殺螟丹和Cr6+復(fù)合污染對赤子愛勝蚓的毒性研究

朱艷，高晨昕，孟雨婷，肖嫻，劉建國，趙遠(yuǎn)

（常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州213164）

我國是農(nóng)業(yè)大國，多數(shù)重金屬和農(nóng)藥作用于土壤造成的環(huán)境污染日益加重，間接影響了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量，最終危害到人體健康[1?2]。殺螟丹是使用最廣泛的天然殺蟲劑衍生物之一[3]，有研究表明，殺螟丹的使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的人體器官衰竭[4?5]。有些人認(rèn)為殺螟丹是安全無害的，因此對其生態(tài)毒性的研究較少，但殺螟丹屬于殺蠶素類農(nóng)藥[6]，該毒素能與生物體內(nèi)乙酰膽堿受體結(jié)合，阻斷神經(jīng)質(zhì)的傳遞，導(dǎo)致神經(jīng)中樞紊亂，昆蟲接觸藥劑后會失去侵害作物的狀態(tài)，蟲體軟化、癱瘓，直至死亡[7]。Cr作為地下水和土壤中第二常見的金屬污染物，其會對土壤中酶活性及微生物活性產(chǎn)生影響，積累在植物中的Cr也會通過食物鏈進(jìn)入人體或動物體造成嚴(yán)重傷害[8]。Cr6+是土壤污染因子中重點(diǎn)關(guān)注的重金屬污染物之一，是公認(rèn)的能威脅人體健康的毒性較大的致癌離子，可引起皮炎、視力減退和皮膚潰爛等相關(guān)病癥[9]。目前關(guān)于單一污染物污染效應(yīng)的研究較多，但在實(shí)際情況下大多是由多種復(fù)合污染物共同作用導(dǎo)致的環(huán)境污染。關(guān)于農(nóng)田土壤中Cr6+與殺螟丹共存對生物的復(fù)合影響仍鮮有報道。

盡管復(fù)合污染已成為當(dāng)前環(huán)境污染研究的熱點(diǎn)問題，但依然是基于土壤中單一污染物的生態(tài)效應(yīng)，實(shí)際環(huán)境中存在的大部分是多種污染物共同作用的復(fù)合污染，而有關(guān)復(fù)合污染體系的生態(tài)風(fēng)險評估方法依然缺乏。目前，國內(nèi)外針對復(fù)合污染聯(lián)合作用的研究工作也取得了相應(yīng)的進(jìn)展。在研究恩諾沙星和銅復(fù)合污染后對蚯蚓的影響中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合污染對蚯蚓消化酶的影響表現(xiàn)出抑制作用[10]。蔣曼等[11]研究表明毒死蜱和甲萘威分別對斑馬魚表現(xiàn)出高毒和低毒，二者協(xié)同作用于斑馬魚。在對甲酚和2，4?二叔丁基酚作用于斑馬魚的單一毒性研究中，二者分別表現(xiàn)為中毒和高毒，且在24、48、96 h時為協(xié)同作用[12]。復(fù)合污染物之間的聯(lián)合毒性效應(yīng)對于生態(tài)環(huán)境存在很大的潛在威脅。目前，復(fù)合污染的聯(lián)合毒性研究成果主要集中于對生物體的急性致死層面，而在亞致死劑量下對于生物體機(jī)體損傷層面的研究甚少。

蚯蚓作為土壤系統(tǒng)中關(guān)鍵組成部分，其在土壤中長期生存，能夠起到增強(qiáng)土壤微生物活性、影響土壤有機(jī)物轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分元素釋放的作用[13]，通常作為對土壤中物質(zhì)進(jìn)行毒性檢測的生物之一[14?15]。目前多數(shù)生態(tài)風(fēng)險評估方法集中于受試生物的個體水平，低層次的生理生化水平的效應(yīng)評估相對較少。針對重金屬和農(nóng)藥對土壤生態(tài)環(huán)境的聯(lián)合毒性危害，本文選取無脊椎動物赤子愛勝蚓作為土壤生物的代表研究對象，以殺螟丹和Cr6+單一及二元復(fù)合下的混合物為樣本，通過測試蚯蚓死亡率和生理生化指標(biāo)的變化來表征其毒性大小，以考察重金屬與農(nóng)藥的聯(lián)合毒性效應(yīng)，為深入研究重金屬與農(nóng)藥復(fù)合污染的作用機(jī)理提供基礎(chǔ)性的研究方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試生物

赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）購自江蘇某蚯蚓養(yǎng)殖場，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室預(yù)先培養(yǎng)一段時間后，選擇體型相似、體質(zhì)量為0.3 g左右、性成熟的成年蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 污染物添加方法

通過預(yù)試驗(yàn)，依據(jù)全部致死最低濃度和全部存活的最高濃度，不斷縮小濃度設(shè)定區(qū)間，最后確定正式試驗(yàn)濃度區(qū)間范圍[16]。

空白對照（CK）：準(zhǔn)確吸取4 mL去離子水均勻淋灑于墊有雙圈定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，空白組不進(jìn)行任何染毒處理。

殺螟丹添加方法：使用殺螟丹標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97.8%，購于上海市農(nóng)藥研究所）以去離子水配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L?15個濃度。將雙層雙圈定性濾紙平鋪在玻璃培養(yǎng)皿中，吸取4 mL試驗(yàn)用濃度的溶液均勻淋灑于雙層雙圈濾紙上，以單位面積濾紙上的量代表試驗(yàn)中蚯蚓吸收到的殺螟丹濃度，分別為0.031 5、0.063、0.094、0.126、0.157μg·cm?2。

Cr6+添加方法：使用烘干的重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，購于國藥集團(tuán)有限公司）以去離子水配制成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L?15個濃度。在玻璃培養(yǎng)皿中鋪雙圈定性濾紙，并吸取稀釋好的試驗(yàn)用濃度的溶液4 mL均勻地淋灑在雙層雙圈濾紙上，以單位面積濾紙上的量代表試驗(yàn)中蚯蚓吸收到的Cr6+濃度，分別為0.063、0.126、0.189、0.252、0.315μg·cm?2。

復(fù)合藥劑添加方法：殺螟丹和Cr6+的復(fù)合試驗(yàn)中，先準(zhǔn)確吸取2 mL試驗(yàn)濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L?1）的殺螟丹溶液均勻淋灑于玻璃培養(yǎng)皿的雙層雙圈濾紙上，再加入2 mL濃度為2 mg·L?1的重鉻酸鉀溶液。

1.3 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

在預(yù)先培養(yǎng)的蚯蚓中挑取性成熟的成年蚯蚓，并將蚯蚓表面水分用紙擦干，放入底部鋪有濕潤濾紙的燒杯中，迅速用保鮮膜封口并扎出大小均勻的小孔。隨后置于濕度為80%的恒溫培養(yǎng)箱（20±1℃）中，于暗處清腸24 h，之后清洗干凈并擦去體表水分。

將雙圈定性濾紙鋪于玻璃培養(yǎng)皿中，精確移取4mL試驗(yàn)濃度的溶液均勻淋灑于濾紙上，取處理好的蚯蚓在不同濃度處理中各放入一條，每濃度處理組設(shè)置10個重復(fù)，同時進(jìn)行空白對照處理。玻璃培養(yǎng)皿用保鮮膜封口并用針扎出大小均勻的小孔，保存于培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度為（20±1）℃、濕度為80%左右，于暗處培養(yǎng)72 h，分別在24、48 h和72 h觀察記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)。

聯(lián)合毒性試驗(yàn)以殺螟丹、Cr6+對蚯蚓的48 h的LC50值作為一個毒性單位，以等對數(shù)間距按照等毒性比為1∶1的混合比例，設(shè)置試驗(yàn)濃度完成聯(lián)合毒性試驗(yàn)，方法同上。

1.4 蚯蚓生理生化指標(biāo)試驗(yàn)

分別采集不同時間經(jīng)上述3種方式不同濃度處理后的蚯蚓樣本，加入蚯蚓9倍質(zhì)量的生理鹽水（0.86%），在冰浴條件下進(jìn)行5 min勻漿，隨后用冷凍離心機(jī)將勻漿好的蚯蚓組織液離心（2 500 r·min?1，10 min，20℃）。保留上清液，稀釋成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)的組織勻漿后，立即測定。

