鄂銘 劉麗靜 郝陶光 焦陽 邢紅瑜

摘 要：目的：建立一種快速的、可同時測定水果中多種農(nóng)藥殘留量的高通量檢測方法。方法：利用QuEChERS樣品處理技術(shù)，以四極桿傅里葉變換靜電場軌道阱高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀進行篩查和定量。結(jié)果：35種常見農(nóng)藥用外標法定量，重復性相對標準偏差、線性關系的范圍、回收率和檢出限均獲得滿意結(jié)果。結(jié)論：本方法簡便、靈敏、重現(xiàn)性好、干擾少、特異性好，能滿足多種水果中農(nóng)藥殘留的高通量檢測。

關鍵詞：水果;多種農(nóng)藥殘留;快速;高通量

分類號：TS255.7

水果是我們?nèi)粘Ｉ钪胁豢扇鄙俚氖澄?，我們從水果中攝取多種營養(yǎng)成分。果樹在種植和生長過程中不可避免地會被噴灑農(nóng)藥，由于噴灑劑量不盡均勻、降解過程不受人工控制以及成長周期、日照程度、雨水和土壤等諸多原因，水果在成熟之際依然會或多或少地殘留一些農(nóng)藥，如果較多的農(nóng)藥殘留來到我們的餐桌，經(jīng)過日積月累地食用，必將危害我們的身體健康。

中華人民共和國國家標準《GB 2763-2016 食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》已于2017年實施[1]，涉及的農(nóng)藥有417種，其中對于常見水果中多種農(nóng)藥的最大殘留限量都有著明確規(guī)定。如何盡快并準確地判定各種農(nóng)藥在水果中的殘留量是否符合國家標準，這必然需要一種快速的、可同時測定多種農(nóng)藥殘留量的檢測方法，因此本研究擬建立一種檢測結(jié)果準確的高通量快速檢測方法，以此為相關職能部門提供工作依據(jù)，進而保證我們的日常飲食安全。

四極桿傅里葉變換靜電場軌道阱高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（以下簡稱Q-E）具有通過精確質(zhì)量數(shù)（全掃描質(zhì)量精度可小于3ppm）準確鑒定化合物的特點，具有超高的選擇性和靈敏度，檢測速度快，可大大縮短檢測周期;而逐漸興起的QuEChERS技術(shù)將樣品處理過程進行了大幅簡化，從而實現(xiàn)高效。近幾年，利用Q-E進行快速檢測多種化合物的文章有過多次報道[2，3]，內(nèi)容涉及農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留、葡萄酒中的農(nóng)藥殘留、土壤中的農(nóng)藥殘留、保健品中的化學成分以及動物源性產(chǎn)品中的獸藥殘留等，但僅針對水果中的多種農(nóng)藥殘留的檢測方法鮮有報道。由于水果種類繁多，成分千差萬別，帶來的干擾物質(zhì)多種多樣，因此在樣品處理方法和儀器分析條件等方面還有很大的提升空間，本研究期望優(yōu)化后的檢測條件將在高通量快速測定的基礎上進一步保證定性和定量結(jié)果的準確性。

一、材料與方法

1.試劑與材料

（1）標準物質(zhì)

甲霜靈、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、毒死蜱標準溶液、戊唑醇標準溶液 、甲硫威、啶蟲脒、啶酰菌胺、噻嗪酮、嘧霉胺、肟菌酯、己唑醇、咪鮮胺、螺蟲乙酯、噻菌靈、滅銹胺、嘧菌酯、多效唑、螺螨酯，唑螨酯，丙溴磷，甲基嘧啶磷，克百威，烯酰嗎啉，霜霉威，噻螨酮，腈菌唑，嘧菌環(huán)胺，丙環(huán)唑，噠螨靈，上述標準品均為100μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;乙螨唑標準溶液SPLPD096 （100μg/mL，上海市農(nóng)藥研究所）;抑霉唑（spirotetramat）標準溶液1ST20364，（100μg/mL，美國A chemtek公司）;粉唑醇（flutriafol）標準溶液1ST21178，（100μg/mL，美國A chemtek公司）;乙嘧酚（ethirimol）標準溶液1ST21158，（100μg/mL，美國A chemtek公司）;上述標準物質(zhì)在使用時均用乙腈稀釋為各自的標準工作溶液并配制成混合標準工作溶液。

