高 嵩，孫文松，溫 健，李曉麗，楊正書(shū)，李 玲

（1.遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所，遼寧 遼陽(yáng)111000；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，遼寧 遼陽(yáng)111000）

龍膽（Gentiana scabra Bge．）為龍膽科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥材，其應(yīng)用歷史悠久。龍膽以根際根莖入藥[1]。 味苦，性寒。 歸肝、膽經(jīng)。 有清熱燥濕，瀉肝膽實(shí)火的作用。 主治濕熱黃疸、陰腫陰癢、帶下、濕疹瘙癢、肝火目赤，耳鳴耳聾，肋痛口苦，強(qiáng)中，驚風(fēng)抽搐等癥。遼寧省撫順市清原縣龍膽栽培基地種植龍膽草面積達(dá)2466hm2，年產(chǎn)量1600t，占全國(guó)市場(chǎng)份額的82%[2]。然而，基地近年來(lái)由于連作障礙，導(dǎo)致藥用植物長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰焚|(zhì)變差，生長(zhǎng)期易患斑枯病、根腐病，嚴(yán)重連作障礙甚至?xí)斐山^收[3]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，被認(rèn)為是土壤質(zhì)量不可缺少的組成部分，作物連作打破了根際土壤微生物生態(tài)平衡，進(jìn)而導(dǎo)致有益微生物減少和病原微生物的積累。 藥用植物生產(chǎn)中普遍存在連作障礙[4]，這不僅降低了藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還影響臨床用藥安全[5]。 藥用植物的連作障礙是很多因子綜合作用的結(jié)果，近年研究提出中藥材連作障礙的原因主要有土壤養(yǎng)分失調(diào)和理化性質(zhì)劣變、土壤傳染性病蟲(chóng)害加重、根系分泌物和殘茬分解物等[6]，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于闡明藥用植物連作障礙的發(fā)生機(jī)制具有重要作用，深入研究連作障礙的發(fā)生機(jī)制及其調(diào)控技術(shù)是龍膽草等藥用植物生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。

新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展解決研究土壤微生物分離培養(yǎng)效率低的瓶頸，根際微生物和連作障礙之間的關(guān)系再次成為研究的熱點(diǎn)。 近年來(lái)，土壤細(xì)菌相關(guān)研究開(kāi)始由結(jié)構(gòu)向功能轉(zhuǎn)變。 各國(guó)學(xué)者共同致力于土壤細(xì)菌功能預(yù)測(cè)與分析，并試圖通過(guò)土壤細(xì)菌功能研究，揭示土壤細(xì)菌在陸地生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程中發(fā)揮的重要作用[7]。16S rRNA 高通量測(cè)序可以通過(guò)PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件預(yù)測(cè)基因序列對(duì)應(yīng)的細(xì)菌菌群代謝功能譜[8]。 PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析相較于宏基因組研究更加方便且成本也更低，同時(shí)預(yù)測(cè)效果具有較高的可靠性。目前該方法已在土壤環(huán)境中得到良好的應(yīng)用[9-10]，而關(guān)于連作對(duì)藥用植物土壤微生物的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究采用Illumina Miseq 高通量測(cè)序技術(shù)，以清原縣椽子溝村不同年限連作龍膽草根際土壤為研究對(duì)象，分析了不同年限龍膽草根際土壤樣品的細(xì)菌種群豐度和多樣性的變化，并對(duì)細(xì)菌功能進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，試圖探索龍膽草連作障礙與土壤根際細(xì)菌之間的關(guān)系，以期了解龍膽草連作對(duì)根際土壤細(xì)菌菌群多樣性的影響，探究藥用植物連作障礙機(jī)制，旨在從龍膽草根際土壤微生物方面入手為藥用植物的生產(chǎn)實(shí)踐和可持續(xù)種植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究地點(diǎn)位于遼寧省撫順市清原縣椽子溝村（N125．06737，E42．08934），龍膽草屬同一馴化栽培品系，試驗(yàn)采集種植龍膽草1 年（R1）、連續(xù)種植龍膽草2 年（R2）和連續(xù)種植龍膽草3 年（R3）的土壤，以距離采龍膽草樣品約50m 未種過(guò)龍膽草的土壤作為對(duì)照（CK）。根際土壤取樣采用“抖根法”：先將植物根系從土壤中挖出，抖掉與根系結(jié)合松散的土壤，再用毛刷輕輕刷下根系表面土壤，按“S”形采樣方法，隨機(jī)選取5 個(gè)點(diǎn)混合樣品。 冰盒保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即過(guò)20 目篩，保存于-80℃用于土壤細(xì)菌多樣性檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增 采用CTAB 或SDS 方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1ng·μL-1。 以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode 的特異引物，New England Biolabs 公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。16SV4 區(qū)引物（515F 和806R）用于鑒定細(xì)菌多樣性；PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。 產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific 公司GeneJET 膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.2 高通量測(cè)序 使用Thermo fisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher 的Ion S5TMXL 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

