馬昳超，劉 峻，章若紅，朱佳歡，杜歡政，陸 莎

微生物響應(yīng)PBAT-PLA生物降解膜袋工業(yè)需氧堆肥降解機(jī)制

馬昳超1,2，劉 峻1※，章若紅1，朱佳歡1，杜歡政2，陸 莎2

（1. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 201114；2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200086）

塑料污染已對(duì)全球環(huán)境造成嚴(yán)重威脅，生物降解塑料的推廣使用及其工業(yè)堆肥是治理塑料污染的有效途徑之一。該研究根據(jù)GB/T 19277.1—2011，在（58±2）℃的特殊高溫條件下，對(duì)PBAT-PLA生物降解膜袋進(jìn)行有氧堆肥降解，并選擇微晶纖維素作為對(duì)照。通過對(duì)堆肥中的微生物進(jìn)行16S/18S高通量測(cè)序，分析降解過程中細(xì)菌/真菌的群落種類和數(shù)量變化，包括物種多樣性、物種組成、物種差異分析、樣本比較分析，并結(jié)合掃描電鏡下的微觀形貌，深入探尋可降解塑料膜袋在工業(yè)需氧堆肥過程中的微生物響應(yīng)降解機(jī)制。結(jié)果表明：微晶纖維素和生物降解膜袋在降解活躍期（第140天取樣），其所在堆肥中大量存在的優(yōu)勢(shì)菌屬為（球桿菌屬，放線菌綱），分別占比20.25%和39.44%。與同樣條件下不含降解材料的對(duì)照組堆肥相比，微晶纖維素/生物降解膜袋工業(yè)需氧堆肥降解過程中顯著增長(zhǎng)的4種菌屬中有3種屬于放線菌，說(shuō)明放線菌對(duì)聚酯物的解聚以及纖維素的降解具有積極的作用。試驗(yàn)結(jié)果也表明了聚酯和纖維素的完整生物降解過程不依賴單一菌種，而是微生物協(xié)同作用的結(jié)果。

微生物；塑料；降解；生物降解膜袋；工業(yè)需氧堆肥；高通量測(cè)序

0 引 言

自20世紀(jì)50年代以來(lái)，全球共生產(chǎn)了83億t塑料，其中63億t成為塑料垃圾。目前全球年均使用5 000億個(gè)塑料袋，并造成至少800萬(wàn)t塑料進(jìn)入海洋[1]。2020年1月19日中國(guó)公布《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)塑料污染治理的意見》，要求積極推廣可循環(huán)、易回收、可降解的替代產(chǎn)品，規(guī)范塑料廢棄物的回收利用。降解產(chǎn)品，特別是生物降解塑料制品的使用是解決部分一次性塑料制品污染的有效方案。為了完善生物降解塑料制品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)并實(shí)施監(jiān)管，中國(guó)針對(duì)不同降解環(huán)境，也發(fā)布了一系列的可降解檢測(cè)相關(guān)國(guó)標(biāo)。其中使用較為廣泛的是標(biāo)準(zhǔn)《受控堆肥條件下材料最終需氧生物分解能力的測(cè)定—采用測(cè)定釋放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法：GB/T 19277.1—2011》[2]。通過受控堆肥處理固體廢物是處理和回收有機(jī)廢物材料的一種有價(jià)值的方法[3]。可生物降解塑料的堆肥是廢品回收的一種形式，可減少對(duì)填埋場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求，但其降解過程會(huì)對(duì)堆肥產(chǎn)生一定的影響，且其降解產(chǎn)物會(huì)影響食物鏈[4]。因此，研究生物降解塑料的降解機(jī)制及其環(huán)境微生物響應(yīng)具有重要的意義。

生物降解塑料是指在細(xì)菌、真菌、藻類等自然界存在的微生物作用下發(fā)生生化、物理作用而降解或分解的材料[5]。理想的生物降解塑料在廢棄后最終可被環(huán)境微生物完全分解并生成CO2和水，進(jìn)入自然生物圈的物質(zhì)循環(huán)系統(tǒng)，不再對(duì)生態(tài)環(huán)境造成危害[3]。近年來(lái)，生物降解塑料的降解機(jī)理一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[6]。Haider等[7]指出生物降解塑料的降解過程主要包括生物腐蝕，胞外酶的解聚合，微生物同化降解及礦化。Gu等[8]總結(jié)了幾種聚合物材料降解中涉及的機(jī)理和微生物，長(zhǎng)鏈聚合物由于分子較大，難以通過微生物細(xì)胞膜。在降解過程中，來(lái)自微生物的胞外酶分解長(zhǎng)鏈聚合物，產(chǎn)生短鏈或更小分子的聚合物（例如低聚物、二聚體和單體）的過程叫做解聚合。解聚合過程使聚合物分子變小，部分小分子化合物可以由細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸?shù)任兆饔眠M(jìn)入胞內(nèi)。這些短鏈分子可以作為碳源供細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，并最終以CO2、H2O或CH4等代謝物的形式排放到胞外。Weng等[9]將聚乳酸（Polylactic Acid，PLA）、聚己二酸/對(duì)苯二甲酸丁二醇酯（Poly Butylene Adipate-co-terephthalate，PBAT)和PBAT/PLA薄膜樣品埋在真實(shí)的土壤環(huán)境中。定期從土壤中采集殘留降解樣品，并通過掃描電鏡、差示掃描量熱法、熱重分析、紅外和元素分析的表征探尋降解機(jī)理。Bonilla等[10]采用OECD 301d標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)殼聚糖、PBAT和高密度聚乙烯（High Density Polyethylene，HDPE）聚合物進(jìn)行了生物降解試驗(yàn)。并通過記錄照片，紅外，掃描電鏡，彈性模量和拉伸強(qiáng)度等指標(biāo)研究其降解規(guī)律與機(jī)理。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)PLA-PBAT農(nóng)膜在不同地區(qū)土壤中的降解程度不同，同時(shí)可降解塑料農(nóng)膜的使用會(huì)改變土壤微生物群落。生物降解的過程復(fù)雜而多樣化，受溫度、濕度、菌群種類等因素影響。然而對(duì)目前最常使用的受控工業(yè)需氧堆肥（58±2）℃特殊條件下的降解機(jī)制研究尚為空白。