蚯蚓體內(nèi)蛋白含量使用考馬斯亮藍(lán)蛋白測試盒進(jìn)行測定（購于南京建成生物科技研究所），參照試劑盒說明方法進(jìn)行操作。試驗(yàn)分為空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管，空白管中加入雙蒸水，標(biāo)準(zhǔn)管中加入0.563 g·L?1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，測定管中加入處理過的蚯蚓組織勻漿。測定時將樣品加入考馬斯亮藍(lán)顯色液，混勻后靜置10 min，用酶標(biāo)儀（E7031，美國普洛麥格公司）在波長595 nm處測定各管的吸光度值。根據(jù)測得的吸光度，利用公式計算蚯蚓樣本2%濃度組織勻漿液的蛋白含量[17]，如公式（1）所示：

待測樣本蛋白含量（g·L?1）=

超氧化物歧化酶（SOD）活力使用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行測定，以試劑盒（購于南京建成生物科技研究所）說明方法進(jìn)行操作。設(shè)置測定管和對照管，在測定管中加樣品，對照管中加同等體積的雙蒸水，室溫靜置10 min后，用酶標(biāo)儀（E7031，美國普洛麥格公司）在波長550 nm處[18]，測定各管的吸光度值。代入公式（2）計算SOD活力：

總SOD活力（U·mg?1prot）=

過氧化氫酶（CAT）采用可見光法進(jìn)行測定，試驗(yàn)設(shè)置對照管和測定管，以試劑盒（購于南京建成生物科技研究所）說明方法進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀（E7031，美國普洛麥格公司）在波長405 nm處，測定各管的吸光度值[19]。計算方法見公式（3）：

CAT活力（U·mg?1prot）=

丙二醛（MDA）含量采用TBA法進(jìn)行測定，試驗(yàn)設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管和對照管，參照試劑盒（購于南京建成生物科技研究所）說明方法進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀（E7031，美國普洛麥格公司）在波長405 nm處測定各管的吸光度值[20]。計算方法見公式（4）：

MDA含量（nmol·mg?1prot）=

1.5 聯(lián)合毒性效應(yīng)的評價

采用Marking相加指數(shù)法[21]評價殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的聯(lián)合作用類型（表1）。

表1 聯(lián)合毒性評價方法Table 1 Joint toxicity evaluation method

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過Origin 8.5對混合體系中各物質(zhì)濃度與蚯蚓死亡率進(jìn)行非線性擬合，并采用非線性回歸方程計算得出蚯蚓的24、48 h和72 h的LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)

2.1.1 殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的單一毒性

蚯蚓經(jīng)殺螟丹暴露后，中毒癥狀主要表現(xiàn)為軀體顏色加深并且軀體極度延展、失去彈性，部分蚯蚓爬行緩慢、反應(yīng)遲緩、對刺激不敏感。暴露于Cr6+中的蚯蚓在接觸濾紙后出現(xiàn)持續(xù)的扭曲掙扎、軀體充血紅腫，蚯蚓體表滲出黃色液體，之后軀體蜷曲，失去爬行能力，隨著染毒時間延長，蚯蚓身體背部出現(xiàn)小泡，生殖環(huán)腫脹，甚至有糜爛現(xiàn)象。

殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的單一毒性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明兩種藥物對蚯蚓毒性大小有差異，但均隨暴露時間的延長而增強(qiáng)。染毒時間為24 h時，殺螟丹的單一毒性大于Cr6+，其中殺螟丹24 h?LC50值為14.30 mg·L?1，Cr6+24 h?LC50值為104.42 mg·L?1。染毒時間為48 h時，殺螟丹和Cr6+的48 h?LC50分別為12.36 mg·L?1和71.53 mg·L?1，毒性分別增強(qiáng)1.16倍和1.46倍，殺螟丹毒性仍較強(qiáng)，是Cr6+的5.79倍。染毒時間為72 h時，殺螟丹和Cr6+的毒性繼續(xù)增強(qiáng)，其中殺螟丹72 h?LC50值為10.43 mg·L?1，殺螟丹和Cr6+的毒性分別較染毒48 h時增強(qiáng)1.19倍和1.79倍。

表2 殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的單一毒性（mg·L?1）Table 2 Single toxicity of cartap and Cr6+on earthworm（mg·L?1）

2.1.2 殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的二元聯(lián)合毒性

殺螟丹和Cr6+對蚯蚓的二元聯(lián)合毒性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，殺螟丹與Cr6+以等毒性比1∶1配比，暴露24 h時，兩者的LC50值分別是單一暴露時的1.03、1.29倍，相加指數(shù)為?0.75，兩者聯(lián)合顯示拮抗作用。暴露48、72 h時，相加指數(shù)分別為?0.76和?0.38，聯(lián)合作用均表現(xiàn)為拮抗作用，并且拮抗作用在整個暴露過程中呈現(xiàn)先加強(qiáng)后減弱的趨勢。

