劉 蕓,趙 旭,胡小英,付建平,張素坤,任明忠

生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學研究所,國家環(huán)境保護環(huán)境污染健康風險評價重點實驗室,廣東 廣州 510655

高分辨率氣相色譜-高分辨率質譜法(HRGCHRMS 法)被譽為開展環(huán)境二英類污染物檢測的“金方法”,具有高靈敏度、高分辨率等優(yōu)點,但其成本高昂,難以開展高頻次、大范圍的推廣應用,影響到了二英分析測試的常態(tài)化[6]。 生物檢測方法具有操作便捷、費用低廉,且能通過各種代謝活化酶類的作用模擬人體真實情況等優(yōu)點,受到了越來越多的關注[7-9]。 常見的生物檢測方法有酶活力誘導法(7-乙氧基-3-異吩惡唑酮-脫乙基酶 法, EROD 法)[10]、 熒 光 素 酶 報 告 基 因法[5,11-13]、酶免疫分析法[14-15]和熒光免疫分析法[16]等。 美國食品與藥品管理局(FDA)利用EROD 法進行食品中二英的檢測[17];日本環(huán)境省把基于芳香烴受體(AhR)的二英生物報告基因監(jiān)測方法和使用二英作抗原的抗原體反應方法設定為廢物焚燒爐所排放二英的檢測方法[17];我國也已開展了大量關于二英類污染物生物檢測方法的研究[7,11,18-20]。

針對上述問題,本研究開展了以下工作:一是優(yōu)化前處理方法,對傳統(tǒng)EROD 法的樣品前處理過程進行改進,提高回收率的同時,盡可能多地去除環(huán)境樣品中可能存在的干擾物,即非二英類AhR 誘導活性物質,降低干擾物質的影響;二是利用同一環(huán)境樣品、相同前處理過程,計算生物檢測法與儀器分析法測定結果的一致性,了解生物實驗材料自身與環(huán)境樣品中的二英類污染物反應的有效性;三是開展應用實例,采集不同地區(qū)垃圾焚燒廠飛灰樣品,采用改進后的生物方法進行檢測,評估將生物檢測法作為儀器分析法的替代方法進行推廣的可行性,為加強環(huán)境中二英類污染物的監(jiān)測與監(jiān)管提供數據參考。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器:氮吹儀(上海秉越,BYN100),二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo,6500),生物安全柜(新加坡ESCO,AC2-S),高分辨氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Agilent,7890A-5975C),全波段酶標儀(美國Biotek,Synergy HT),臺式高速冷凍離心機(美國Thermo,Biofuge Primo R),電子天平(德國Sartorius,BS224S)。

實驗試劑和材料:大鼠肝細胞瘤H4-ⅡE 細胞系(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究中心),DMEM 細胞培養(yǎng)基、血清、胰酶、7-乙氧基-異吩惡唑酮(ERF)、2,3,7,8-四氯代二苯-并-對二英(2,3,7,8-TCDD)、試鹵靈(RF)(美國Sigma),異丙醇、DMSO、正己烷(北京化學試劑公司,分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和預處理

飛灰樣品的采集和儲藏參考《工業(yè)固體廢物采樣制樣技術規(guī)范》(HJ/T 20—1998)和《海洋監(jiān)測規(guī)范 第3 部分:樣品采集、貯存與運輸》(GB 17378.3—2007)。 用干凈的不銹鋼采集裝置采集一定量的飛灰樣品,隨后用錫箔紙包好放入密封袋中,低溫環(huán)境下送回實驗室風干、破碎、過篩,然后進行樣品前處理。

實驗樣品為我國南部地區(qū)3 家垃圾焚燒廠的飛灰,編號分別為KW2、KW4 和FH2。 取40 g 飛灰樣品,鹽酸(2 mol/L)浸泡0.5 h,濾紙濾干,用大量去離子水沖洗,濾干并冷凍干燥后,采用甲苯索氏抽提法對樣品抽提48 h。

1.2.2 EROD 法檢測

1.2.2.1 樣品凈化

將抽提濃縮后的樣品依次通過:多段硅膠柱,用正己烷進行洗脫;氧化鋁-弗羅里硅土復合柱,用正己烷-二氯甲烷(體積比95 ∶5)洗脫;凝膠滲透色譜柱,用正己烷-二氯甲烷(體積比1 ∶1)洗脫。 收集洗脫液,旋轉蒸發(fā)濃縮。