本研究根據(jù)GB/T 19277.1—2011，在受控工業(yè)需氧堆肥條件下，對(duì)微晶纖維素（作為參比）、生物降解膜袋實(shí)施降解。通過對(duì)堆肥中的細(xì)菌/真菌進(jìn)行16S/18S高通量測(cè)序，來(lái)分析降解過程中細(xì)菌/真菌的群落變化，包括物種多樣性、物種形成、物種差異分析、樣本比較分析，并結(jié)合掃描電鏡下的微觀形貌分析，深入探尋可降解塑料膜袋的微生物響應(yīng)降解機(jī)理。為今后優(yōu)化工業(yè)堆肥技術(shù)，提升可降解塑料檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)打下理論基礎(chǔ)，更為今后生物降解塑料膜袋大面積推廣，及其堆肥產(chǎn)品在新型功能農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的可行性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生物降解膜袋（無(wú)印良品）主要基材為65% PBAT、5% PLA，并含有30%滑石粉。生物降解率測(cè)試所用參比物為微晶纖維素，購(gòu)于國(guó)藥試劑（品牌sigma-aldrich，產(chǎn)品號(hào)S3504，CAS 9004-34-6，粒徑20m，色譜級(jí)）。有機(jī)堆肥購(gòu)于上海質(zhì)檢院合作堆肥廠（堆肥粒徑<0.5 cm，碳氮比10～40，干固體比例68.7%，揮發(fā)性固體比例27.75%）。

1.2 受控工業(yè)堆肥需氧生物分解率測(cè)試

材料在受控工業(yè)堆肥條件下最終需氧的生物分解能力依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 19277.1—2011測(cè)定，采用測(cè)定釋放CO2的方法，在上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院進(jìn)行測(cè)試。降解測(cè)試設(shè)備包含生物降解反應(yīng)系統(tǒng)與紅外在線式氣體分析系統(tǒng)兩大模塊，由SQI搭建。在工業(yè)需氧堆肥（58±2）℃條件下，按6：1把干基質(zhì)量為300 g的培養(yǎng)土和干基質(zhì)量為50 g的PBAT-PLA膜袋或微晶纖維素放入2 L降解反應(yīng)容器，測(cè)定材料最終需氧生物分解能力[12]，每個(gè)樣品平行測(cè)試3次。微晶纖維素作為參比材料，可驗(yàn)證堆肥環(huán)境的降解適宜性。由于原堆肥中本身含有機(jī)碳源，因此還需進(jìn)行對(duì)照組堆肥降解測(cè)試，用以扣除堆肥中自帶碳源的影響。定期關(guān)注降解反應(yīng)容器中堆肥混合物的濕度，若容器頂部無(wú)冷凝水，則需要從瓶口加水調(diào)節(jié)水份，使堆肥含水量保持在約50%。使用紅外在線式氣體分析系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)容器中產(chǎn)生的CO2進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)，并累計(jì)所產(chǎn)生的CO2量。由式（1）可得，降解材料實(shí)際產(chǎn)生的CO2量與該材料理論CO2的產(chǎn)生量之比為生物分解百分率D（%）。

式中(CO2)T為每個(gè)含有降解材料混合物的降解測(cè)試容器累計(jì)釋放出的CO2量，g；(CO2)B為3個(gè)對(duì)照組測(cè)試容器累計(jì)放出的CO2量平均值，g；ThCO2為降解材料產(chǎn)生的CO2理論釋放量，g。

1.3 環(huán)境微生物群落多樣性測(cè)序及交互式分析

1.3.1 堆肥樣品取樣與DNA抽提

選取生物降解率曲線趨于平穩(wěn)前的最后時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)生物分解率測(cè)試已基本完成，而微生物所需的碳源依然充足，仍處于降解活躍期。分別提取原樣品、對(duì)照組、纖維素堆肥以及生物降解膜袋堆肥，標(biāo)記為堆肥A、B、C、D，詳細(xì)的堆肥樣品信息見表1，每個(gè)樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)。取樣前將反應(yīng)器充分混勻，使用滅菌藥匙取1～2 g堆肥樣品，裝入無(wú)菌容器，干冰冷藏條件下送檢。DNA抽提選用土壤DNA抽提試劑盒（FastDNA? Spin Kit for Soil 116560-200，美國(guó)MP）。