表3 殺螟丹和Cr6+二元混合體系對蚯蚓聯(lián)合毒性評價結(jié)果Table 3 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cartap?Cr6+to earthworm

2.2 殺螟丹、Cr6+及二元聯(lián)合對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量的影響

殺螟丹、Cr6+單一染毒及二元聯(lián)合染毒對蚯蚓體內(nèi)蛋白含量影響如圖1所示。蚯蚓體內(nèi)蛋白含量在不同染毒時間（24、48、72 h）內(nèi)隨殺螟丹濃度增加的變化趨勢均為先升高后降低，隨著染毒時間的延長，蛋白含量先升高后不變（圖1a），不同暴露時間內(nèi)，各處理組均與CK處理存在顯著差異（P＜0.05）?？梢缘贸龅蜐舛取㈤L時間染毒和高濃度、短時間染毒情況下蚯蚓體內(nèi)蛋白含量受到的影響相似。蚯蚓經(jīng)不同濃度Cr6+染毒后，CK組蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨時間的延長緩慢下降，且大多低于Cr6+染毒的蚯蚓體內(nèi)蛋白含量（圖1b）。暴露24 h時的蛋白含量低于48 h和72 h；暴露48 h時，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨Cr6+濃度增加呈先降低后上升再降低趨勢，在Cr6+濃度為4.0 mg·L?1時達(dá)到最大值1.52 g·L?1，是CK組蚯蚓蛋白含量的1.30倍；在暴露72 h時，蛋白含量變化趨勢為先降低后升高至平穩(wěn)，并且在Cr6+濃度為3.0 mg·L?1時低于CK；不同暴露時間蛋白含量最大值處理組均與CK存在顯著差異（P＜0.05）。蚯蚓經(jīng)殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合染毒后，CK組蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨著時間的延長呈上升趨勢（圖1c）。染毒24 h時，蛋白含量隨染毒濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在0.2 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+時蛋白含量出現(xiàn)最大值，48、72 h時蚯蚓體內(nèi)的蛋白含量基本表現(xiàn)為先降低后升高，最小值分別出現(xiàn)在殺螟丹濃度為0.3 mg·L?1和0.2 mg·L?1時。

2.3 殺螟丹、Cr6+及二元聯(lián)合對蚯蚓體內(nèi)SOD活力的影響

殺螟丹、Cr6+單一染毒及二元聯(lián)合染毒對蚯蚓體內(nèi)SOD活力的影響變化如圖2所示。在染毒24 h時，SOD活力隨殺螟丹濃度增加表現(xiàn)為先降低后升高，48 h時則表現(xiàn)為先升高后降低，染毒72 h時SOD活力持續(xù)降低，且各處理均與CK存在顯著差異（圖2a）（P＜0.05）。可能是隨著染毒時間的延長，蚯蚓體內(nèi)環(huán)境遭到破壞，損傷程度增強(qiáng)，導(dǎo)致在72 h時SOD活力不斷降低。蚯蚓經(jīng)Cr6+染毒后SOD活力在24 h時最高（圖2b），1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L?1處理分別是CK組的145%、156%、174%、148%和133%，隨著Cr6+處理濃度的增加，蚯蚓體內(nèi)SOD活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，最大值出現(xiàn)在Cr6+濃度為3.0 mg·L?1時，較CK增加了74.12%，可能由于高濃度污染使蚯蚓機(jī)體嚴(yán)重受損。不同暴露時間下，各處理均與CK存在顯著差異（P＜0.05），72 h時除CK外各處理并無顯著差異。蚯蚓經(jīng)殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合染毒后，24 h時SOD活力隨處理濃度的增加持續(xù)升高，各處理組分別較CK升高了10.79%、15.10%、22.07%、28.07%和41.89%（圖2c），并在0.5 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時達(dá)到此試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的最大值。染毒48 h時，SOD活力隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0.3 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時SOD活力達(dá)到最大值，是CK組的1.63倍。染毒72 h時，蚯蚓體內(nèi)SOD總活力大幅度降低，并在濃度為0.2 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+時出現(xiàn)最大值。

