冬凌草甲素減輕大鼠腦外傷的作用及機(jī)制

王松林，李東波，楊 濤，李從進(jìn)，宋錦寧，金 濤*

(1陜西省安康市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，安康 725000；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；*通訊作者,E-mail:20782635@qq.com)

炎癥反應(yīng)在腦外傷后的繼發(fā)性損傷中起重要作用[1]。多種炎性因子的釋放可加重腦損害，特異性的炎性因子拮抗劑可減輕腦外傷后的繼發(fā)性腦損害[2,3]。冬凌草甲素是中草藥冬凌草的主要成分，屬貝殼杉烷型四環(huán)二萜類天然有機(jī)化合物，研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可共價結(jié)合Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體,從而抑制炎癥小體活化，且對NLRP3相關(guān)的一些疾病有較好的預(yù)防和治療效果[4]。而冬凌草甲素對腦外傷是否有保護(hù)作用尚不明確。

本研究擬探討冬凌草甲素對大鼠腦外傷后膠質(zhì)細(xì)胞活化、細(xì)胞凋亡、炎性因子水平的影響，并探索其潛在的分子機(jī)制，為冬凌草甲素治療腦外傷提供一定的實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物、試劑及儀器

36只遺傳背景相同的SPF級成年雄性SD大鼠(8周齡)購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心(許可證號：SCXK(陜)08-018)，合格證號:2007-001，體質(zhì)量250-280 g。大鼠飼養(yǎng)于(22±2)℃、12 h照明/12 h黑暗的環(huán)境中，食水自由，實(shí)驗前24 h禁食。該實(shí)驗倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。冬凌草甲素(佰世凱化學(xué)科技有限公司，28957-04-2)；p38 MAPK抗體(CST，8690)；Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)抗體(CST，4631)；TUNEL試劑盒(Promega，G3250)；TNF-α、IL-1β、IL-6(R&D Systems，RTA00，RLB00，R6000B)；免疫組化試劑盒(中山金橋，SPN-9001)；GFAG抗體(CST，80788)；Iba-1抗體(Wako,019-19741)。凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A，上海培清科技有限公司)；熒光顯微鏡(BX63，OLYMPUS)。

1.2 實(shí)驗分組

按照隨機(jī)數(shù)字法對大鼠進(jìn)行編號(1-36)，將大鼠分為對照組、TBI 3 d組、TBI 3 d+冬凌草甲素(Ori)組，每組12只。對照組僅接受麻醉，TBI 3 d+Ori組在造模后立刻腹腔注射冬凌草甲素(1 mg/100 g)[5]，每12 h后再次給藥，連續(xù)3 d。TBI 3 d組在造模后注射DMSO。

1.3 Feeney法制作TBI模型

采用Feeney法自由落體顱腦損傷裝置制作大鼠TBI模型[6]：大鼠麻醉后固定于腦立體定向儀上。切開皮膚，前囟后1.5 mm、右旁開2.5 mm鉆孔，開一直徑5 mm骨窗，顯露硬腦膜，撞擊頭移至硬腦膜上方，20 g打擊錘于15 cm處沿導(dǎo)管墜落，打擊后骨蠟封閉骨窗，對照組僅去骨瓣。

1.4 HE染色觀察大鼠皮層損傷

各組大鼠于預(yù)定時間點(diǎn)灌注生理鹽水及40 g/L多聚甲醛后取腦，標(biāo)本置于多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定48 h。常規(guī)石蠟包埋，每個蠟塊連續(xù)切片厚4 μm，切片脫蠟、梯度乙醇水化，經(jīng)蘇木精液及伊紅液染色，常規(guī)脫水、透明、封固。圖像采集與分析系統(tǒng)上采集、分析圖片，觀察大鼠受損皮層。

1.5 TUNEL檢測大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡

大鼠灌注取腦、固定、切片、脫蠟、水化如前，按照TUNEL凋亡試劑盒提供的步驟染色，DAPI染核。每張切片隨機(jī)選取6個高倍視野(×400)，計算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 免疫組化檢測膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的變化

大鼠灌注取腦、固定、切片、脫蠟、水化如前，高壓修復(fù)切片抗原，封閉后分別加GFAG(1 ∶200)、Iba-1(1 ∶400)一抗，生物素化二抗孵育后，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育，DAB顯色、蘇木素復(fù)染。每張切片隨機(jī)選取6個視野(×200)，Image-Pro Plus 6.0對切片進(jìn)行半定量分析。

1.7 Western blot檢測NF-κB及MAPK通路的變化

取損傷灶周圍皮層，分別提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將細(xì)胞核蛋白加入NF-κB p65(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜(Lamin B 1 ∶1 000為內(nèi)參)，將細(xì)胞質(zhì)蛋白加入p38 MAPK(1 ∶1 000)及Phospho-p38 MAPK(1 ∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜(β-actin(1 ∶1 000)為內(nèi)參)，二抗孵育，顯影后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件作定量分析。