表1 堆肥樣品信息

1.3.2 16S rDNA和18S rDNA高通量測(cè)序

16S rDNA和18S rDNA高通量測(cè)序由上海美吉生物有限公司使用MiSeq PE300平臺(tái)（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行。16S rDNA使用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴(kuò)增每個(gè)樣本中細(xì)菌16S rRNA的基因[13]。使用引物SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）擴(kuò)增真菌18S rRNA基因[14]。

1.3.3 生物信息分析

原始序列使用USEARCH 7.1進(jìn)行質(zhì)量控制程序[15]。使用 UPARSE 7.0.1090軟件將具有97%或更高相似性的序列聚類為操作分類單元（OUT）[16]。使用包含細(xì)菌和真菌rRNA序列的SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)（版本138）對(duì)序列進(jìn)行分類[17]。使用美吉生信云平臺(tái)從Alpha多樣性水平評(píng)估微生物多樣性，包括豐富度（Chao，Ace）、多樣性（Shannon，Simpson）和測(cè)序覆蓋率（Coverage）。進(jìn)一步分析屬水平下堆肥中細(xì)菌/真菌組成，使用Student’s T檢驗(yàn)比較兩組間的差異，并使用Beta多樣性（主坐標(biāo)分析）比較堆肥樣品的差異性[15]。

1.4 掃描電鏡

掃描電子顯微鏡圖像由掃描電鏡（FEI，F(xiàn)P Quanta 250）拍攝。工業(yè)堆肥降解后的微晶纖維素與堆肥充分混合，難以直接分離。取纖維素和堆肥混合樣品置于去離子水中，攪勻并靜置，降解后的微晶纖維素，由于分子鍵的斷裂，分子量減小，因此會(huì)漂浮于水面。靜置后取上層液體，滴于鋁箔紙，放于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干后待測(cè)。夾取降解后堆肥中的生物膜袋碎片，使用去離子水漂洗去除膜袋表面堆肥后，將膜袋碎片鋪于鋁箔紙上，然后放入通風(fēng)櫥自然風(fēng)干。經(jīng)過預(yù)處理的微晶纖維素和生物膜袋樣品分別鍍金，在20.00 kV，放大3 000倍條件下進(jìn)行掃描電鏡觀察[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 受控需氧工業(yè)堆肥條件下膜袋生物分解率

生物降解膜袋樣品與微晶纖維素的生物分解百分率曲線如圖1所示。試驗(yàn)初期，纖維素的生物分解速度較PBAT-PLA生物降解膜袋的分解速度更快。第60天時(shí)，纖維素的生物分解率達(dá)到76.6%±2.9%，隨后其降解速度放緩。在第90 天時(shí)，膜袋和纖維素的生物分解率分別為81.1%±4.1%和80.0%±2.7%，隨后兩者的分解率開始趨于一致，PBAT-PLA膜袋的分解率略高于纖維素。第120 天時(shí)，PBAT-PLA膜袋和微晶纖維素的生物分解率分別為91.4%±3.4%和87.5%±2.0%，繼續(xù)培養(yǎng)至第150 天，分別達(dá)到98.8%±1.8%和95.1%±2.2%。因此，本研究選擇在第140 天根據(jù)表1分別提取堆肥樣品，進(jìn)行16S rDNA和18S rDNA高通量測(cè)序，此時(shí)膜袋和纖維素的生物分解率已接近最高值，但微生物生存所需碳源還沒有完全耗盡，微生物依然保持活性，因此對(duì)這一時(shí)間段的微生物群落進(jìn)行分析對(duì)研究工業(yè)堆肥中的生物降解塑料降解機(jī)制具有重要價(jià)值。

2.2 堆肥中微生物群落多樣性分析

Alpha多樣性反映了堆肥反應(yīng)體系內(nèi)微生物群落的多樣性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有Shannon、Simpson、Chao、Ace、Coverage，堆肥中細(xì)菌和真菌的Alpha多樣性指數(shù)見表2。所有樣品的群落覆蓋度（coverage）均在0.999以上，表明樣品測(cè)序結(jié)果能夠反映實(shí)際情況。Shannon和Simpson指數(shù)可表示堆肥樣品中微生物群落的多樣性。Shannon值越大，群落多樣性越高；Simpson 指數(shù)值越大，群落多樣性越低[19]。由表2中的Shannon和Simpson指數(shù)可見，堆肥B的細(xì)菌多樣性顯著低于原堆肥A。這是因?yàn)楣I(yè)堆肥（58±2）℃的特殊環(huán)境下，只有部分嗜熱菌能夠生存。同時(shí)由于降解周期長(zhǎng)達(dá)150 d，堆肥中的能量來(lái)源逐漸被消耗，造成一部分細(xì)菌的死亡。而堆肥C和D中，由于加入了纖維素或生物降解購(gòu)物袋，為對(duì)其降解起作用的細(xì)菌提供了碳源，使這類細(xì)菌大量繁殖，因此堆肥C和D的細(xì)菌多樣性顯著高于堆肥B。如表2所示，4個(gè)堆肥樣品中的真菌多樣性變化不顯著，這可能是因?yàn)樵冢?8±2）℃的特殊環(huán)境下，僅部分嗜熱真菌能夠生存。而在堆肥A中，雖然是室溫環(huán)境，但堆肥濕度僅約18%，干燥的環(huán)境不適宜多數(shù)真菌生存，因此4個(gè)堆肥樣品的生物多樣性沒有顯著改變。Ace和Chao指數(shù)用來(lái)估計(jì)群落中含有OTU數(shù)目，兩者算法不同，都體現(xiàn)了堆肥樣品的微生物群落豐度。堆肥樣品中細(xì)菌豐度的變化規(guī)律與多樣性類似。由于工業(yè)堆肥（58±2）℃的特殊環(huán)境，造成真菌多樣性的變化不大，而試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示真菌豐度受堆肥中溫度和碳源的影響，其中堆肥B（對(duì)照組）顯示出了最低的真菌豐度。