2.4 殺螟丹、Cr6+及二元聯(lián)合對蚯蚓體內(nèi)CAT活力的影響

殺螟丹、Cr6+單一染毒及二元聯(lián)合染毒對蚯蚓體內(nèi)CAT活力的影響變化如圖3所示。蚯蚓經(jīng)殺螟丹單一染毒后，不同濃度處理導(dǎo)致其體內(nèi)CAT活力變化趨勢不同，CK體內(nèi)CAT活力較穩(wěn)定，隨時間延長無明顯波動（圖3a）。染毒24 h時，CAT活力被誘導(dǎo)而迅速上升，此時蚯蚓體內(nèi)氧自由基增加，減少了細(xì)胞膜的氧化損傷，屬于機(jī)體對脅迫環(huán)境的適應(yīng)反應(yīng)。48 h時CAT活力被抑制，降至與CK相近，72 h時CAT活力相對48 h略升高。各時間峰值濃度均與CK存在顯著差異（P＜0.05）。蚯蚓經(jīng)Cr6+染毒后在Cr6+濃度為2 mg·L?1時達(dá)到最大值，在暴露時間（24、48、72 h）內(nèi)隨Cr6+濃度增加CAT活力整體呈現(xiàn)倒“U”形變化。不同暴露時間內(nèi)，各處理均與CK存在顯著差異（P＜0.05）。蚯蚓經(jīng)殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合染毒后，隨著暴露時間的延長，CK蚯蚓體內(nèi)CAT活力較穩(wěn)定（圖3c）；各處理組CAT活力變化有明顯差異。蚯蚓體內(nèi)CAT活力在染毒24 h時表現(xiàn)為先降低后升高再降低，在0.1 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時達(dá)到最大值；染毒48 h時，各處理的CAT活力均高于CK，隨濃度增加呈先升高后降低的趨勢，在0.2 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時達(dá)到最大值，并較24 h升高了45.89%；染毒72 h時，蚯蚓體內(nèi)CAT活力變化趨勢與48 h相似，最大值在0.3 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時出現(xiàn)。

2.5 殺螟丹、Cr6+及二元聯(lián)合對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響

殺螟丹、Cr6+單一染毒及二元聯(lián)合染毒對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響變化如圖4所示。蚯蚓經(jīng)不同濃度殺螟丹單一染毒后，在染毒時間24、48、72 h時，其體內(nèi)MDA含量整體降低（圖4a）。染毒24 h和48 h時，隨染毒濃度增加MDA含量表現(xiàn)為先升高后降低，染毒72 h時，MDA含量與CK差異不顯著。除72 h外，其余暴露時間的峰值濃度均與CK存在顯著差異（P＜0.05）。蚯蚓經(jīng)不同濃度Cr6+染毒后，染毒24 h時其體內(nèi)MDA含量隨Cr6+濃度增加呈先升高后降低的趨勢（圖4b）；染毒48 h時MDA含量有所升高；染毒72 h時，MDA含量在Cr6+濃度為2.0 mg·L?1時達(dá)到最大值，高于CK組77.12%。蚯蚓經(jīng)殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合染毒后，在長時間暴露情況下，CK蚯蚓體內(nèi)MDA含量整體趨勢平穩(wěn)（圖4c）。在暴露時間內(nèi)（24、48、72 h）MDA含量變化差異明顯，染毒24 h時，處理組MDA含量均顯著高于CK（P＜0.05），在0.1 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時達(dá)到最大值，后逐漸降低。染毒48 h時，各處理MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在0.3 mg·L?1殺螟丹+2 mg·L?1Cr6+濃度時達(dá)到最大值。