1.2.2.2 轉溶

1.2.2.3 檢測

將生長良好的大鼠肝細胞瘤H4-ⅡE 細胞按每孔2×105個接種到96 孔板中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,棄去培養(yǎng)液。 取無菌潔凈EP 管,先加入995 μL DMEM(添加胎牛血清與雙抗)培養(yǎng)液,再加入5 μL 前處理后的待測樣品,渦旋混勻,按照每孔100 μL 添加于96 孔板中。 每個培養(yǎng)板中添加 DMSO 溶劑對照及2,3,7,8-TCDD 陽性對照,每個待測樣品和對照均設置4 個平行孔。 72 h 后取出96 孔板,棄去溶液,加入100 μL 新鮮配制的含1 μL 1 mmol/L ERF 和0.1 μL 10 mmol/L 雙香豆素的DMEM 培養(yǎng)液,于CO2培養(yǎng)箱中反應60 min 后,加入130 μL 甲醇終止反應,室溫下混勻。 取100 μL 混合液于酶標板中,用酶標儀測定反應終產物RF 的熒光強度,激發(fā)波長設為535 nm,吸收波長設為590 nm。 將96孔板中剩余的反應液吸出,加入NaOH 溶液破碎細胞。 細胞破碎后,吸出100 μL 棄掉,再加入200 μL考馬斯亮藍(G250)染液,反應10 min,用酶標儀在595 nm 吸收波長處測定蛋白吸光值。

1.2.2.4 標準曲線繪制

1)RF 標準曲線。 配制一組濃度范圍為0 ～200 nmol/L 的RF 溶液,在535 nm 激發(fā)波長和590 nm 吸收波長下,用酶標儀測定其熒光值,建立熒光值與濃度之間的線性關系,從而將測得的熒光值轉換成RF 的量(nmol/L)。

2)蛋白標準曲線。 配制一組濃度范圍為0 ～500 mg/mL 的牛血清白蛋白溶液,加入G250 染液200 μL,反應10 min 后,在595 nm 波長處測定吸光度,建立吸光度與蛋白濃度的線性關系,從而計算樣品中的蛋白含量(mg)。

3)2,3,7,8-TCDD 標準曲線。 以離體的大鼠肝細胞瘤H4-ⅡE 細胞為實驗材料,用濃度為0.005 ～200 μg/L 的2,3,7,8-TCDD 標準溶液進行暴露實驗。 在535 nm 激發(fā)波長和590 nm 吸收波長條件下,測定反應終產物RF 的熒光強度和蛋白質含量,繪制熒光強度與2,3,7,8-TCDD 濃度之間的劑量-效應曲線,并計算相應的半數有效濃度(EC50)。 酶活關系曲線由以下Logistic 方程用最小二乘法進行擬合:

式中:Y 為EROD 活性;X 為2,3,7,8-TCDD 濃度,即誘導劑量;A 為最大EROD 活性;B 為回歸曲線中線性區(qū)段的斜率;C 為導致半數最大EROD 活性時的2,3,7,8-TCDD 標準溶液濃度,即EC50;D為最小EROD 活性。

1.2.3 HRGC-HRMS 法檢測

1.3 數據處理和分析

HRGC-HRMS 法測得的毒性當量(TEQ)是由17 種多氯代二苯并二英/呋喃(PCDD/Fs)異構體的實測值與世界衛(wèi)生組織訂立的毒性當量因子(WHO-TEF)相乘得到的,17 種PCDD/Fs 異構體的TEQ 之和為樣品中二英類物質的總毒性當量濃度(后文用WHO-TEQ 表示)。

將樣品酶活性代入2,3,7,8-TCDD 標準曲線,計算得到樣品的2,3,7,8-TCDD 毒性當量(后文用Bio-TEQ 表示)。

所有數據均采用Excel 2003、SPSS 19.0 進行處理與統(tǒng)計分析, 采用 Explore 統(tǒng)計過程和Kolmogorov-Smimov 檢驗確認數據是否呈良好的正態(tài)分布,采用獨立樣本t 檢驗或ANOVA 進行平均值顯著性差異檢驗,顯著性水平設為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 EROD 標準曲線繪制及Bio-TEQ 計算

圖1 和圖2 分別為RF 濃度和蛋白濃度的標準曲線,其線性回歸系數分別為0.999 9 和0.999 7。由圖1 和圖2 可知,在檢測濃度范圍內,RF 濃度與熒光值、蛋白濃度與吸光值之間具有極好的線性關系。