表2 堆肥中細(xì)菌/真菌Alpha多樣性指數(shù)

2.3 堆肥中微生物的物種組成

進(jìn)一步對(duì)堆肥樣品的物種組成相似性及重疊情況進(jìn)行研究，可以分析得到4組堆肥樣品中所共有和獨(dú)有的物種數(shù)目（圖2）。在細(xì)菌屬水平上，與堆肥A相比，堆肥B中由于溫度升高，碳源不足，241種細(xì)菌消失，并出現(xiàn)6種新的細(xì)菌。而由于碳源的添加，原本在堆肥B中消失的細(xì)菌，又在堆肥C和D中分別出現(xiàn)了46和38種，其中19種是共有細(xì)菌。4組堆肥中真菌的物種數(shù)目整體偏低，這與上述Shannon和Simpson指數(shù)所體現(xiàn)出的真菌多樣性結(jié)果一致。堆肥D中顯示出了3種獨(dú)有真菌。

圖3展示了屬水平下堆肥中細(xì)菌和真菌的組成。在屬水平上，4種堆肥里排名前十的菌群有，SBR1031，n_S0134，，，，，，和。相較于室溫存放的原堆肥，工業(yè)堆肥條件下的堆肥B，C，D樣品中，在屬水平上出現(xiàn)了2種獨(dú)有菌群，分別是（各占1.63%，5.47%和4.82%）和（各占7.21%，0.70%和2.69%）。此外，和的占比顯著提高。在堆肥B，C，D中，最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是，其占比從原堆肥A中的0.52%分別提高到40.69%，20.25%和39.44%。（球桿菌屬）屬于（球桿菌科），（放線菌綱）[20]。Ma等[21]研究了污泥堆肥過程中微生物演替的變化，研究發(fā)現(xiàn)在整個(gè)堆肥時(shí)間演變的過程中，都是優(yōu)勢(shì)菌群之一。Storey等[22]分別將用乳品廢水污泥和硝酸銨鈣作為氮源加入用來(lái)生產(chǎn)堆肥。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種堆肥中，都是堆肥成熟階段最豐富的菌屬，此結(jié)果與本研究一致。除以外，優(yōu)勢(shì)菌群中的，和均屬于放線菌[20]。放線菌在堆肥過程中非常重要，因?yàn)樗鼈兡軌蚪到饫w維素和幾丁質(zhì)，大多數(shù)報(bào)道的-葡萄糖苷酶序列與放線菌門有關(guān)，這是堆肥成熟度的典型指標(biāo)[23-24]。而優(yōu)勢(shì)菌群中的其他菌屬所屬的門，如，，等，都是堆肥中常見的細(xì)菌類別[25-26]。

相較于堆肥A，在真菌屬水平上堆肥B，C，D中（ABCD分別為28.87%，5.43%，5.68%，8.82%）和（ABCD分別為11.08%，2.18%，4.30%，2.06%）的豐度顯著降低，而（ABCD樣品中分別為1.13%，8.24%，20.96%，18.29%），（ABCD樣品中分別為1.61%，21.89%，9.34%，10.12%），（ABCD樣品中分別為0.14，10.76%，8.98%，12.42%）和（ABCD樣品中分別為0.21%，6.43%，5.31%，4.64%）的豐度顯著增高。說(shuō)明這些真菌屬均受工業(yè)堆肥過程影響。

2.4 堆肥樣本物種差異分析

堆肥B作為工業(yè)堆肥環(huán)境下的對(duì)照組樣品，其溫濕度等環(huán)境條件與堆肥C，D保持一致，僅缺少額外添加的碳源（微晶纖維素/生物降解購(gòu)物袋）。因此我們使用Student’s T檢驗(yàn)，分別比較堆肥B，C和堆肥B，D中占比排名前15位的細(xì)菌及真菌物種組成差異，堆肥C、D中顯著增加的微生物可被認(rèn)為是參與工業(yè)堆肥降解作用的關(guān)鍵菌。結(jié)果表明，屬水平下堆肥C中沒有顯著增多的真菌，而顯著增多的細(xì)菌有0134（=0.011 7），（=0.007 1）和（=0.0158）。0134屬于（門），僅與土壤環(huán)境相關(guān)，被報(bào)道不利于固氮和固碳[27-28]。屬于（腈基降解菌亞綱），與同屬（放線菌綱）。