1.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理和OUT聚類(lèi)分析使用Cutadapt （V1．9．1, http://cutadapt．readthedocs．io/en/stable/）[11]對(duì)reads 進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，再根據(jù)Barcode 從得到的reads 中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列初步質(zhì)控得到原始數(shù)據(jù)（Raw reads）經(jīng)過(guò)以上處理后得到的Reads 需要進(jìn)行去除嵌合體序列的處理，Reads 序列通過(guò)（https://github．com/torognes/vsearch/）與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean reads）。

1.3.2 菌群組成分析和差異分析 使用Qiime 軟件（Version 1．9．1）計(jì)算Observed-otus，Chao1，Shannon，Simpson，Ace，Goods-coverage 等指數(shù)，使用R 軟件（Version 2．15．3）繪制稀釋曲線，Rank abundance 曲線，物種累積曲線并使用R 軟件進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)組間差異分析。 對(duì)OTUs 進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)樣本聚類(lèi)熱圖展示，探究不同樣本和組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。 序列文件上傳到Galaxy 網(wǎng)站進(jìn)行PICRUSt 功能基因預(yù)測(cè)分析，得到土壤細(xì)菌功能基因組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤樣本測(cè)序結(jié)果及質(zhì)量控制

表1 為10 個(gè)不同處理土壤樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表，高通量測(cè)序共獲得801346 條有效序列，運(yùn)用QIIME 軟件剔除序列長(zhǎng)度＜150 bp 的序列和5′端引物錯(cuò)配堿基數(shù)＞1 的序列以及含有連續(xù)相同堿基數(shù)＞8 的序列，經(jīng)過(guò)剔除嵌合體序列處理。 按照優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)，去除不合格序列后共得到有效序列（Clean reads）801346 條，每個(gè)樣本有效序列占原始序列的平均有效率為95．55%， 最低為91．98%。對(duì)所有樣品的全部Clean reads 進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs， 同時(shí)篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs 的代表序列． 對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肣iime 軟件（Version 1．9．1）中的blast 方法（http://qiime．org/scripts/assign_taxonomy．html）與Unit(v7．2)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://unite．ut．ee/）進(jìn)行物種注釋分析。

由圖1 可知，當(dāng)測(cè)序量超過(guò)10000 讀長(zhǎng)時(shí)，雖仍有新的OUTs 出現(xiàn)，但由于曲線已趨于平緩，表明該樣品取樣基本合理，在真實(shí)的環(huán)境中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的置信度較高，能夠比較真實(shí)地反映土壤細(xì)菌群落多樣性，即當(dāng)前測(cè)序深度足以反映該群落樣本所包含的細(xì)菌群落多樣性。

表1 不同處理樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of sample sequences data

圖1 龍膽草根際土壤細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果的稀釋曲線Figure 1 The dilution curves of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.2 不同處理土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性的統(tǒng)計(jì)分析

由表2 可知，各樣品文庫(kù)的覆蓋率均大于99．3%，說(shuō)明各樣地的微生物物種信息得到了充分的體現(xiàn)，本次測(cè)序結(jié)果能夠代表清原縣龍膽草土壤細(xì)菌群落的真實(shí)情況。 與種植1 年龍膽草根際土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)Chao1、多樣性指數(shù)Shannon、樣品覆蓋率Coverage 相比， 種植2 年、3 年根際土壤群落豐度和多樣性呈逐年下降趨勢(shì)，種植3 年根際土壤細(xì)菌豐度和多樣性大幅度降低，這與大部分研究結(jié)果一致。 說(shuō)明細(xì)菌物種豐富度減少可能是導(dǎo)致龍膽草連作障礙的原因之一。

