基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討生脈散治療快速性心律失常氣陰兩虛證作用機制

冉俊寧,陳朝陽,馮 君,劉建和

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007)

快速性心律失常(Tachyarrhythmia)是一組臨床表現(xiàn)、起源部位、傳導(dǎo)路徑和預(yù)后意義很不相同的心律失常，臨床上主要包括各種原因引起的過早搏動、心動過速、撲動和顫動等[1]。研究表明，全球的房顫住院負擔(dān)呈現(xiàn)上升趨勢[2-4]，另外室性心律失常所致猝死約占心臟死亡的50%[5-6]。西醫(yī)治療快速性心律失常費用較高且容易復(fù)發(fā)，又有致心律失常的風(fēng)險，與西醫(yī)相比中醫(yī)治療快速性心律失常有整體調(diào)節(jié)的作用，具有良好的臨床療效[7]。

中醫(yī)根據(jù)快速性心律失常的臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“心悸”范疇，其病位主要在心，與肝、脾、腎、胃等諸多臟腑相關(guān)，病機分為虛、實兩個方面，虛為氣、血、陰、陽不足，心失所養(yǎng)；實為痰瘀、氣滯、水飲擾心[1,8]。快速性心律失常氣陰兩虛證的病機可歸納為心氣陰兩虛，鼓動乏力，心失濡養(yǎng)，致心動失常，故臨床常表現(xiàn)為心悸怔忡。而《醫(yī)學(xué)啟源》生脈散中以人參為君，性甘歸心經(jīng)，可大補元氣，方能生津止渴；麥冬為臣，性甘寒歸心經(jīng)，可養(yǎng)陰生津，尚可清心除煩；佐以五味子酸收寧心，又可助人參固正，輔麥冬養(yǎng)陰[9-11]。三藥并用，一補一潤一斂，共奏益氣生津、斂陰寧心之功。導(dǎo)師臨床用其加減治療快速性心律失常氣陰兩虛證療效頗佳。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面探究生脈散治療快速性心律失常氣陰兩虛證可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 文獻來源與分析平臺 TCMSP數(shù)據(jù)庫、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫；Pubchem數(shù)據(jù)庫、Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫、Cytoscape3.7.1軟件、DAVID數(shù)據(jù)庫、imageGP平臺；Chemspider數(shù)據(jù)庫、Uniprot數(shù)據(jù)庫；Draw venn diagram平臺。

1.2 研究方法

1.2.1 篩選生脈散活性成分信息：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“北五味子”“人參”為檢索詞，以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)[12]，收集北五味子及人參的活性成分。利用Batman-TCM數(shù)據(jù)庫，以麥冬拼音大寫“MAI DONG”為檢索詞，以分?jǐn)?shù)截止值(Score cutoff)≥20、P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]，收集麥冬的活性成分。

1.2.2 收集活性成分相關(guān)靶點：將生脈散候選活性成分信息輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫或Chemspider數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，將不能在Pubchem數(shù)據(jù)庫或Chemspider數(shù)據(jù)庫獲取到化學(xué)結(jié)構(gòu)式的候選活性成分予以刪除。將獲取到的活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式輸入Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫，以物種Homo Sapiens(智人)為標(biāo)準(zhǔn)，進行活性成分的靶點預(yù)測，刪除無法預(yù)測到靶點的候選活性成分，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對獲取到的活性成分靶點名稱進行規(guī)范。

1.2.3 快速性心律失常疾病相關(guān)靶點預(yù)測：在Genecards數(shù)據(jù)庫中，以快速性心律失常英文名稱“Tachyarrhythmia”為檢測詞，篩選得到快速性心律失常疾病相關(guān)靶點。

1.2.4 收集生脈散與快速性心律失常共同靶點：運用Draw venn diagram作圖平臺，將生脈散中北五味子、人參、麥冬活性成分的靶點及快速性心律失常疾病相關(guān)靶點進行映射取交集，以WWZ、RS、MD、Tachyarrhythmia分表代表北五味子、人參、麥冬、快速性心律失常，得到韋恩圖及共同靶點信息。