相較于堆肥B，堆肥D中的屬細(xì)菌（=0.043 4）和屬真菌（=0.0469）的含量顯著增加。屬下的一些菌株，被報(bào)道具有酯酶和脂肪酶活性，如從植物根際土壤中分離出的的酯酶和脂肪酶活性被報(bào)道呈陽(yáng)性[29]，的酯酶（C4）活性呈陽(yáng)性[30]，的酯酶（C4）、酯酶/脂肪酶（C8）也被報(bào)道呈陽(yáng)性[31]。PBAT和PLA均是通過酯鍵縮合而成，其降解過程需要通過酯鍵的斷裂來(lái)完成。此外，嗜熱真菌被認(rèn)為是堆肥材料中的重要微生物群，因?yàn)樗鼈兣c頑固底物（如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等）的降解有關(guān)，其中是堆肥中常見的一種[21,32]。

進(jìn)一步對(duì)堆肥C和D中的細(xì)菌在屬水平上進(jìn)行比較。堆肥C中的0134，和的占比相較于堆肥D顯著更高。結(jié)合上述分析可知，和（屬放線菌綱）對(duì)微晶纖維素的降解具有特定積極作用。在真菌屬水平上，堆肥D中的相較于堆肥C具有更高占比，然而對(duì)比堆肥B，在堆肥C、D中的物種占比都呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明該真菌屬在添加外源纖維素/生物降解塑料的工業(yè)堆肥過程中受到了抑制。其中微晶纖維素在降解過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，對(duì)有更強(qiáng)的抑制作用。在自然界中，真菌被認(rèn)為是纖維素的主要降解微生物。雖然放線菌對(duì)纖維素的降解能力不及真菌，但由于工業(yè)堆肥(58±2)℃的特殊高溫環(huán)境不適宜多數(shù)真菌生存，而放線菌能夠形成孢子，較真菌耐高溫。因此在高溫條件下，放線菌對(duì)纖維素和PBAT-PLA膜袋的降解都起了重要作用[25,33]。

綜合上述分析我們可以發(fā)現(xiàn)，堆肥C，D中大量存在的優(yōu)勢(shì)菌主要是放線菌，且較對(duì)照組B具有顯著增長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。對(duì)比堆肥C、D，和對(duì)微晶纖維素的降解具有特定積極作用。由于工業(yè)堆肥（58±2）℃的特殊高溫環(huán)境，PBAT-PLA膜袋與微晶纖維素的關(guān)鍵降解微生物相似，均屬放線菌綱，在屬水平上略有差異。放線菌對(duì)聚酯物的解聚以及纖維素的降解具有積極的作用，但有研究報(bào)道，它們不能代謝一些所形成的產(chǎn)物[6,34-35]。因此，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可表明完整的聚酯和纖維素的生物降解是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。

2.5 堆肥樣本比較分析

主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）（圖4）直觀地展示了屬水平下堆肥樣本之間細(xì)菌/真菌的差異性。在細(xì)菌PCoA圖中，堆肥A和堆肥B處在不同的象限，細(xì)菌群落差異很大。堆肥C和D由于添加了碳源（微晶纖維素/生物降解膜袋），因此與堆肥B也有差異，但堆肥C和堆肥D的細(xì)菌群落差異較小。4種堆肥在屬水平下的真菌群落差異也顯示了類似的規(guī)律。結(jié)果與上文的指標(biāo)保持了較好的一致性。

2.6 掃描電鏡圖像

研究認(rèn)為微生物的分解主要發(fā)生在有機(jī)物表面的生物膜中[6]。因此利用掃描電鏡分別觀察微晶纖維素及生物降解膜袋在工業(yè)堆肥前后的表面微觀形態(tài)，從而對(duì)其工業(yè)堆肥降解機(jī)制進(jìn)行一定的研究（圖5）。掃描電鏡結(jié)果顯示在微晶纖維素和生物降解膜袋表面都覆蓋了一層生物膜，且構(gòu)成這一類生物膜的主要是成簇團(tuán)狀的橢圓形菌。經(jīng)過與16 s堆肥中細(xì)菌組成結(jié)果的比對(duì)確認(rèn)，我們可以推斷這些橢圓的菌為（球桿菌）。在膜袋降解所形成的生物膜中，還有少部分條狀菌（推測(cè)其為放線菌）和絲狀物（推測(cè)其為絲狀真菌）。因此推測(cè)PBAT-PLA生物降解膜袋的降解，是微生物（包括真菌，細(xì)菌，如放線菌等）群落定植并產(chǎn)生的協(xié)同作用效應(yīng)[36]。