1.8 ELISA檢測炎性因子水平的變化

取損傷灶周圍皮層，ELISA檢測腦組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6因子含量變化，具體操作步驟依照試劑盒列出的步驟進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在滿足正態(tài)性和方差齊性的條件下，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素減輕腦損傷并抑制膠質(zhì)反應(yīng)

對照組大鼠腦皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰、染色均勻。TBI 3 d組大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞有變性壞死，部分胞核可見核體皺縮。與TBI 3 d組相比，TBI 3 d+Ori組神經(jīng)元壞死變性、核體皺縮的數(shù)量減少(見圖1)。

與對照組相比，TBI 3 d組GFAP、Iba-1的表達(dá)均明顯升高；與TBI 3 d組相比，TBI 3 d+Ori組的皮層內(nèi)GFAP、Iba-1的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1)。

2.2 冬凌草甲素抑制大鼠TBI后皮層細(xì)胞凋亡

與對照組相比，TBI 3 d組凋亡細(xì)胞增加；與TBI 3 d組相比，TBI 3 d+Ori組的凋亡細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

TUNEL(綠色)與DAPI(藍(lán)色)同時陽性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞

2.3 冬凌草甲素抑制促炎因子TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放

與對照組相比，TBI 3 d組皮層TNF-α、IL-6及IL-1β的水平升高(P均<0.05)；與TBI 3 d組相比，TBI 3 d+Ori組TNF-α、IL-6及IL-1β的水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

與對照組相比，*P<0.05；與TBI 3 d組相比，#P<0.05

2.4 冬凌草甲素對NF-κB及MAPK信號通路的調(diào)控

與對照組相比，TBI 3 d組NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化水平均升高(均P<0.05)，與TBI 3 d組相比，TBI 3 d+Ori組NF-κB的表達(dá)及p38 MAPK的磷酸化水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，*P<0.05；與TBI 3 d組相比，#P<0.05

3 討論

本研究中HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組腦皮層無明顯病理改變，而TBI 3 d組腦皮層有明顯的腦組織缺損，且損傷區(qū)域組織結(jié)構(gòu)紊亂稀疏，染色淺淡，可見紅細(xì)胞彌散分布，損傷灶周圍神經(jīng)細(xì)胞腫脹、排列紊亂，故本研究采用的TBI模型可有效地模擬臨床腦挫裂傷。

冬凌草甲素具有抗腫瘤、降壓、抗菌消炎、抗氧化、抗炎等多種作用。冬凌草甲素可抑制腎組織內(nèi)CD68陽性炎性細(xì)胞的浸潤，降低炎性因子的水平；減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎，降低過氧化物酶的活性[7,8]。冬凌草甲素還能通過抑制T細(xì)胞的活性，減輕實(shí)驗性結(jié)腸炎的癥狀，并通過降低炎性因子水平治療急性肺損傷[9-11]。在腦內(nèi)，冬凌草甲素可以明顯減少阿爾茨海默小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)TBI后連續(xù)3 d給予冬凌草甲素，可以減輕腦外傷后皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化。TBI后由于病損的持續(xù)存在，膠質(zhì)細(xì)胞均可能持續(xù)激活，釋放炎性細(xì)胞因子，引起腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，直接或間接誘發(fā)神經(jīng)元死亡[14]。因此，本研究中，冬凌草甲素可能通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)降低炎性因子水平減輕TBI后的腦損傷。

TNF-α、IL-1β、IL-6是重要的促炎因子，可通過結(jié)合受體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；多種信號傳導(dǎo)通路參與TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的釋放，主要包括轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和MAPK蛋白激酶的活化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)TBI連續(xù)3 d給予冬凌草甲素，受損皮層周圍組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的表達(dá)量減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)MAPK的磷酸化水平降低。NF-κB可被外界的刺激激活，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，在核內(nèi)與啟動子區(qū)的相應(yīng)因子相結(jié)合，調(diào)節(jié)廣泛的基因表達(dá)譜[16,17]。異常的NF-κB活性可引起一系列炎癥因子的表達(dá)，包括TNF-α、IL-6等。p38MAPK可磷酸化ATF2N端活化區(qū)域的蘇氨酸,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性升高，調(diào)節(jié)多種炎性因子的基因表達(dá)[18,19]。因此，冬凌草甲素抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生可能與其抑制NF-κB活性和抑制MAPK磷酸化水平的能力有關(guān)。既往研究也發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能通過抑制NF-κB活性及MAPK的磷酸化降低炎性因子水平，進(jìn)而緩解內(nèi)毒素導(dǎo)致的急性肺損傷，并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[20,21]。除了作用于NF-κB和MAPK途徑，冬凌草甲素還可以調(diào)控多種信號通路，具有治療多種疾病的潛力，例如冬凌草甲素可通過激活PPAR-γ途徑抑制IL-1β導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)病，也可抑制內(nèi)毒素導(dǎo)致的牙齦成纖維細(xì)胞炎癥，并通過TGF-β途徑抑制肺纖維化[22-25]。

綜上，冬凌草甲素可通過抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生及其相關(guān)的NF-κB和MAPK信號通路，對TBI后的病理改變及細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。