàn)的樣本少，導(dǎo)致試驗(yàn)中各組情期受孕率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，隨著輸精劑量增加，母驢情期受孕率出現(xiàn)升高趨勢(shì)，但各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 情期單次輸精時(shí)不同輸精支數(shù)和時(shí)間對(duì)情期受孕率的影響

2.3 2 次輸精法的情期受孕率影響 如表2 所示，隨著輸精支數(shù)的增加，情期受孕率呈上升趨勢(shì)。其中，5+5 支組、2+2 支組、1+1 支組的情期受孕率分別為35.48%、31.25%、19.05%，組間無顯著差異。同樣輸精劑量下，多次輸精情期受孕率較單次輸精時(shí)的情期受孕率高。其中，5+5 支組的情期受孕率顯著高于2 支組。

表2 輸精方法和凍精細(xì)管使用支數(shù)對(duì)情期受孕率的影響 %

3 討 論

目前，驢排卵時(shí)間主要依據(jù)直腸檢查卵泡大小、形態(tài)及軟硬程度來綜合判斷[9]。但對(duì)于卵泡軟硬程度的觸感與排卵時(shí)間的判斷主要依賴于技術(shù)人員個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)考慮到母驢發(fā)情和排卵易受季節(jié)和外界環(huán)境（如溫度、光照等）影響[10]，母驢的排卵時(shí)間很難準(zhǔn)確把握。因此，首先需要從母驢的發(fā)情規(guī)律入手，了解其內(nèi)分泌特點(diǎn)，然后根據(jù)卵泡和子宮條件，使用外源激素控制排卵進(jìn)程，達(dá)到定時(shí)輸精目的[11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在德州驢規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中卵泡直徑≥30 mm 的母驢在肌肉注射GnRH 藥物后的34～48 h 內(nèi)集中排卵，區(qū)間排卵率大于80%。對(duì)母驢排卵區(qū)間的準(zhǔn)確控制為凍精定時(shí)輸精技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

精卵結(jié)合形成合子的過程即為受精，有受精能力的精子和卵子在受精過程中缺一不可。驢鮮精輸精時(shí)間與排卵時(shí)間間隔不超過48 h 時(shí)，驢的情期受孕率（40%左右）不受影響，且驢鮮精隔日輸精技術(shù)已在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用[2,5]。與鮮精、低溫冷藏精液不同的是，盡管驢冷凍精液具有良好的解凍后活力[12-14]，但本試驗(yàn)中凍精最佳情期受孕率（35.48%）仍低于鮮精（40% 左右）[2]；目前關(guān)于驢凍精在母畜體內(nèi)保持受精能力的時(shí)間并沒有明確結(jié)論。Samper 等[15]研究發(fā)現(xiàn)冷凍保存的馬精子輸精后到達(dá)輸卵管速度以及與輸卵管上皮的結(jié)合能力都弱于鮮精，而引起的炎性反應(yīng)強(qiáng)于鮮精[16]。同時(shí)，相比于鮮精，冷凍精液的制作過程會(huì)損傷精子機(jī)能，影響精子庫(kù)的正常建立，縮短了輸入母馬體內(nèi)的精子保持受精能力的時(shí)間，這些現(xiàn)象都說明凍精體內(nèi)存活時(shí)間短于鮮精。基于上述原因，通常認(rèn)為凍精輸精時(shí)間要盡可能接近排卵時(shí)間，這樣才可能獲得較好的情期受孕率。母馬研究表明，在輸精4 h 后就可以在輸卵管建立精子庫(kù)，且凍精輸精時(shí)間和排卵時(shí)間不超過±12 h 時(shí)，可以得到令人接受的情期受孕率。驢繁殖從業(yè)者實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，凍精輸精時(shí)間距離母驢排卵時(shí)間±8 h 內(nèi)可獲得較好的受孕率。本研究也發(fā)現(xiàn)輸精時(shí)間越接近驢群集中排卵期時(shí)，驢群的情期受孕率呈上升趨勢(shì)。

根據(jù)Seime 等[17]的研究理論，當(dāng)發(fā)情期內(nèi)的輸精時(shí)間固定后，母畜發(fā)生多次排卵有利于情期的受孕，這是因?yàn)槎啻闻怕寻l(fā)生時(shí)間接近輸精時(shí)間的概率要大于單次排卵。根據(jù)以上理論，筆者推測(cè)當(dāng)母驢排卵發(fā)生在確定的時(shí)間范圍內(nèi)時(shí)，2 次輸精時(shí)間接近排卵時(shí)間的概率大于單次輸精，因此2 次輸精有可能對(duì)情期受孕率有利。對(duì)此，本研究選擇在D120:00 和D204:00 進(jìn)行2 次定時(shí)輸精，旨在使精子保持受精能力的時(shí)間盡可能涵蓋整個(gè)集中排卵區(qū)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)5+5 支組、2+2 支組的情期受孕率均大于30%，高于10 支組（29.41%）、5 支組（23.81%），但差異并不顯著。單次輸精改為2次輸精后得到了較為理想的情期受孕率，與Avanzi 等[18]研究結(jié)果一致，但可能因?yàn)閰⑴c試驗(yàn)的樣本少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后各組受孕率無顯著差異。

在母馬的宮腔鏡輸精試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，精子庫(kù)中精子需維持一定數(shù)量才能實(shí)現(xiàn)其高效受精能力，當(dāng)精子量低于這個(gè)閾值時(shí)，受精能力會(huì)降低。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，凍精輸精時(shí)間接近排卵時(shí)間時(shí)，輸精支數(shù)由10 支降為5、2 支時(shí)，情期受孕率隨之下降。2 次輸精中，1+1 支組的情期受孕率僅為19.05%，低于2+2 支組（31.25%）和5+5 支組（35.48%），表明輸精次數(shù)和輸精計(jì)量都會(huì)對(duì)情期受孕率產(chǎn)生影響。因此，筆者認(rèn)為對(duì)健康母驢發(fā)情周期進(jìn)行監(jiān)控、預(yù)測(cè)排卵的同時(shí)，還需及時(shí)將足夠數(shù)量、一定活力的精子導(dǎo)入子宮內(nèi)，這些是決定人工授精成功關(guān)鍵因素。

4 結(jié) 論

綜上所述，進(jìn)行驢的凍精輸精時(shí)，要求盡量縮短輸精時(shí)間與排卵發(fā)生時(shí)間的間隔。通過藥物對(duì)母驢排卵時(shí)間的準(zhǔn)確掌握，為凍精定時(shí)輸精技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。發(fā)情母驢經(jīng)GnRH 藥物促排處理后，采用2 次定時(shí)輸精法可以實(shí)現(xiàn)在提高凍精利用效率的基礎(chǔ)上，獲得較為理想的情期受孕率，適用于規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)。