丁 旭,李愛莉,唐雪原,周冬梅,黃艷紅*

(1西北大學(xué)附屬西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科,西安 710100;2西北大學(xué)附屬西安高新醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:huangyanhongphd@163.com)

女性生殖道感染(reproductive tract infection,RTI)導(dǎo)致的卵巢功能衰退受到廣泛關(guān)注。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)是經(jīng)性傳播導(dǎo)致生殖感染的最常見感染源,女性衣原體感染的患病率為3.0%-5.3%[1,2]。在缺乏免疫細(xì)胞干預(yù)的情況下,卵巢感染會干擾優(yōu)勢卵泡的發(fā)育和類固醇激素的生物學(xué)合成,紊亂卵巢微環(huán)境引起生育障礙。TLRs(Toll-like receptors)系統(tǒng)是機體抵抗感染的第一道免疫防線,TLR4能夠識別衣原體細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)抵抗感染的慢性炎癥反應(yīng)。當(dāng)TLR4識別病原微生物后,卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟是否會受到影響尚未可知。在果蠅中,最先發(fā)現(xiàn)Toll基因還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和卵子的形成[3]。在哺乳動物中,LPS/TLR4系統(tǒng)在原始卵泡中介導(dǎo)炎癥反應(yīng),降低哺乳動物的卵巢儲備,從而降低生育力[4]。

LPS/TLR4通路是抗生殖道感染過程中的重要通路,對卵泡發(fā)育有十分重要的影響,闡明TLR4通路調(diào)節(jié)卵巢微環(huán)境影響卵泡發(fā)育的分子機制,為女性生育力衰退的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇未交配的健康雌性性成熟BALB/c小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)6-8周齡,體質(zhì)量25-30 g。

1.2 主要試劑

LPS購自Sigma-Aldrich公司(美國)。PBS購自HyClone公司(美國)。雌激素檢測試劑盒購自碧云天公司(中國)。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real time qPCR用熒光定量PCR試劑SYBR GreenⅠ均購自TOYOBO公司(日本)。

1.3 在體實驗

采用LPS感染陰道黏膜法[5],簡述如下。36只小鼠隨機分成3組:未處理組、PSB組和LPS組,每組12只小鼠。LPS組每只小鼠的陰道注入50 μl的LPS(終劑量為20 μg/kg),原位停留1-2 min,防止液體溢出。未處理組注射前及其他兩組注射后24 h頸椎脫臼處死各組小鼠,觀察記錄LPS組小鼠陰道紅腫情況、子宮體有充血肥大表現(xiàn)。摘取卵巢并稱重,PBS清洗兩次后,一部分卵巢用4%多聚甲醛固定,另一部分放入Trizol中于-80 ℃保存?zhèn)溆谩１緞游飳嶒灧桨敢驯晃鞅贝髮W(xué)實驗動物管理與福利倫理委員會認(rèn)定,符合動物處理、保護(hù)等相關(guān)倫理要求。

1.4 卵泡計數(shù)

4%多聚甲醛固定的樣本,常規(guī)石蠟包埋,制備切片,HE染色后進(jìn)行卵泡計數(shù)。每隔2個組織片卵泡計數(shù)一次,為避免多計或漏計,只統(tǒng)計有細(xì)胞核的卵泡的數(shù)量。不同階段的卵泡分開統(tǒng)計。

1.5 離體實驗

取正常小鼠的卵巢,于MEM-α培養(yǎng)基(含3 mg/ml BSA,0.23 mmol/L丙酮酸,0.03 IU/ml FSH)中在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隨機分為2組。LPS刺激組:加入等體積的LPS刺激劑,使其終濃度為0.1 μg/ml和1 μg/ml;對照組:加入相同體積的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,將卵巢組織于4%多聚甲醛固定,另一部分卵巢組織于Trizol中裂解,收集培養(yǎng)液上清,備用。

1.6 real time qPCR檢測mRNA水平的表達(dá)

提取小鼠卵巢組織的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板,按照SYBR GreenⅠ預(yù)混液說明書,采用10 μl的反應(yīng)體系,以β-actin作為內(nèi)參對照,TLR1-9所用引物參考文獻(xiàn)[6,7],IL-1β、IL-6和IL-8等引物見表1。采用ABI 7900實時熒光定量PCR儀,檢測Ct值。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃,10 min;40循環(huán)(94 ℃,15 s;55 ℃,30 s;72 ℃,30 s);95 ℃,15 s;60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。所有樣本均設(shè)定3個復(fù)孔對照。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.7 ELISA檢測

采用競爭法ELISA(Competitive ELISA),參考試劑盒說明書步驟檢測離體實驗上清中雌二醇(E2)的濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

引物設(shè)計所用軟件為Primer Premier 5.0版本。繪圖及統(tǒng)計學(xué)分析使用Graphpad軟件。計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,兩組間比較用獨立樣本t檢驗。TLRs的表達(dá)模式的組間比較采用One-way ANOVA單因素方差統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。real time qPCR結(jié)果采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)表示,即:改變的倍數(shù)(fold)=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(處理組Ct靶基因-處理組Ct內(nèi)參)-(未處理組Ct靶基因-未處理組Ct內(nèi)參)[8,9]。