2.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)物種注釋結(jié)果，10 個(gè)龍膽草土壤樣品的5140 個(gè)OTUs 分屬于36 門(mén)51 綱112 目218 科470 屬。 由圖2 可知，不同年限龍膽草根際土壤的最主要類(lèi)群，各土壤樣品間的細(xì)菌群落組成相似，除了未確定種屬的其他菌類(lèi)，相對(duì)豐度較高的前10 個(gè)菌門(mén)分別為放線菌門(mén)（Actinobacteria）、變 形 菌 門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi ）、厚 壁 菌 門(mén)（Firmicutes）、擬 桿 菌 門(mén)（Bacteroidetes）、浮 霉 菌 門(mén)（Planctomycetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和奇古菌（Thaumarchaeota）。 由圖1 可知，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和酸桿菌門(mén)是龍膽草土壤的優(yōu)勢(shì)菌群，3 個(gè)門(mén)約占總?cè)郝涞?5%。且各樣地土壤樣品的相對(duì)豐度之間存在差異。 與對(duì)照土壤相比，細(xì)菌的差異種類(lèi)減少，說(shuō)明連作影響土壤細(xì)菌群落的多樣性。

表2 龍膽草根際土壤細(xì)菌群落豐富度及多樣性指數(shù)Table 2 The species richness and diversity index of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

由 圖3 可 知，γ-變 形 菌 綱 （Gammaproteobacteria）、α-變 形 菌 綱 （Alphaproteobacteria）、 放 線 菌 綱（unidentified_Actinobacteria）、Thermoleophilia、Acidobacteriia、unidentified_Gemmatimonadetes、Δ - 變 形 菌 綱（Deltaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和unidentified_Acidobacteria 等組成土壤細(xì)菌群落。 第一優(yōu)勢(shì)菌綱顯著差異，除其他外，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌綱為T(mén)hermoleophilia（18．56%）＞α-變形菌綱Alphaproteobacteria（15．91%）＞unidentified_Actinobacteria（11．93%）。 而1 年生龍膽草土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌綱為α-變形菌綱（24．45%）＞γ-變形菌綱 （15．17%）＞Acidobacteriia （9．75,%）；2年生龍膽草土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌綱為α-變形菌綱 （17．78%）＞Thermoleophilia （16．23%）＞unidentified_Actinobacteria （16．02%）；3年生龍膽草土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌綱為unidentified_Actinobacteria（21．79%）＞α-變形菌綱（16．04%）＞γ-變形菌綱（14．41%）。 隨種植年限增加，優(yōu)勢(shì)菌群unidentified_Actinobacteria、Acidobacteriia 和unidentified_Gemmatimonadetes 芽孢桿菌綱含量顯著增加，α-變形菌綱、Δ-變形菌綱和unidentified_Acidobacteria 綱含量著減少。

圖2 龍膽草根際土壤細(xì)菌門(mén)水平群落組成Figure 2 The phylum distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

圖3 龍膽草根際土壤細(xì)菌綱水平群落組成Figure 3 The class distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.4 不同年限土壤菌群的分類(lèi)學(xué)組成分析

表3 為龍膽草根際土壤細(xì)菌樣品前10 名屬及相對(duì)豐度。 進(jìn)一步從屬水平研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)階段乃至不同樣地之間的細(xì)菌群落豐度差異明顯。 由表3 可知， 在屬水平上， 對(duì)照組土壤菌群主要有Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和unidentified_Acidobacteria 等優(yōu)勢(shì)類(lèi)群（＞2%）；而1 年生龍膽草土壤菌群主要有Sphingomonas、Burkholderiaceae_unidentified、Bradyrhizobium 和Bryobacter 等優(yōu)勢(shì)類(lèi)群（＞2%）；2 年生龍膽草土壤菌群主要有unidentified_Burkholderiaceae、unidentified_Gaiellales、Acidothermus 和Sphingomonas等優(yōu)勢(shì)類(lèi)群（＞2%）；3 年生龍膽草土壤菌群主要有Rhodanobacter、Acidothermus、Chujaibacter、 Sphingomonas、unidentified_Gaiellales 和unidentified_Burkholderiaceae。 通過(guò)比較可知，種植龍膽草的優(yōu)勢(shì)菌屬共有7 屬：Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Gaiellales_unidentified、 Burkholderiaceae_unidentified、 Pseudolabrys 和Bradyrhizobium，而與對(duì)照相比共有優(yōu)勢(shì)菌屬只有Bradyrhizobium 一個(gè)屬。 總的來(lái)說(shuō)，一些優(yōu)勢(shì)菌屬豐度變化不大。 隨種植年限增加，Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Burkholderiaceae_unidentified、Pseudolabrys 等屬豐度呈上升趨勢(shì)；而隨種植年限增加，Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和Gaiella 等屬豐度呈下降趨勢(shì)。