圖1 RF 濃度標準曲線Fig.1 Standard curve for resorufin analysis

圖2 牛血清蛋白標準曲線Fig.2 Standard curve for bovine serum protein

在進行樣品檢測時,EROD 活性用樣品中RF 的值除以蛋白含量和反應時間表示[pmol/(min·mg)]。利用標準誘導物2,3,7,8-TCDD 誘導的EROD 活性作劑量-效應關系標準曲線(圖3)。

圖3 2,3,7,8-TCDD 誘導的EROD活性劑量-效應標準曲線Fig.3 Standard dose-effect curve of EROD activity induced by 2,3,7,8-TCDD

根據2,3,7,8-TCDD 誘導的EROD 活性劑量-效應關系標準曲線得出,EC50為0.49 μg/L,檢測區(qū)間為0.05 ～10 μg/L。 該EC50與SHEN 等[24](0.45 μg/L)、馮忠孚等[21](0.75 μg/L)的研究結果處于同一個數量級,說明本研究建立的檢測體系與其他研究的研究結果具有良好的可比性。 綜上,RF 濃度標準曲線、蛋白濃度標準曲線和EROD 活性劑量-效應關系標準曲線均符合檢測要求,檢測數據可靠,適用于二英類物質的檢測。

2.2 飛灰樣品中二英的回收率

本研究進一步開展了對生物檢測方法前處理過程的改進工作,盡量消除樣品中的非二英類污染物對檢測結果的影響,再探究其與儀器分析法的可比性。

表1 不同前處理方式下飛灰樣品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

表1 不同前處理方式下飛灰樣品中二英的回收率Table 1 Recovery rate of dioxins in fly ash with different pretreatment %

注:“a”“b”“c”中,對于同一樣品,不同字母表示不同前處理方式的檢測結果之間存在顯著差異。

檢測指標 樣品 EP-DMSO EP-Mix 梨形燒瓶-Mix KW2 36.70a 64.41b 74.16c PCDD/Fs KW4 37.67a 61.11b 88.66c FH2 30.73a 40.59b 99.36c

2.3 飛灰樣品中二英類物質的TEQ

采用細分前處理手段結合梨形燒瓶-Mix 前處理手段,利用EROD 法檢測分析了我國南部地區(qū)3 家垃圾焚燒廠飛灰樣品中的二英類物質水平,同時采用HRGC-HRMS 法對相同樣品進行了檢測。 如表2 所示,EROD 法和HRGC-HRMS 法檢測得到的同一飛灰樣品中PCDD/Fs 的TEQ 無顯著差異。 將檢測數據與不同研究團隊采用生物檢測法與儀器分析法測定的環(huán)境樣品二英類污染物含量數據進行比對。 從表3 可以看出,采用傳統(tǒng)生物檢測法測得的檢測值普遍高于儀器分析法,且不同方法的檢測數據之間存在顯著差異,說明本研究所采用的改進后前處理過程能夠消除樣品中的干擾物質對檢測結果的影響,其檢測結果與儀器分析法的檢測結果具有良好的可比性,采用生物檢測法替代儀器分析法檢測二英類污染物已成為可能。

表2 飛灰樣品二英檢測結果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

表2 飛灰樣品二英檢測結果Table 2 Dioxin detected results in fly ash ng/kg

注:對于同一樣品,“a”表示不同檢測方法的檢測結果之間無顯著差異。

檢測物 樣品 WHO-TEQ Bio-TEQ KW2 1.65a 1.52a PCDD/Fs KW4 1.92a 2.09a FH2 0.175a 0.173a

表3 樣品中二英類物質的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

表3 樣品中二英類物質的TEQTable 3 Toxicity equivalent quantity of dioxin in samples

注:“a”“b”中,對于同一樣品,不同字母表示不同檢測方法的檢測結果之間存在顯著差異,相同字母表示不存在顯著差異。

檢測物 樣品 Bio-TEQ WHO-TEQ 參考文獻飛灰1/(ng/kg) 1 020.45a 921.17a [27]PCDD/Fs飛灰2/(ng/kg) 845.78a 738.69a [27]沉積物/(ng/kg) 5.4a 1.6b [28]土壤/(ng/kg) 1.8a 0.1b [28]土壤/(ng/kg) 1 480a 1 300a [29]土壤1/(ng/kg) 146 a 48 b [23]沉積物1/(ng/kg) 76 a 32 b [23]焚燒廢氣1/(pg/m3) 12.1 a 2.5 b [21]焚燒廢氣2/(pg/m3) 18.7a 9.7a [21]廢氣/(ng/m3) 2.7a 2.5a [22]

3 結論