2 結(jié)果

2.1 生殖道感染對小鼠卵泡發(fā)育的影響

LPS感染后,統(tǒng)計卵巢中原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡和閉鎖卵泡數(shù)目占總卵泡數(shù)的百分比。結(jié)果顯示,LPS組卵巢中的原始卵泡數(shù)目比率顯著低于未處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(23.60%±5.73%vs71.00%±4.06%,P<0.01);LPS組的閉鎖卵泡數(shù)目比率顯著高于未處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(9.60%±3.78%vs4.80%±1.92%,P<0.01);LPS組的初級卵泡比率顯著高于未處理組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(51.80%±7.95%vs13.20%±3.11%,P=0.035,見圖1)。表明LPS引起的生殖道感染過程中,加快了原始卵泡消耗,加速了卵泡閉鎖。

與未處理組相比較,*P<0.05,***P<0.001

2.2 生殖道感染后TLR成員在卵巢中的表達(dá)模式

生殖道感染后,real time-qPCR技術(shù)分析TLR成員在小鼠卵巢中的表達(dá)。根據(jù)得到的Ct值,選取表達(dá)量相對較低的TLR9為基準(zhǔn),采用2-ΔΔCt法計算表達(dá)倍數(shù)。2-ΔΔCt值越大表示其在卵巢中的表達(dá)水平越高。結(jié)果顯示,在LPS感染后的小鼠卵巢中,TLR4與其他TLR成員相比呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)(P<0.05,見圖2)。表明TLR4在LPS誘導(dǎo)的生殖道感染小鼠卵巢中發(fā)揮一定的功能。

與TLR1相比較,*P<0.05

2.3 TLR4抵抗生殖道感染的炎癥因子變化和雌二醇變化

根據(jù)real time qPCR數(shù)據(jù)計算出2-ΔΔCt值,表示LPS刺激組與對照組中炎癥因子表達(dá)水平的相對倍數(shù)關(guān)系。2-ΔΔCt值越高,表示LPS刺激組的炎癥因子的表達(dá)與對照組相比升高越明顯。結(jié)果顯示,0.1 μg/ml和1 μg/ml LPS刺激組IL-1β的mRNA表達(dá)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.029 8,0.002 2,見圖3)。0.1 μg/ml LPS刺激組IL-6的mRNA表達(dá)高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003 7,見圖3)。0.1 μg/ml和1 μg/ml LPS刺激組IL-8的mRNA表達(dá)均高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P分別為0.003 5,0.007 6,見圖3)。

ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),1 μg/ml LPS刺激組的E2水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029 6,見圖3)。

與對照組相比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

TLRs系統(tǒng)是機體抵抗感染的第一道免疫防線。沙眼衣原體是引起生殖道感染的主要病原體,其細(xì)胞壁的主要成分LPS是TLR4識別的關(guān)鍵配體。感染后,TLR4主要誘導(dǎo)MyD88依賴性通路,將MyD88接頭蛋白募集到沙眼衣原體附近,之后再結(jié)合IRAK4激酶,引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活入核,介導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如IL-6、TNF-α,IL-1β等。由于單獨的TLR4的突變或敲除實驗并不能導(dǎo)致小鼠的不孕[10],因此生殖道感染后TLR4是如何影響卵巢功能的問題有待解決。

在哺乳類中,TLR4在顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中表達(dá)[11]。本研究顯示LPS的刺激能增加卵泡的閉鎖,降低E2的分泌。對大鼠的研究結(jié)果也顯示LPS的刺激引起顆粒細(xì)胞凋亡,降低顆粒細(xì)胞的E2水平[12]。E2對卵泡的發(fā)育至關(guān)重要,E2水平間接反應(yīng)卵泡成熟度和卵子質(zhì)量[13]。由于顆粒細(xì)胞的主要功能是調(diào)節(jié)類固醇激素(如雌激素、孕激素)的合成。卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素后經(jīng)顆粒細(xì)胞CYP19芳香化作用轉(zhuǎn)化為雌激素(主要為E2),為卵母細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)。因此,顆粒細(xì)胞中TLR4信號通路迅速激活天然免疫反應(yīng),同時也抑制芳香化酶CYP19的表達(dá)進(jìn)而抑制類固醇激素(如E2)的合成[4],這是造成LPS感染會擾亂卵泡生長的潛在原因之一。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS感染在加速小鼠卵泡閉鎖的過程中,活化的TLR4系統(tǒng)TLR4參與免疫調(diào)節(jié)引起了炎癥因子(IL-1β,IL-8,IL-6)的大量積累。有研究表明TLR4能夠引起卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus cell oocyte complex,COC)表達(dá)高水平的IL-6和IL-8[4]。IL-6是一個多效性的細(xì)胞因子,調(diào)控細(xì)胞分化抑制顆粒細(xì)胞E2的分泌[14]。IL-8參與了卵泡的發(fā)育與閉鎖、排卵、激素生成及黃體功能[15]。IL-6和IL-8等細(xì)胞因子在多個物種的正常排卵過程中都發(fā)揮重要作用,誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞的多種基因的表達(dá),并刺激卵丘細(xì)胞團(tuán)的增生從而修復(fù)排卵后的破損部位[16]。TLR4在卵巢感染后借由IL-6和IL-8發(fā)揮促進(jìn)黃體生成的作用,這可能是感染與不孕并發(fā)表象的內(nèi)在機制之一,值得深入研究。

TLR4在生殖道感染后迅速做出反應(yīng),誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá),調(diào)節(jié)了雌激素的分泌,從而影響卵泡發(fā)育。研究TLR4通路在引起免疫應(yīng)答的同時參與卵泡發(fā)育過程中的生物學(xué)調(diào)控的分子機制,對解決因生殖道感染導(dǎo)致的不孕不育的臨床問題有重要的指導(dǎo)意義。