1.2.5 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：將獲取到的共同靶點信息，錄入至String數(shù)據(jù)庫，以Multiple proteins、物種Homo sapiens(智人)、其他參數(shù)為默認(rèn)值為標(biāo)準(zhǔn)[12]，構(gòu)建共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，同時將PPI網(wǎng)絡(luò)圖相關(guān)信息利用Cytoscape3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖相關(guān)信息進行可視化處理，再運用其Network analyzer功能對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到共同靶點的Degree值。

1.2.6 共同靶點GO功能注釋及KEGG通路富集分析：將共同靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，以“Official gene symbol”格式、Background為Homo sapiens標(biāo)準(zhǔn)進行GO功能注釋及KEGG通路富集分析[12]，同時以P<0.05、Count=2為篩選標(biāo)準(zhǔn)[10]，分別導(dǎo)出生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)及KEGG通路富集分析相關(guān)數(shù)據(jù)進行處理，取Pvalue值負對數(shù)(NegLog10-Pvalue，lgP)得到lgP值，Pvalue值越小，則lgP越大，說明富集的程度越高。構(gòu)建KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)表格，利用imageGP平臺對GO功能注釋BP、CC、MF中富集程度前10位的數(shù)據(jù)及KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)分別構(gòu)建氣泡圖，同時將KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 進行數(shù)據(jù)的可視化處理，構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 生脈散活性成分信息 在TCMSP平臺收集到生脈散中北五味子、人參活性成分共320個，其中北五味子130個、人參190個，篩選條件后剩余活性成分30個，其中北五味子8個、人參22個。在Batman-TCM數(shù)據(jù)庫運用篩選標(biāo)準(zhǔn)，收集到生脈散中麥冬活性成分22個。共得到活性成分52個，由表1可知，生脈散治療快速性心律失常的主要活性成分有人參皂苷(Ginsenoside)、五味子乙素(Schizandrer B)、麥冬皂苷(Ophiopogonin)等。

2.2 生脈散活性成分與快速性心律失常疾病共同靶點信息 刪除無化學(xué)結(jié)構(gòu)式及靶點的活性成分，共預(yù)測得到生脈散活性成分相關(guān)靶點1672個，其中北五味子322個、人參700個、麥冬650個。利用Genecards數(shù)據(jù)庫，對快速性心律失常進行檢索，共得到與快速性心律失常相關(guān)的疾病靶點223個。將生脈散活性成分靶點信息及快速性心律失常疾病靶點信息輸入Draw venn diagram平臺，以WWZ、RS、MD、Tachyarrhythmia分別代表北五味子、人參、麥冬、快速性心律失常，取交集并繪制韋恩圖后得到生脈散活性成分與快速性心律失常疾病共同靶點46個，韋恩圖(圖1)，具體共同靶點見表2。

表1 生脈散活性成分信息

2.3 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點信息 在String數(shù)據(jù)庫中輸入共同靶點相關(guān)信息后可得到生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。由圖2可知靶點DSTYK、MT-ND4、NISCH、TNNI3K、GCK、RORA、JMJD2C、CAMK2G、FABP3無相互作用。利用Cytoscape構(gòu)建PPI圖，以Degree值設(shè)定節(jié)點大小，Degree值越大節(jié)點越大，靶點越重要；以 combined score值設(shè)定邊線粗細，combined score值越大邊線越粗(圖3)。刪除String中 PPI網(wǎng)絡(luò)圖9個無相互作用的靶點后，Cytoscape中 PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有37個靶點，包括相互作用節(jié)點37個，相互作用關(guān)系82條，再利用Network analyzer功能，可得到46個共同靶點的Degree值，見表3。生脈散治療快速性失常的重要靶點分別為：ACE、SRC、NOS3、ADRB2、AGTR1、HTR3A、ADRA1B、KCNH2等。