（2）試劑

甲醇（HPLC級，德國Merck公司）;乙腈（HPLC級，德國Merck公司）;甲酸銨（HPLC級，CNW公司）;甲酸（HPLC級，CNW公司）;乙酸（分析純，SIGMAALDRICH公司）;水（來自MilliQ超純水制備系統(tǒng)）。

（3）其他材料

提取劑預混包A（美國安捷倫公司Part No.：59825755）;凈化預混離心管B（美國安捷倫公司Part No.：59825058）。

2 儀器及實驗條件

（1）儀器

四極桿傅里葉變換靜電場軌道阱高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀Q Exactive，美國Thermo fisher公司;高效液相色譜儀Ultimate 3000，美國Thermo fisher公司;渦旋振蕩器400W，美國Fisher Scientific公司;離心機3-16KL，德國SIGMA公司。

（2）色譜條件

色譜柱：Accucore aQ（長度150mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑2.6μm）;柱溫：恒定25℃;

進樣量：2μL;

流動相A：5mM甲酸銨及0.1%甲酸的甲醇溶液+5mM甲酸銨及0.1%甲酸的水溶液（98+2）;

流動相B;5mM甲酸銨及0.1%甲酸的水溶液+5mM甲酸銨及0.1%甲酸的甲醇溶液（98+2）;

梯度洗脫條件見表1。

（3）質(zhì)譜條件

選擇可加熱的電噴霧離子源作為電離源，采用一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級掃描同時掃描的方式對水果中的農(nóng)藥殘留進行定性篩查，優(yōu)化各級掃描的分辨率、最大注入時間、AGC離子數(shù)、碰撞能量以及關于觸發(fā)掃描和采集的相關參數(shù)，以提高檢測多種農(nóng)殘的兼容性，避免遺漏。優(yōu)化后的條件參數(shù)如下：

HESI polarity：positive（+）;

Spray Voltage：3000V;

Capillary Temperature： 325℃;

Sheath Gas：40;

Aux Gas：10;

Probe Heater Temperature： 350℃;

SLens：60V;

Scan type：Full MS/ddMS2;

Full MS scan range：100.0900.0 m/z;

Resolution：70000 for Full MS，17500 for MS/MS;

AGC Target：1e6 Full MS， 5e5 for MS/MS;

Max IT：200ms for Full MS， 60ms for MS/MS;

Loop count：1;

MSX count：1;

Isolation width：2.0 m/z;

NCE/Stepped NCE：40（50%）;

Apex trigger：2-6s;

Dynamic Exclusion：5.0s。

3.樣品處理

依據(jù)GB 2763-2016附錄 A的規(guī)定進行樣品制備，參照AOAC2007.01中QuEChERS處理方法進行樣品處理：

a）稱取均質(zhì)后的試樣15.0g;

b）加入1%乙酸的乙腈15mL，渦旋混勻;

c）加入硫酸鎂6g和乙酸鈉1.5g（提取劑預混包A），渦旋混勻后，2500r/min振蕩提取10min;

d）9000r/min離心5min，取上清液8mL加入N丙基乙二胺400mg和硫酸鎂1200mg（凈化預混離心管B），渦旋混勻;

e）9000r/min離心5min，取上清液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，供儀器分析。

4 篩查條件

優(yōu)化積分條件，根據(jù)實驗條件建立35種農(nóng)藥的標準篩查數(shù)據(jù)庫，其中包含化合物名稱、分子式、一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)等信息，在數(shù)據(jù)庫中依據(jù)一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、二級碎片離子匹配情況和同位素峰匹配度打分等條件進行篩查，盡可能的排除假陽性，篩查方法如下：

General Settings：

Use Matrix Blank：10;

Mass Tolerance：5ppm;

Smoothing Points：11

Chromatogram View Width：2.00 minutes;

Target Screening Settings：

Compound Database：pesticides database;

Peaks Threshold Override：1，000，000;

Peaks S/N Ratio Threshold：500;

Retention Time（Identify）： Window Override：30sec;

