范鵬飛,顧春華,楊陶麗薇,郭嬌嬌,楊雅珺

摘? 要：目的? 通過參加中日聯(lián)合微生物檢測技能考核（2021年第1回合）項目金黃色葡萄球菌（定量）檢驗，提高實驗室競爭力，比較分析顯色平板與Baird-Parker平板菌落計數(shù)結(jié)果的差異性。方法? 采用GB4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》，同時采用顯色平板進(jìn)行計數(shù)，對可疑菌落采用全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果驗證。結(jié)果? 樣品21-Q669用Baird-Parker平板計數(shù)結(jié)果為20000 CFU/mL，顯色平板計數(shù)結(jié)果為19000 CFU/ mL，經(jīng)Duncan法單因素方差分析，差異不顯著（P>0.05），反饋結(jié)果為滿意。結(jié)論? 顯色平板在能力驗證中可以進(jìn)行平板計數(shù)，通過參加技能考核，提升了實驗室競爭力，可以為能力驗證活動及食品中金黃色葡萄球菌檢測提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌; 能力驗證; 平板計數(shù); 比較分析

中圖分類號：O651

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），革蘭氏染色為陽性菌，在顯微鏡下呈葡萄串狀，是一種常見的食源性致病微生物。金黃色葡萄球菌無鞭毛、芽胞，少部分有莢膜，不能運動，為需氧或兼性厭氧菌，最適宜的生長溫度為 37 ℃，pH 值為 7.4[1]。在葡萄球菌屬的 20 多個種中，金黃色葡萄球菌是最嚴(yán)重的致病菌[2]。致病原因為分泌的毒素和侵襲性酶而引起食物中毒，如殺白細(xì)胞素、腸毒素、溶血毒素、血漿凝固酶和脫氧核糖核酸酶[3-4]。可導(dǎo)致人皮膚感染、敗血病、中毒性休克、心內(nèi)膜炎等[5] 。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)，與金黃色葡萄球菌相關(guān)的感染特別是那些表達(dá)多藥耐藥性的感染在逐年增加[6]。

金黃色葡萄球菌鑒定主要有免疫學(xué)方法，包括免疫凝聚和沉淀法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法[7]等;分子生物學(xué)方法包括實時熒光定量PCR技術(shù)[8]、多重PCR技術(shù)[9]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)[10]、數(shù)字PCR系統(tǒng)等[11]。這些方法由于其設(shè)備昂貴，操作人員水平要求高，對于普通實驗室難以達(dá)到。所以常規(guī)平板培養(yǎng)法是食品檢驗中主要的檢測方法，但比較耗時，一般要經(jīng)過培養(yǎng)增菌、劃線純化、形態(tài)觀察、生化鑒定、血清分型等，鑒定結(jié)果至少2～7天。金黃色葡萄球菌定量檢測國標(biāo)（GB4789.10-2016）方法中采用Baird-Parker平板進(jìn)行計數(shù)，該平板是一種選擇性培養(yǎng)基，在含有氮源的基礎(chǔ)上，加入了促生長的丙酮酸鈉和抑制劑亞碲酸鉀，故有較好的選擇性，但對于金黃色葡萄球菌沒有抑制，能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色，易于觀察。加入卵黃，由于卵磷酯酶陽性特征，其菌落周圍可出現(xiàn)明顯的沉淀環(huán)，可與其它菌進(jìn)行區(qū)別。顯色培養(yǎng)基目前發(fā)展的較為成熟，該原理是利用目的菌的特征代謝物與培養(yǎng)基中的物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而使菌落顯現(xiàn)特有顏色，達(dá)到與雜菌分離的方法，目前顯色培養(yǎng)基在食品檢驗中已廣泛應(yīng)用。本試驗采用了Baird-Parker瓊脂平板與金黃色葡萄球菌顯色平板分別進(jìn)行計數(shù)，采用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行分析，比較顯色平板與Baird-Parker平板菌落計數(shù)結(jié)果的差異性，可以為食品中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證和日常檢驗提供參考。

1? 材料及方法

1.1? 材料與試劑

樣品21-Q669（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心發(fā)放）;金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（法國科馬嘉公司）; Baird-Parker瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染液、血平板、凍干兔血漿、L型涂布棒（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）;NID鑒定板（美國BD公司）;金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC6538（廣東微生物研究所）;表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC（B）26069（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.2? 儀器與設(shè)備