圖1 生脈散活性成分靶點與快速性

表2 生脈散活性成分與快速性心律失常疾病靶點

圖2 String中生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Cytoscape中生脈散活性成分與快速性

表3 生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點Degree值信息

2.4 共同靶點GO功能注釋結(jié)果 46個共同靶點通過DAVID進行GO功能注釋后，共得到BP91個、CC18個、MF18個。取PValue值負對數(shù)得到-lgP值，-lgP值越大則富集的程度越高，對BP、CC、MF中高度居前10位的數(shù)據(jù)利用imageGP平臺構(gòu)建氣泡圖(圖4)。由圖可知生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點主要分布于細胞質(zhì)膜、電壓門控鈣通道復(fù)合物、突觸后膜、Z膜、軸突等細胞組分中，通過支架蛋白結(jié)合、離子通道結(jié)合、酶結(jié)合、藥物結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活化、ATP結(jié)合、緩激肽受體結(jié)合、α1-腎上腺素受體激活、鈣依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活化、蛋白質(zhì)異二聚活性等方式，參與正調(diào)控蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、調(diào)節(jié)血管收縮、調(diào)節(jié)鈣離子運輸、正調(diào)控ERK1和ERK2級聯(lián)、腎素-血管緊張素對全身動脈血壓的調(diào)節(jié)、通過心臟傳導(dǎo)調(diào)節(jié)心率、對藥物的反應(yīng)、心臟傳導(dǎo)、負調(diào)控鉀離子轉(zhuǎn)運等生物過程，從而發(fā)揮生脈散治療快速性心律失常的作用。

2.5 共同靶點KEGG通路富集分析結(jié)果 46個共同靶點通過DAVID進行KEGG通路富集分析后，共得到19條信號通路，取Pvalue值負對后得到-lgP值，-lgP值越大則表明富集的程度越高，具體信號通路信息見表4。將KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)利用imageGP平臺構(gòu)建氣泡圖(圖5)。同時將KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape進行數(shù)據(jù)的可視化處理，構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)。共同靶點主要富集在鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、心肌細胞的腎上腺素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等19條信號通路上，表明生脈散主要通過調(diào)控以上通路發(fā)揮治療快速性心律失常的作用。

圖4 生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點GO生物功能注釋氣泡圖

表4 生脈散活性成分與快速性心律失常共同靶點KEGG通路富集分析信息

圖5 共同靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

圖6 生脈散活性成分與快速性心律失常

3 討 論

本研究共得到生脈散活性成分52個，其中部分活性成分已被證實具有抗心律失常的作用。Lim等[13-14]、Mancuso等[15]、王巍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可維持心電圖穩(wěn)態(tài)，縮短ST段和QRS復(fù)雜間隔，抑制心肌缺血時T 波、ST 段、ST/R值的變化；Zhu等[17]、Shi等[18]、于晨[19]還發(fā)現(xiàn)其具有離子通道調(diào)節(jié)作用，可直接抑制心肌細胞內(nèi)Ca2+通道，從而抑制心肌細胞內(nèi)Ca2+超載，并改善心肌缺血期間心肌細胞中抗氧化酶的產(chǎn)生，明顯降低心律失常發(fā)生率。心肌缺血、損傷或壞死是引起各類心律失常的重要原因。Zhao等[20]、Zhang等[21]研究表明五味子乙素可通過抑制氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)Akt磷酸化來減輕心肌損傷，并通過減少caspase-3的裂解來防止細胞凋亡。You等[22]、Huang等[23]發(fā)現(xiàn)麥冬皂苷D可通過上調(diào)CYP2

J3/EETs和抑制ER應(yīng)激而在體外維持大鼠心肌細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)，并能抑制炎癥、氧化應(yīng)激和細胞凋亡，從而減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷。