Fragment Ions （Confirm）：Min 2 of 5 Fragments;

Isotopic Pattern（Confirm）：Fit Threshold （%）：90。

二、結(jié)果與討論

1.液相色譜條件優(yōu)化

使用C18、C8和Accucore aQ等色譜柱分離混合標準工作溶液中多種農(nóng)藥，結(jié)果表明35種農(nóng)藥在Accucore aQ上出峰時間合理，有較高的響應值、信噪比和良好的峰形。經(jīng)優(yōu)化流動相體系和配比等液相色譜條件，盡可能降低基質(zhì)干擾，保證在相對短的檢測時間內(nèi)實現(xiàn)多種農(nóng)殘同時檢測。

用1.0μg/mL和0.2μg/mL的35種農(nóng)藥混合標準工作溶液考察不同流動相對儀器分析結(jié)果的影響。a）流動相使用甲醇+水時，峰面積響應值有極大提高，多菌靈的峰形得到改善，霜霉威的峰形略有改善，但抑霉唑的峰產(chǎn)生分叉，兩個濃度水平均未篩查到烯酰嗎啉、噻螨酮、甲硫威和螺螨酯4種農(nóng)藥。b）使用0.1%甲酸的甲醇+0.1%甲酸水溶液時，峰面積響應值略有變化，多菌靈變成肩峰，但兩個濃度水平均未篩查到甲硫威和螺螨酯，0.2μg/mL濃度未篩查到烯酰嗎啉和噻螨酮。c）使用5mM甲酸銨的甲醇溶液+5mM甲酸銨的水溶液時，峰面積響應值無明顯變化，多菌靈和霜霉威的峰形有所改善，但多種農(nóng)藥的同位素匹配度打分值降低。d）使用5mM甲酸銨及0.1%甲酸的甲醇溶液+5mM甲酸銨及0.1%甲酸的水溶液時峰面積響應值和峰形無明顯差別，但某些農(nóng)藥的同位素匹配度打分值降低。因此，綜合考慮儀器靈敏度和樣品基質(zhì)等因素，采用A和B做流動相。經(jīng)優(yōu)化得到表1所述梯度洗脫條件。

2.樣品處理條件優(yōu)化

樣品處理采用QuEChERS處理技術(shù)，用有機物體系提取水果中的農(nóng)藥殘留，分散固相萃取法進行脫水、去色素和凈化，嘗試優(yōu)化提取試劑、分散固相萃試劑和凈化試劑的用量;針對水果樣品的粘度差別細化提取方案，根據(jù)含有色素情況提出個性化凈化方案。

在草莓中添加0.2mg/kg水平的35種農(nóng)藥，分別用甲醇、丙酮、石油醚、二氯甲烷、正己烷和乙酸乙酯等多種有機試劑提取，考察回收率。用甲醇提取時，硫酸鎂和乙酸鈉無法使水果中的水和甲醇分層，得到粘稠的提取液，試驗終止。用石油醚和正己烷提取時多種農(nóng)藥回收率偏低，甚至很低，其中啶蟲脒分別為6.9%和7.7%，噻菌靈為29.4%和33.0%，啶酰菌胺為0.0%和49.8%，多效唑為59.3%和57.2%，嘧菌酯為48.9%和51.6%。使用乙酸乙酯提取時有些農(nóng)藥的回收率不理想，例如霜霉威的回收率為0.0%，嘧霉胺為130.7%。使用丙酮和二氯甲烷提取時回收率均比較合理，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

同樣在草莓中添加0.2mg/kg水平的35種農(nóng)藥，分別用乙腈、含1%乙酸的乙腈、含3%乙酸的乙腈和含5%乙酸的乙腈提取，考察回收率。回收率均比較合理，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。使用乙腈和含5%乙酸的乙腈提取時較1%乙酸的乙腈和3%乙酸的乙腈提取唑螨酯和螺螨酯的回收率有很大提高。

針對水果樣品分散固相萃取后，在凈化劑N丙基乙二胺400mg和硫酸鎂1200mg中嘗試加入超量50%的提取液考察凈化效果，分別加入12mL草莓和12mL桑葚提取液進行凈化，回收率均比較合理，同加入8mL提取液凈化的結(jié)果無明顯差別，說明此凈化劑具有足夠去除雜質(zhì)的能力，降低基質(zhì)干擾。