2.7 討論

本研究根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19277.1—2011，在受控工業(yè)需氧堆肥條件下，對(duì)微晶纖維素和PBAT-PLA生物降解膜袋降解過程中的微生物響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究。第150天時(shí)，PBAT-PLA膜袋和微晶纖維素的生物分解率分別為98.8%±1.8%和95.1%±2.2%。故選取第140天的各組堆肥樣品進(jìn)行16S rDNA和18S rDNA高通量測(cè)序，此時(shí)的降解過程已處于中后期，微生物群落已相對(duì)穩(wěn)定，并且由于碳源未耗盡，微生物依然保持活性。本研究旨在通過對(duì)降解過程中堆肥的細(xì)菌/真菌的群落變化分析，分析堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌、顯著增長(zhǎng)菌，從而為今后篩選降解關(guān)鍵作用菌提供重要理論依據(jù)，后續(xù)有望在堆肥降解過程中，接種該菌，提高該菌濃度，從而加快降解速度，幫助突破現(xiàn)有可降解檢測(cè)技術(shù)中檢測(cè)周期長(zhǎng)的技術(shù)壁壘，提高檢測(cè)效率。同時(shí)，通過對(duì)PBAT-PLA膜袋（為可降解農(nóng)用地膜最常用配方）降解所產(chǎn)堆肥的微生物群落進(jìn)行分析，能夠作為重要參考指標(biāo)，用以評(píng)估生物降解塑料所生產(chǎn)的堆肥對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境等的影響。因此，本研究為工業(yè)堆肥技術(shù)的優(yōu)化和可降解塑料檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的完善奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，為可降解塑料膜袋的規(guī)?；茝V，及其堆肥產(chǎn)品在新型功能農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的可行性研究提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

1）在工業(yè)堆肥（58±2）℃的條件下，對(duì)照組堆肥相較于原堆肥，細(xì)菌多樣性顯著降低，僅部分嗜熱菌繼續(xù)生存。而纖維素和生物降解膜袋堆肥，由于提供了額外碳源，細(xì)菌多樣性顯著高于堆肥B。4個(gè)堆肥樣品中細(xì)菌豐度的變化規(guī)律與多樣性類似。真菌多樣性因受工業(yè)堆肥（58±2）℃這一特殊環(huán)境影響并無(wú)顯著性變化，而豐度也受堆肥中溫度和碳源的影響，其中對(duì)照組堆肥顯示出了最低的真菌豐度。

2）在屬水平上，對(duì)照組、纖維素和生物降解膜袋堆肥中最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是，其占比從堆肥A中的0.52%分別提高到40.69%，20.25%和39.44%。除以外，優(yōu)勢(shì)菌群中的，和均屬于放線菌。

3）使用Student’s T檢驗(yàn)，分別比較對(duì)照組和纖維素堆肥，以及對(duì)照組和生物降解膜袋堆肥的細(xì)菌及真菌物種組成差異。屬水平下纖維素堆肥中顯著增多的細(xì)菌有0134，和，其中后兩者屬（放線菌綱）。相較于對(duì)照組堆肥，生物降解膜袋堆肥在屬水平上顯著增加的細(xì)菌是，顯著增加的真菌是。進(jìn)一步比較纖維素和生物降解膜袋堆肥，發(fā)現(xiàn)和（屬放線菌綱）對(duì)微晶纖維素的降解具有特定積極作用。在工業(yè)堆肥（58±2）℃的特殊高溫環(huán)境下，參與PBAT-PLA膜袋與微晶纖維素降解過程的關(guān)鍵降解微生物相似，均屬于放線菌綱，僅在屬水平上略有差異。

4）通過掃描電鏡觀察微晶纖維素/生物降解膜袋的微觀形貌，發(fā)現(xiàn)其表面覆蓋了一層生物膜，其主要構(gòu)成為簇團(tuán)狀的橢圓形菌，推斷其為。

綜合上述分析可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組堆肥相比，纖維素和生物降解膜袋堆肥中的大量存在并顯著增長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)菌屬為，屬于放線菌。放線菌對(duì)聚酯物的解聚以及纖維素的降解具有積極的作用，但完整的的聚酯和纖維素的生物降解不依賴單一菌種，而是微生物協(xié)同作用的結(jié)果。

[1] 聯(lián)合國(guó)向“白色污染”宣戰(zhàn)[N]. 2021-12-30，http: //www. jjckb. cn/2018-12/10/c_137662157. htm?from=singlemessage.

[2] 刁曉倩，翁云宣，宋鑫宇，等. 國(guó)內(nèi)外生物降解塑料產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)塑料，2020，34(5)：123-135.

Diao Xiaoqian, Weng Yunxuan, Song Xinyu, et al. Development status of biodegradable plastics industry at home and abroad[J]. China Plastics, 2020, 34(5): 123-135. (in Chinese with English abstract)

[3] Shah A A, Hasan F, Hameed A, et al. Biological degradation of plastics: A comprehensive review[J]. Biotechnology Advances, 2008, 26(3): 246-265.

[4] Tosin M, Degli-Innocenti F, Bastioli C. Detection of a toxic product released by a polyurethane-containing film using a composting test method based on a mineral bed[J]. Journal of Environmental Polymer Degradation, 1998, 6(2): 79-90.

[5] Sudesh K, Iwata T. Sustainability of biobased and biodegradable plastics[J]. Clean–Soil, Air, Water, 2008, 36(56): 433-442.

[6] Lucas N, Bienaime C, Belloy C, et al. Polymer biodegradation: Mechanisms and estimation techniques: A review[J]. Chemosphere, 2008, 73(4): 429-442.