表3 龍膽草根際土壤細(xì)菌群落在屬水平上的分布Table 3 The dominant genus distribution of rhizospheric bacterial in Gentiana scabra soil

2.5 菌群代謝功能預(yù)測(cè)

運(yùn)用PICRUSt 軟件通過(guò)將現(xiàn)有的群落組成數(shù)據(jù)與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物代謝功能的類(lèi)別對(duì)比進(jìn)行群落樣本功能預(yù)測(cè)。 由圖4 和圖5 可知，龍膽草不同年限土壤中獲得的一級(jí)功能層預(yù)測(cè)生物代謝功能通路分析相對(duì)豐度大于1%的功能基因包括6 種：遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、人類(lèi)疾病、環(huán)境信息處理、代謝和有機(jī)系統(tǒng)，每種功能基因在不同生境中相對(duì)豐度基本一致。同時(shí)對(duì)預(yù)測(cè)基因二級(jí)功能層進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其由遺傳信息處理、翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、折疊、分類(lèi)和降解、核苷酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等35 個(gè)子功能組成。隨種植年限增加，行使代謝功能類(lèi)別中編碼能量代謝、維生素和輔助因子的代謝大量減少；疾病、外源生物降解與代謝、萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物的代謝、膜運(yùn)輸顯著降低；轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸和分解代謝、環(huán)境適應(yīng)、信號(hào)分子相互作用、酵素家族、復(fù)制和修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)處理、不良特征功能基因增加，其中，轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸和分解代謝顯著增加。 聚糖生物合成與代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、脂代謝、氨基酸代謝、免疫系統(tǒng)疾病、碳水化合物代謝的功能基因有少量增加。

圖4 細(xì)菌群落樣本的代謝一級(jí)功能預(yù)測(cè)圖Figure 4 The prediction map of the metabolic function at hierarchy level 1 in community samples

3 討論與結(jié)論

土壤微生物是地下生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物因子，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)、物質(zhì)循環(huán)及穩(wěn)定性有重要作用[12]。受根系分泌物的影響，根際土壤微生物種類(lèi)和數(shù)量具有強(qiáng)烈的根際效應(yīng)[13]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，根際土壤微生物的數(shù)量、種類(lèi)、代謝活性及微生物間的相互作用決定著植物的健康狀況[14]。大量研究結(jié)果表明，連作土壤的有益微生物量隨土壤連作年限的增加而逐漸減少，而有害微生物量卻逐漸增加[15-16]，為土壤傳染性病害的傳播和病原菌的寄生繁殖創(chuàng)造了條件，對(duì)塊根類(lèi)藥材的根莖部位生長(zhǎng)產(chǎn)生危害[17-19]。 研究發(fā)現(xiàn)人參根際土壤和非根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異[20]，連作西洋參根際細(xì)菌和真菌多樣性發(fā)生變化[21]。 本研究根際多樣性分析表明，隨著種植年限增加，根際土壤細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)呈逐年下降趨勢(shì)，種植3 年細(xì)菌豐度和多樣性大幅度降低。