IPP260plus生化培養(yǎng)箱（美國墨爾特公司）;CL-32L高壓滅菌器（日本ALP公司）;AC2-5S1生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）; Phoenix M50全自動菌種鑒定儀（美國BD公司）; BX53顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社公司）;sensor turn培養(yǎng)皿自動轉(zhuǎn)盤（德國wld-tec公司）;levo plus電動移液器（北京大龍興創(chuàng)公司）;Votex 2渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

1.3? 方法

1.3.1? 樣品的復(fù)原

用酒精棉球消毒西林瓶外部，小心打開瓶蓋，立即加入20 mL生理鹽水進(jìn)行水化，充分溶解后吸出放入無菌瓶中，用剩余的生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)部，回收清洗液放入上述無菌瓶中，總共60 mL，此溶液即為復(fù)原后60 mL的食品樣品。

1.3.2? 平板計數(shù)

用1 mL無菌移液管吸取樣品原液，加入9 mL生理鹽水管中，制成1∶10（濃度）的樣品勻液，吸取1∶10的樣品勻液1 mL，加入加入9 mL生理鹽水管中，制成1∶100的樣品勻液，以此類推，制成10倍系列的稀釋液。每個稀釋度的稀釋液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入三個Baird-Parker平板和三個顯色平板，用L型涂布棒涂抹均勻，直至平板表面樣液完全吸收，每個稀釋度兩個平行。倒置后于36 ℃培養(yǎng)24 h。金黃色葡萄球菌在BP平板上為灰黑色或黑色、表面光滑、濕潤、凸起的圓形菌落，周圍有不透明沉淀圈，其外常有一清晰帶，在顯色平板上呈紫紅色、紅色、粉紅色，其它菌呈藍(lán)色、無色或抑制生長。

1.3.3? 確證鑒定

（1）血平板

挑取BP平板和顯色平板上各10個典型的菌落，劃線接種于血平板，倒置后于36 ℃培養(yǎng)24 h。在血平板上金黃色葡萄球菌菌落較大，呈黃色或白色、凸起、濕潤的圓形菌落，周圍有完全透明溶血圈。同時血平板上劃線接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，表皮葡萄球菌在血平板上呈濕潤、凸起、白色的圓形菌落，周圍無透明溶血圈。

（2）染色鏡檢

對血平板上典型的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍油鏡下觀察，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，無芽胞，呈葡萄球狀排列，直徑約為0.5～1.0 μm。表皮葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，直徑1.0μm左右，成葡萄狀排列。

（3）血漿凝固酶實驗

將血平板上典型的菌落接種到5 mL 腦心浸出液肉湯管中，36 ℃培養(yǎng)24 h。取0.3 mL BHI培養(yǎng)物加入兔血漿中，，置36 ℃培養(yǎng)箱中，每半小時觀察一次，觀察6 h。同時以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照，以表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陰性對照。

1.3.4? 生理生化鑒定

經(jīng)確證后的菌落，劃線于營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后采用全自動微生物菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，用接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落到4.5 mL的Phoenix ID肉湯管中，制成0.5 McFarland的菌懸液，倒入NID卡后封蓋，放入BD機(jī)箱中進(jìn)行鑒定。

1.3.5? 結(jié)果計算

按照GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》中的計算公式和規(guī)則進(jìn)行計算。

1.3.6? 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，對不同平板計數(shù)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析（P<0.05）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)

經(jīng)Baird-Parker平板與顯色平板分離，樣品中的菌落與金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌菌落形態(tài)基本一致（見表1），但樣品中的疑似金黃色葡萄球菌菌落顏色在Baird-Parker平板上呈灰黑色，而金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌在Baird-Parker平板呈黑色。長期貯存的脫水或冷凍食品中的金黃色葡萄球菌，其菌落顏色較典型菌落淺些，有時可見到?jīng)]有不透明圈和清晰帶的金黃色葡萄球菌，這種菌的其他外觀與典型的金黃色葡萄球菌基本相同，在選取疑似菌時，除典型菌落之外，還應(yīng)對其它有差異的菌落進(jìn)行確證實驗，避免漏掉一些特殊的菌落。

2.2? 確證實驗

對Baird-Parker平板和顯色平板中的疑似菌落進(jìn)行確證實驗（見表2），對第二稀釋度平板上的疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、血平板劃線和血漿凝固酶試驗，挑取的20個菌落革蘭氏染色鏡檢均為陽性球菌，40個疑似菌落劃線血平板后均有溶血圈，40個菌落進(jìn)行血漿凝固酶試驗均為陽性。利用微生物全自動菌種鑒定系統(tǒng)對較小菌落、較大菌落、黑色菌落、灰黑色菌落和沉淀圈不明顯的菌落進(jìn)行鑒定，其鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌（見表3），置信度均在97 %以上，為極好的鑒定。