[7] Haider T P, V?lker C, Kramm J, et al. Plastics of the future? The impact of biodegradable polymers on the environment and on society[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2019, 58(1): 50-62.

[8] Gu J D. Microbiological deterioration and degradation of synthetic polymeric materials: Recent research advances[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2003, 52(2): 69-91.

[9] Weng Y X, Jin Y J, Meng Q Y, et al. Biodegradation behavior of poly (butylene adipate-co-terephthalate)(PBAT), poly (lactic acid)(PLA), and their blend under soil conditions[J]. Polymer Testing, 2013, 32(5): 918-926.

[10] Bonilla J, Paiano R B, Louren?o R V, et al. Biodegradability in aquatic system of thin materials based on chitosan, PBAT and HDPE polymers: Respirometric and physical-chemical analysis[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 164: 1399-1412.

[11] Zhang M, Jia H, Weng Y, et al. Biodegradable PLA/PBAT mulch on microbial community structure in different soils[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2019, 145: 104817.

[12] 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GBT 19277. 1. 受控堆肥條件下材料最終需氧生物分解能力的測(cè)定采用測(cè)定釋放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[13] Huws S A, Edwards J E, Kim E J, et al. Specificity and sensitivity of eubacterial primers utilized for molecular profiling of bacteria within complex microbial ecosystems[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 70(3): 565-569.

[14] Rousk J, B??th E, Brookes P C, et al. Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil[J]. The ISME Journal, 2010, 4(10): 1340-1351.

[15] Ren S, Lu A, Guo X, et al. Effects of co-composting of lincomycin mycelia dregs with furfural slag on lincomycin degradation, degradation products, antibiotic resistance genes and bacterial community[J]. Bioresource Technology, 2019, 272: 83-91.

[16] Edgar R C. UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996.

[17] Chen X, Hou F, Wu Y, et al. Bacterial and fungal community structures in Loess Plateau grasslands with different grazing intensities[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 606.

[18] Oberlintner A, Baji? M, Kal?íková G, et al. Biodegradability study of active chitosan biopolymer films enriched with Quercus polyphenol extract in different soil types[J]. Environmental Technology & Innovation, 2021, 21: 101318.

[19] Huang Y, Pan H, Wang Q, et al. Enrichment of the soil microbial community in the bioremediation of a petroleum-contaminated soil amended with rice straw or sawdust[J]. Chemosphere, 2019, 224: 265-271.

[20] Holt J G. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology[M]. Philadelphia, Lippincott Williams and Wilkins, 1993.

[21] Ma C, Hu B, Liu F U Y, et al. Changes in the microbial succession during sewage sludge composting and its correlation with physico-chemical properties[J]. Nature Environment and Pollution Technology, 2020, 19(1): 237-244.

[22] Storey S, Chualain D N, Doyle O, et al. Comparison of bacterial succession in green waste composts amended with inorganic fertiliser and wastewater treatment plant sludge[J]. Bioresource Technology, 2015, 179: 71-77.

[23] Steger K, Sj?gren ? M, Jarvis ?, et al. Development of compost maturity andpopulations during full-scale composting of organic household waste[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(2): 487-498.

[24] Jimenez L, Kulko E, Veloz E, et al. 16S rRNA identification of microorganisms and direct detection of functional genes in waste material generated by an in-vessel rotating compost system[J]. EC Microbiology, 2015, 1(3): 129-142.

[25] Tian W, Sun Q, Xu D, et al. Succession of bacterial communities during composting process as detected by 16S rRNA clone libraries analysis[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2013, 78: 58-66.

[26] Li J, Chen Y T, Xia Z Y, et al. Changes in bacterial communities during a pilot-scale composting process of dairy manure[J]. Journal of Environmental Engineering, 2020, 146(9): 04020095.

[27] Zhang W, Yu C, Wang X, et al. Retracted: Increased abundance of nitrogen fixing bacteria by higher C/N ratio reduces the total losses of N and C in cattle manure and corn stover mix composting[J]. Waste Management, 2020, 4: 416-425.

[28] Mujaki? I, Andrei A-?, Shabarova T, et al. Common presence of phototrophic gemmatimonadota in temperate freshwater lakes[J]. Msystems, 2021, 6(2): e01241-20.

[29] Yuan L J, Zhang Y Q, Yu L Y, et al.., a novel actinomycete isolated from rhizosphere soil of the plant[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60(1): 51-54.

[30] Cao Y R, Jiang Y, Wu J Y, et al. Actinopolymorpha alba sp. nov., isolated from a rhizosphere soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(9): 2200-2203.

[31] Wang Y X, Zhang Y Q, Xu L H, et al. Actinopolymorpha rutila sp. nov., isolated from a forest soil[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2008, 58(10): 2443-2446.

[32] Langarica-Fuentes A, Handley P S, Houlden A, et al. An investigation of the biodiversity of thermophilic and thermotolerant fungal species in composts using culture-based and molecular techniques[J]. Fungal Ecology, 2014, 11: 132-144.

[33] Godden B, Ball A S, Helvenstein P, et al. Towards elucidation of the lignin degradation pathway in actinomycetes[J]. Microbiology, 1992, 138(11): 2441-2448.