土壤中微生物以細(xì)菌數(shù)量最多，占土壤微生物總量的70%以上，細(xì)菌群落中含有大量具有特殊功能的生理類(lèi)群，如固氮菌、氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌等[22]。 細(xì)菌種類(lèi)的變化， 會(huì)對(duì)這些特定生理類(lèi)群的數(shù)量產(chǎn)生直接影響，從而影響土壤肥力。 本研究表明，連作影響根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。 隨種植年限增加， 優(yōu)勢(shì)菌群unidentified_Actinobacteria、Acidobacteriia 和unidentified_Gemmatimonadetes 芽孢桿菌綱Bacilli 綱含量顯著增加，α-變形菌綱、Δ-變形菌綱和unidentified_Acidobacteria 綱含 量 顯 著 減 少；Rhodanobacter、Acidothermus、Sphingomonas、Burkholderiaceae _unidentified、Pseudolabrys 等屬豐度呈上升趨勢(shì)；而隨種植年限增加，Solirubrobacter、Bradyrhizobium、Candidatus_Udaeobacter 和Gaiella 等屬豐度呈下降趨勢(shì)。土壤根際微生物群落結(jié)構(gòu)的差異會(huì)表現(xiàn)在基因表達(dá)方面的差異，本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境信息處理和代謝功能基因大量減少，而病害基因增加。 這與藜麥重茬根際土壤中編輯復(fù)制和修復(fù)以及外源性物質(zhì)降解和代謝的功能基因大量減少的結(jié)果一致[23]。 最終導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)外來(lái)入侵的抵抗能力減小，植物生長(zhǎng)受阻，土傳病害增加，產(chǎn)量急劇下降。

同時(shí)，本課題組其他研究發(fā)現(xiàn)，龍膽草連作不僅僅會(huì)導(dǎo)致有益細(xì)菌群落豐度降低，有益真菌的數(shù)量也會(huì)大幅度降低，而病原菌真菌的數(shù)量則會(huì)大幅度增加。 可能是由于連作打破了龍膽草根際土壤微生物之間的平衡，從而導(dǎo)致土壤細(xì)菌功能性紊亂，從而負(fù)反饋于植株本身，導(dǎo)致了龍膽草的連作障礙，但具體的作用機(jī)制和相互之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

連作障礙影響藥用植物微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的研究多集中在土壤微生物量的變化方面，對(duì)微生物功能的研究較少。 PICRUSt 分析通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，將微生物的變化情況和生物功能聯(lián)系起來(lái)。 在呼倫貝爾沙區(qū)4 種典型生境的一級(jí)功能層中，細(xì)菌群落的功能特征影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性，沙地樟子松天然林中較高豐度的的代謝、遺傳信息處理、有機(jī)系統(tǒng)3 類(lèi)功能基因使土壤細(xì)菌代謝旺盛,生長(zhǎng)力好，從而提高了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。 有研究發(fā)現(xiàn)施用多效唑后，土壤細(xì)菌的功能有一定的改變，在功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)整體趨勢(shì)低于對(duì)照組[24]。 連作障礙土壤微生物的相對(duì)豐度發(fā)生改變，其功能也發(fā)生相應(yīng)的變化，本研究對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析，該結(jié)果初步揭示了不同年限龍膽草根際土壤細(xì)菌功能的差異，隨種植年限增加，以轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸和分解代謝為代表的行使代謝功能類(lèi)別中大量功能基因呈增加趨勢(shì)；而外源生物降解與代謝、萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物的代謝、膜運(yùn)輸?shù)裙δ茱@著降低。 但鑒于PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析的局限性，后續(xù)需要結(jié)合宏基因組測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步分析。

本項(xiàng)研究在龍膽草的相關(guān)研究中尚屬首次，能夠全面地揭示許多利用傳統(tǒng)生化技術(shù)研究土壤微生物無(wú)法解決的問(wèn)題，結(jié)果中獲得的土壤微生物多樣性變化能夠揭示龍膽草連作后土壤細(xì)菌種群多樣性的變化，并且預(yù)測(cè)了根際土壤細(xì)菌種群代謝功能的變化，為今后研究其他藥用植物連作障礙機(jī)制提供參考。 但本研究所采用的高通量測(cè)序技術(shù)的第2 代測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)菌的分類(lèi)僅限于屬的水平，無(wú)法定位到某一種細(xì)菌，且同一屬的不同細(xì)菌種在土壤中可能會(huì)行使不同的功能，而不同屬的細(xì)菌也可能在土壤中行使同樣的功能，研究所得到的結(jié)果可能會(huì)有偏差。 而隨著第3 代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步完善和發(fā)展，對(duì)根際微生物的研究將會(huì)更加全面和細(xì)化，今后仍有待開(kāi)展更深層次的研究。

圖5 細(xì)菌群落樣本的代謝二級(jí)功能預(yù)測(cè)圖Figure 5 The prediction map of the metabolic function at hierarchy level 2 in community samples