通過Degree值預(yù)測到生脈散治療快速性心律失常的重要靶點分別為ACE、SRC、NOS3、KCNH2等。血流動力學(xué)異常引起的心臟擴大會導(dǎo)致各種心律失常的發(fā)生，Bernstein等[24]研究發(fā)現(xiàn)ACE通過將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，從而穩(wěn)定血流動力學(xué)，預(yù)防心律失常的發(fā)生；腎素-血管緊張素系統(tǒng)由血管緊張素原、腎素、血管緊張素Ⅱ、Ang Ⅱ受體和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶組成，在維持正常的心血管功能中起關(guān)鍵作用，并導(dǎo)致一系列心血管疾病，例如高血壓、冠心病、心肌炎、充血性心力衰竭等，而這些疾病又是引起各類心律失常的重要原因[25-26]。Callera等[27]的研究發(fā)現(xiàn)c-Src下調(diào)會減弱高血壓的發(fā)展，改善內(nèi)皮和心臟功能，降低氧化應(yīng)激并使血管信號正?；?，從而影響心律失常的發(fā)生。內(nèi)皮功能障礙代表心血管危險因素相關(guān)的病理機制，而內(nèi)皮功能主要基于內(nèi)皮一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的功能和活性，氧化應(yīng)激可通過對eNOS本身或上/下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中明確定義的“氧化還原開關(guān)”的不利調(diào)節(jié)而導(dǎo)致eNOS活性喪失，甚至導(dǎo)致酶的“解偶聯(lián)”，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[28]。前期實驗研究證實可通過降低KCNH2失活來治療心律失常[29]。

GO功能注釋表明，生脈散可能通過參與調(diào)控PKB/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子運輸、鉀離子轉(zhuǎn)運等生物過程發(fā)揮治療快速性心律失常的作用。通過干細胞移植治療缺血性心律失常是一大研究熱點，而PI3-K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌細胞的關(guān)鍵通路，前期研究[30]表明通過增加AKT的表達，可促進骨髓間充質(zhì)干細胞量增殖。過多的Ca2+會導(dǎo)致早期后除極或延遲后除極，從而形成期前收縮或折返激動，誘發(fā)各類心律失常，前期研究[31]發(fā)現(xiàn)增強SERCA2a的活性可減少鈣超載，從而治療缺血性心律失常。低鉀血癥可通過抑制鉀離子通道電導(dǎo)、Na+-K+-ATPase，促進細胞內(nèi)Ca2+超載和CaMK激活，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生；高鉀血癥的惡化可致心電圖首先顯示出由于總體動作電位時限縮短而導(dǎo)致的T波峰值，從而在整個心室壁上引起更多的同步復(fù)極，隨后P波變寬并減小幅度，最終消失，QRS波變寬，嚴(yán)重的高鉀血癥可導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)阻滯，心搏停止[32]。

KEGG通路富集分析顯示生脈散可能通過調(diào)節(jié)鈣信號通路、cGMP-PKG信號通路、VEGF信號通路、MAPK信號通路等抗心律失常。最常見的心律失常是房性心律失常，是由InsP3/Ca2+信號通路增加引起的[33]。廣泛的促炎狀態(tài)、內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激所致的cGMP-PKG缺乏可能與射血分?jǐn)?shù)保留的心衰有關(guān)[34]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在發(fā)生心律失常30 min后可檢測到VEGF-A表達和轉(zhuǎn)錄水平的升高[35]。MAPK在心臟的發(fā)育、功能、病理重塑和心律失常的發(fā)展中起著不可或缺的作用，其活性調(diào)節(jié)可促進心肌梗死后恢復(fù)并防止心律不齊的發(fā)展[36]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了生脈散治療快速性心律失常氣陰兩虛證可能的作用活性成分、靶點及通路，初步揭示了生脈散抗快速性心律失常氣陰兩虛證可能的機制，為進一步進行實驗及臨床研究提供了理論依據(jù)及方向。但由于數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件的局限性，仍需要在本研究基礎(chǔ)上對于相關(guān)靶點及通路進行實驗及臨床研究進行驗證。