[34] Kleeberg I, Hetz C, Kroppenstedt R M, et al. Biodegradation of aliphatic-aromatic copolyesters by Thermomonospora fusca and other thermophilic compost isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(5): 1731-1735.

[35] Witt U, Einig T, Yamamoto M, et al. Biodegradation of aliphatic–aromatic copolyesters: Evaluation of the final biodegradability and ecotoxicological impact of degradation intermediates[J]. Chemosphere, 2001, 44(2): 289-299.

[36] Sang B I, Hori K, Tanji Y, et al. Fungal contribution to in situ biodegradation of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) film in soil[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 58(2): 241-247.

Microorganism responded biodegradation mechanism of PBAT-PLA biodegradable packaging under industrial aerobic composting

Ma Yichao1,2, Liu Jun1※, Zhang Ruohong1, Zhu Jiahuan1, Du Huanzheng2, Lu Sha2

(1.,201114,;2.,200086,)

Plastic pollution has posed a serious threat to the environment in the world. Biodegradable plastics can be widely expected to effectively mitigate plastic pollution. The subsequent industrial composting can also be treated to reduce the growing demand for landfills. In this research, the microorganisms responded to the biodegradation mechanism was proposed for the PBAT-PLA biodegradable packaging under the controlled industrial aerobic composting, according to the national standard (GB/T 19277.1-2011). Microcrystalline cellulose was used as reference material. The compost samples were taken on day 140 when the degradation was in the active period. The initial compost (before degradation), compost without any biodegradable material, compost with microcrystalline cellulose, and compost with PBAT-PLA packaging materials were then labeled as compost A, B, C, and D, respectively. The bacterial/fungal community was analyzed during degradation, including the species diversity, speciation, and species difference. A sample comparison was made through 16S/18S high-throughput sequencing of microorganisms in compost. The microscopic morphologies of PBAT-PLA packaging materials and microcrystalline cellulose were characterized by a Scanning Electron Microscope (SEM), in order to explore the intrinsic microbial response to the degradation mechanism. The results showed that the bacterial diversity of compost B under the industrial composting at 58 ± 2 ℃ was significantly lower than that of initial compost A since only some thermophilic bacteria survived. The bacterial diversities in compost C and D were significantly higher than that of compost B, due to the addition of cellulose or biodegradable packaging materials which provided carbon sources. There was no significant change in the fungal diversity, due to unsuitable for most fungi to survive at high temperatures. The fungal abundance changed, due to the temperature and carbon source in the compost, where the compost B (blank sample) showed the lowest fungal abundance. The dominant bacteria in the compost C and D wereandwhichbelonged to. The student’s T-test was used to compare the composition of bacteria and fungi in the compost C and D with those in the compost B. The significant growing bacteria in the compost C and D, includingand, belonged to. Therefore, there were similar degrading microorganisms of PBAT-PLA membrane bag and microcrystalline cellulose at (58±2) ℃. The SEM images showed that the surface of PBAT-PLA packaging after degradation was covered with a layer of biofilm. The biofilm was mainly composed of the clusters of ellipsoid bacteria, which were inferred to be.presented a positive effect on the depolymerization of polyester and the degradation of cellulose under industrial composting conditions. The complete biodegradation of polyester and cellulose depended on the microbial synergy, rather than a single strain. Therefore, the dominant bacteria and significant growth bacteria of biodegradable materials under industrial composting conditions can be expected to serve as a theoretical basis for screening key biodegradation bacteria in the future. It can also greatly contribute to breaking through the technical barriers of the long detection cycle with the current biodegradation for higher efficiency and speed. The identification of microbial communities can be an important indicator to evaluate the impact of the compost produced by biodegradable plastics on crops growth, and agricultural ecological environment. Consequently, a theoretical foundation can be made to optimize the industrial composting and biodegradable plastic testing standards. The finding can also provide a scientific basis for the large-scale promotion of biodegradable plastic films and the application of the compost produced from biodegradable plastics in advanced (or modern) agriculture

microorganism, plastic, degradation, biodegradable packaging, industrial aerobic composting, high throughput sequencing

2021-09-15

2021-11-30

國(guó)家自然科學(xué)基金（71974144）；國(guó)家社科基金重大項(xiàng)目（21ZDA087）；上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院科研項(xiàng)目（KY-2021-2-QH）

馬昳超，博士，研究方向?yàn)榭山到馑芰稀⑸锵到y(tǒng)工程、生物質(zhì)利用。Email：mayc@sqi.org.cn

劉峻，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称废嚓P(guān)產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。Email：liujun@sqi.org.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.24.025

X7

A

1002-6819(2021)-24-0224-08

馬昳超，劉峻，章若紅，等. 微生物響應(yīng)PBAT-PLA生物降解膜袋工業(yè)需氧堆肥降解機(jī)制[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(24)：224-231. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.24.025 http://www.tcsae.org

Ma Yichao, Liu Jun, Zhang Ruohong, et al. Microorganism responded biodegradation mechanism of PBAT-PLA biodegradable packaging under industrial aerobic composting[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(24): 224-231. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.24.025 http://www.tcsae.org