3 討論

殺螟丹單一染毒時，蚯蚓體內(nèi)蛋白變化具有規(guī)律性，殺螟丹濃度的增加使蛋白含量在染毒時間（24、48、72 h）內(nèi)先升高后降低，長時間染毒后蛋白含量總體升高后趨于平穩(wěn)。染毒的蚯蚓體內(nèi)蛋白含量均比CK蛋白含量高，可能是由于污染物的刺激，導(dǎo)致蚯蚓內(nèi)環(huán)境紊亂、功能受損，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，如C?反應(yīng)蛋白（CRF）、纖維連接蛋白（Fn）等會引起蚯蚓體內(nèi)蛋白總量的升高[22?23]。蚯蚓體內(nèi)SOD活力在低濃度短時間內(nèi)被誘導(dǎo)，但在72 h時持續(xù)下降，原因可能是在遭受脅迫后機(jī)體激發(fā)了體內(nèi)SOD酶以維持自身氧化平衡，但隨著時間的延長和污染物濃度的增高，機(jī)體損傷嚴(yán)重，SOD活力逐漸降低[24]。本研究中蚯蚓體內(nèi)CAT活力在殺螟丹染毒初期顯著高于CK組，隨著殺螟丹濃度的升高和時間的延長，CAT活力受到抑制，甚至失活[25]。蚯蚓體內(nèi)MDA含量的變化具有規(guī)律性，隨著殺螟丹濃度的增加MDA含量先升高后降低，隨著染毒時間的延長MDA含量降低，原因可能是在殺螟丹染毒初期，蚯蚓體內(nèi)足夠的氧自由基導(dǎo)致膜的過氧化，致使MDA含量上升，但隨著時間的延長，過剩的活性氧在抗氧化酶活性最高時得到清除，使蚯蚓體內(nèi)活性氧的生成和去除達(dá)到平衡，MDA含量逐漸降低趨于平穩(wěn)[26]。

Cr6+單一染毒時，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量隨著Cr6+濃度的增加先降低后升高，總體大于CK組中蛋白含量，且隨著染毒時間延長到48 h時蛋白含量呈降低的趨勢，推測可能因?yàn)轵球鹃L時間暴露于Cr6+中，重金屬染毒損害了機(jī)體功能，從而阻礙蛋白的生成來源及合成[27]。在暴露72 h時，蛋白含量變化趨勢為先降低后升高至平穩(wěn)，并且在Cr6+濃度為3.0 mg·L?1時低于CK，可能是機(jī)體阻礙蛋白質(zhì)的產(chǎn)生來源，從而造成蛋白含量的降低[28]。經(jīng)Cr6+單一染毒后蚯蚓體內(nèi)SOD活力隨Cr6+濃度增加先升高后降低，并且隨著染毒時間的延長而降低，說明前期Cr6+的脅迫或代謝過程產(chǎn)生的超氧陰離子，提高了SOD活力[29]。但是長時間的重金屬毒害作用，使蚯蚓體內(nèi)細(xì)胞遭受損傷，影響了細(xì)胞正常生理代謝，導(dǎo)致SOD活力在后期逐漸降低[30]，這與鄭麗萍等[31]在研究重金屬污染對蚯蚓造成的毒性效果中得出的結(jié)論一致。蚯蚓體內(nèi)CAT活力隨著Cr6+濃度和染毒時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。表明蚯蚓在受到低濃度重金屬污染時，CAT活力會逐漸上升，足以去除機(jī)體受到污染脅迫產(chǎn)生的自由基，此時機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)打開，對環(huán)境變化產(chǎn)生適應(yīng)[32?33]。在遭受長時間染毒情況下，CAT活力得到強(qiáng)烈誘導(dǎo)，Liang等[34]在研究十澳聯(lián)苯酷和納米零價鐵復(fù)合脅迫對蚯蚓體內(nèi)CAT活性的誘導(dǎo)時也得出相似結(jié)果。蚯蚓體內(nèi)MDA含量總體隨著染毒時間的延長而增加，反映了機(jī)體受到污染脅迫后的損傷程度[35]。

殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合以等毒性比1∶1配比時，拮抗作用隨染毒時間的延長先加強(qiáng)后減弱，這可能是因?yàn)槲廴疚飳?xì)胞膜的損傷作用，抑制了蚯蚓對殺螟丹和Cr6+的吸收，導(dǎo)致毒性降低[36]。有相似研究表明：草甘膦能夠降低Cu對蚯蚓的急性毒性，將兩者復(fù)合污染后毒性表現(xiàn)為拮抗作用[37]。但在對蚯蚓受到常用殺蟲劑毒死蜱?噻蟲胺?乙草胺3種混合物污染的研究中，毒性表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用[38]。Tilton等[39]探究毒死蜱和Ni復(fù)合污染對土壤中跳蟲的影響時發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合作用類型表現(xiàn)為拮抗作用，其機(jī)理為毒死蜱通過競爭重金屬Ni與氨基酸的結(jié)合點(diǎn)位從而降低Ni的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致Ni對土壤跳蟲的毒性作用下降。由此推測，殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合污染時二者會產(chǎn)生競爭作用，造成其中一種污染物的毒性受到抑制，從而產(chǎn)生拮抗作用。此外，在殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合染毒時，蚯蚓體內(nèi)蛋白含量變化規(guī)律不明顯，可總結(jié)為染毒初期，蛋白含量隨試驗(yàn)濃度的增加先升高后降低，染毒后期先降低后升高，蛋白含量總體呈降低趨勢。以上結(jié)果說明，殺螟丹和Cr6+的聯(lián)合染毒效果與染毒時間及暴露濃度之間存在極大相關(guān)性，時間和濃度的差異，決定了蚯蚓遭受外來污染物脅迫的機(jī)體損傷程度，從而導(dǎo)致蚯蚓體內(nèi)蛋白含量有所不同。蚯蚓體內(nèi)SOD活力在染毒24 h時隨著污染濃度的增加而升高，48 h時SOD活力先升高后降低，總體來看SOD活力降低。研究表明細(xì)胞的抗逆性以及衰老對SOD的活力存在顯著影響，通常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在固定的自由基代謝平衡，在染毒初期，機(jī)體自身能夠生成大量的氧自由基來調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，然而在細(xì)胞受到嚴(yán)重污染損害或者在細(xì)胞自身衰老時，這種固有的自由基代謝平衡就會被打破，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的過氧化反應(yīng)，對細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害[40]。所以隨著時間的推移，復(fù)合污染使蚯蚓受到的脅迫增強(qiáng)，過多自由基無法得到消除，導(dǎo)致后期SOD活力顯著降低[41]。整個復(fù)合染毒過程中，不同濃度殺螟丹與Cr6+復(fù)合后CAT活力與單一殺螟丹、單一Cr6+染毒相比呈現(xiàn)顯著變化。在染毒初期，蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶含量升高，以積極防御免受外來氧化的損傷，表明此時蚯蚓具有抵抗氧化應(yīng)激的能力。高濃度染毒對CAT活力的誘導(dǎo)作用更強(qiáng)，隨著染毒時間的延長，CAT活力提高，其抗氧化能力上升[42]。在研究四溴雙酚A和Cd復(fù)合污染對蚯蚓和斑馬魚的影響研究中也得出相似的結(jié)論[43]，聯(lián)合染毒條件下，相同Cd濃度時對應(yīng)的CAT活力隨四溴雙酚A濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。MDA含量在染毒24 h時隨著試驗(yàn)濃度的升高而降低，在長時間暴露后，MDA含量降低且趨于平緩，說明機(jī)體受氧化損傷逐漸減弱，活性氧的產(chǎn)生和清除達(dá)到平衡，或是MDA隨機(jī)體代謝排出體外。在研究Cu和不同濃度La復(fù)合污染對蚯蚓MDA含量的影響中也發(fā)現(xiàn)了相似情況[44]，MDA含量在初期呈先上升后下降的趨勢，后期緩慢降低。

4 結(jié)論

（1）殺螟丹和Cr6+單一毒性結(jié)果顯示，其毒性都隨著暴露時間的延長而增強(qiáng)，單一毒性為殺螟丹大于Cr6+。當(dāng)殺螟丹和Cr6+以等毒性比1∶1配比時，聯(lián)合毒性最終表現(xiàn)為拮抗作用。

（2）殺螟丹單一污染時，赤子愛勝蚓體內(nèi)蛋白含量隨染毒時間的延長總體先升高后降低；SOD活力呈總體下降的趨勢；CAT活力和MDA含量在染毒初期被促進(jìn)，隨時間延長均發(fā)生大幅度降低。

（3）Cr6+單一污染時，赤子愛勝蚓體內(nèi)蛋白含量和SOD活力隨染毒時間的延長總體呈現(xiàn)下降趨勢；CAT活力和MAD含量隨Cr6+濃度升高先升高后降低，隨時間的延長總體呈上升趨勢。

（4）殺螟丹和Cr6+二元聯(lián)合作用時，赤子愛勝蚓體內(nèi)蛋白含量變化趨勢不明顯；SOD活力在前期、中期得到促進(jìn)，后期受到抑制；CAT活力隨染毒濃度的升高而升高；MDA含量隨染毒時間的延長持續(xù)降低。