2.3? 平板計數(shù)

樣品平板涂布后計數(shù)的原始數(shù)據(jù)見表4，樣品原液和第一稀釋度菌落多不可計，第二稀釋度和第三稀釋度平板上涂布均勻，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10-2016中的計算公式，Baird-Parker平板中平行1和顯色平板中平行1和平行2的數(shù)值用公式1計算，Baird-Parker平板中平行2的值用公式2計算，其結(jié)果見表5。

2.4? 統(tǒng)計分析

根據(jù)國標(biāo)GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》，選取菌落數(shù)在20～200之間的平板計算菌落數(shù)，即第二稀釋度和第三稀釋度的值符合要求。對兩種培養(yǎng)基第二稀釋度的菌落數(shù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 4.235，P = 0.176，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表6。對兩種培養(yǎng)基第三稀釋度的菌落數(shù)進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 1.000，P = 0.423，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表 7。用兩種培養(yǎng)基最終計算結(jié)果進(jìn)行Duncan法單因素方差分析，F(xiàn) = 2.000，P = 0.293，差異不顯著（P > 0.05），結(jié)果見表 8。由此可見，金黃色葡萄球菌定量檢測中，使用顯色培養(yǎng)基和Baird-Parker培養(yǎng)基分別計數(shù)，其結(jié)果差異不顯著，顯色培養(yǎng)基可以在金黃色葡萄球菌定量能力驗證中計數(shù)。

3? 結(jié)論與討論

樣品21-Q669用Baird-Parker平板計數(shù)結(jié)果為20000 CFU/mL顯色平板計數(shù)結(jié)果為19000 CFU/mL，最終所報的值采用了Baird-Parker平板計數(shù)結(jié)果，反饋值為Z = 0.00（|Z| ≤ 2為滿意結(jié)果，2.0<|Z |<3.0為可疑結(jié)果，|Z| ≥ 3.0為不滿意結(jié)果。），評價結(jié)果為滿意。若采用顯色平板計數(shù)結(jié)果，其值也在通報數(shù)值范圍內(nèi)（13000～32000 CFU/mL）。在檢驗過程中需要注意的是，使用鑒定合格的移液槍，培養(yǎng)基均應(yīng)驗收合格，涂布同一稀釋度平板應(yīng)使用同一涂布棒，以減少誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確。對兩種培養(yǎng)基的計數(shù)結(jié)果，分別選取了第二稀釋度和第三稀釋度平板上計數(shù)的值，以及兩種培養(yǎng)基計數(shù)后最終計算結(jié)果進(jìn)行了Duncan法單因素方差分析，分析表明，顯色培養(yǎng)基和Baird-Parker瓊脂計數(shù)結(jié)果差異不顯著（P > 0.05），顯色培養(yǎng)基在能力驗證中可以用作金黃色葡萄球菌計數(shù)。由于顯色培養(yǎng)基可以區(qū)分出雜菌，排除干擾菌，在計數(shù)時更直觀明了，節(jié)省檢驗時間，尤其在能力驗證中，采用不同的方法進(jìn)行檢驗，可以相互驗證和比較，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

金黃色葡萄球菌遍布于自然界，很多食品容易被污染，在食品致病菌檢驗中為重要的檢測項目，其中乳制品、水果干制品、肉類、糕點等較容易檢出[12]。引起污染的原因主要為原料帶菌、生產(chǎn)過程滅菌不徹底、生產(chǎn)人員污染等。目前金黃色葡萄球菌檢驗主要采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法[13-14]，食品中以GB4789.10-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》為依據(jù)。目前，顯色培養(yǎng)基在多個國家標(biāo)準(zhǔn)中被應(yīng)用，比如GB4789.4-2016、GB4789.5-2012、GB4789.7-2013等方法中均采用了顯色培養(yǎng)基，但食品中金黃色葡萄球菌檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)中只采用了Baird-Parker瓊脂。顯色培養(yǎng)基發(fā)展已經(jīng)較為成熟，比如法國科瑪嘉公司和北京陸橋公司等生產(chǎn)的顯色培養(yǎng)基靈敏度高、質(zhì)量穩(wěn)定、易觀察，幫助檢驗人員節(jié)約了大量的檢驗時間，提高了檢出率。在日常檢驗以及能力驗證中，顯色培養(yǎng)基可以作為不同的方法進(jìn)行檢測，利用顯色培養(yǎng)基檢測金黃色葡萄球菌，較傳統(tǒng)的 Baird - Parker 更易于區(qū)分雜菌，具有較好的檢測效果，有良好的應(yīng)用前景[15]。

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