由于本研究僅對草莓這一種基質(zhì)考察了樣品處理條件，僅考察了35種農(nóng)藥，因此綜合考慮多種因素，暫時采用上述樣品處理方法。針對含脂和蠟狀水果和適當加入C18EC材料提高凈化效果，針對色素豐富的水果可加入 GCB粉末凈化，本研究所涉及的29種水果和35種農(nóng)藥在未使用此兩種材料的情況下依然取得良好的凈化效果。

3.精密度

分別將1.0μg/mL、0.2μg/mL和0.05μg/mL的35種農(nóng)藥混合標準工作溶液連續(xù)重復進樣10次，再將一份1.0mg/kg添加水平的草莓樣品和一份檸檬樣品連續(xù)重復進樣10次，計算農(nóng)藥的保留時間和峰面積的相對標準偏差RSD%。

標準工作溶液中農(nóng)藥的保留時間RSD%在0.11%0.36%之間，峰面積RSD%在0.64%9.55%之間;草莓和檸檬樣品中農(nóng)藥的保留時間RSD%在0.13%0.35%之間，峰面積RSD%在0.74%10.5%之間。

4.回收率

分別向草莓、桑葚和蘋果中添加1.0mg/kg、0.2mg/kg和0.05mg/kg水平的35種農(nóng)藥，回收率結(jié)果見表4?；厥章式Y(jié)果在62.9%139.5%之間，添加0.05mg/kg水平的啶蟲脒、噻螨酮和噻菌靈未篩查到。

5.篩查結(jié)果

依據(jù)本研究建立的檢測方法對本地市場2020年春季和夏季銷售的六大類別29種水果共計86份樣品進行了農(nóng)藥篩查和定量?？傆嫼Y查到各種農(nóng)藥殘留199次，其中，在沙糖桔A樣品中檢測到0.422 mg/kg的苯醚甲環(huán)唑和0.656 mg/kg的丙溴磷，在丑桔B樣品中檢測到0.367mg/kg的丙溴磷，在丑桔C樣品中檢測到0.523mg/kg的苯醚甲環(huán)唑，均超過國家限量，其他水果中的農(nóng)藥殘留均符合國家規(guī)定，或暫無規(guī)定。同時將篩查到的水果中農(nóng)藥殘留量結(jié)果同氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀和液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀等儀器的定量結(jié)果進行比對，基本符合。

此外，本研究還進行了其他相關實驗，實驗結(jié)果表明柑橘類和火龍果等帶皮水果在去皮后的果肉中農(nóng)藥殘留量明顯減少;蘋果肉中的農(nóng)藥殘留量少于蘋果皮中的農(nóng)藥殘留量;草莓柄中的農(nóng)藥種類和含量要遠高于草莓果肉;煮制加工后很多農(nóng)藥殘留量并不會減少;浸泡和清洗會有效降低農(nóng)藥殘留量。相關研究結(jié)果可以引導百姓合理消費和科學食用水果[4，5]。

四、總結(jié)

本研究著眼于國內(nèi)市場，建立起一種快速的、可同時測定水果中多種農(nóng)藥殘留量的高通量檢測方法。針對常見的35種農(nóng)藥進行精密度、線性關系、回收率和檢出限等技術(shù)要求的驗證，取得令人滿意的結(jié)果，基本滿足國家對食品理化檢測的相關要求。針對糖分高、蛋白含量高、色素豐富等不同類型水果建立普遍適用的樣品處理方案和儀器分析條件。

本方法簡便、靈敏、重現(xiàn)性好、干擾少、特異性好，能滿足多種水果中農(nóng)藥殘留的高通量檢測。該方法篩查1份水果樣本中35種農(nóng)藥殘留的整個過程僅用時2小時，將檢測成本降低到傳統(tǒng)方法的30%，同時縮短了50%的檢測時間。在樣品檢測量大和突發(fā)食品安全事件等情況下將大大縮短檢測周期，提高工作效率，有效服務于政府執(zhí)法把關和百姓飲食健康。

參考文獻：

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