嚴靈劍

摘要 從原生質(zhì)體獲取、純化、培養(yǎng)、分裂和活性鑒定五個方面，深入解讀了近幾年浙江選考題中涉及原生質(zhì)體的疑難問題。

關鍵詞 原生質(zhì)體 教學疑難 生物選考

中圖分類號 G633.91

文獻標志碼 B

原生質(zhì)體研究的熱潮開始于20世紀80年代早期，并在隨后的幾年中逐步深入。目前，包括園藝植物在內(nèi)的近400種植物已成功實現(xiàn)原生質(zhì)體的分離。而且高等植物的原生質(zhì)體已廣泛的用于細胞融合、攝入外源DNA、細胞器、細菌或病毒顆粒等研究。在浙江省的選考試題中會經(jīng)常出現(xiàn)原生質(zhì)體的影子。

1原生質(zhì)體是否一定要用纖維素酶和果膠酶來獲取

分離原生質(zhì)體常用的酶有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶。一般來說，分離葉肉細胞和懸浮細胞的原生質(zhì)體時只需纖維素酶和果膠酶即可。纖維素酶消化細胞壁的纖維素，果膠酶主要降解中膠層。分離愈傷組織原生質(zhì)體時，加上半纖維酶來降解細胞壁中的半纖維素，分離效果會更好，酶的用量和酶解時間需適當增加。由此可見，原生質(zhì)體的取材來源直接決定了所需酶的種類。

[例1]（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（1）原生質(zhì)體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的的混合液處理，經(jīng)過離心純化后獲得原生質(zhì)體。

分析：這題是從葉片進行處理來獲得原生質(zhì)體，類似于從葉肉細胞中分離原生質(zhì)體，所以要加纖維素酶和果膠酶。

參考答案：纖維素酶和果膠酶。

2原生質(zhì)體為什么要純化及如何純化

細胞酶解后的混合物中，除完整未損傷的原生質(zhì)體外，還含有許多雜質(zhì)，如細胞碎片、葉綠體、維管束成分、未被消化的細胞組織和破裂的原生質(zhì)體。因而必須把這些雜質(zhì)除掉。清除較大碎屑的方法是使酶解后的混合物穿過一個50～70μm的鎳絲網(wǎng)進行過濾。然后，再利用密度，通過多次離心，取某一界面物或是除去上清液，進一步純化。最后，獲得純凈的原生質(zhì)體。由此可見，酶解后的混合物經(jīng)過過濾、離心等純化步驟后，才能獲得想要的原生質(zhì)體。

[例2]（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（1）原生質(zhì)體的分離：在無菌條件下，取煙草無菌苗的葉片，放入含有0.5mol/L甘露醇（維持較高滲透壓）的纖維素酶和果膠酶的混合液處理，經(jīng)過后獲得原生質(zhì)體。

分析：在獲取原生質(zhì)體的過程中會混有雜質(zhì)，可以通過過濾初步純化，再通過離心進一步純化。

參考答案：離心純化。

3原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中何時降低滲透壓在原生質(zhì)體還沒有再生出一個堅韌的細胞壁之前，必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護。培養(yǎng)基中的滲透壓一般是用0.5～0.6mol/L甘露醇或山梨醇調(diào)節(jié)的。培養(yǎng)開始后7～10d，大部分有活力的原生質(zhì)體已經(jīng)再生出細胞壁并進行了幾次分裂，此后通過定期加入幾滴不含滲壓劑或滲壓劑水平很低的新鮮培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)基的滲透壓逐漸下降（若還把滲壓劑保持在原來的高水平上，若干時間以后細胞就會停止分裂）。最后，將肉眼可見的細胞團轉(zhuǎn)入到不含滲壓劑的新鮮培養(yǎng)基中。由此可見，原生質(zhì)體培養(yǎng)基中的滲透壓應該在細胞分裂幾次后，用滲透壓相對較低的滲壓劑來降低培養(yǎng)基中的滲透壓，直至用不含滲壓劑的新鮮培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞團。

[例3]（2016年浙江選考T32）（節(jié)選）（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：將原生質(zhì)體進行培養(yǎng)，重新長出細胞壁，形成胚性細胞。此時，應該培養(yǎng)基中甘露醇濃度，以利于胚性細胞繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞團，然后經(jīng)兩條途徑形成再生植株。

分析：如果保持獲得原生質(zhì)體時的滲透壓將會阻止細胞的分裂，從而無法獲得細胞團。

參考答案：降低。

4原生質(zhì)體何時進行細胞分裂

在原生質(zhì)體混合物中，一旦把酶洗掉，原生質(zhì)體立即開始合成新壁。一般來說，來源于已分化的初始材料，其原生質(zhì)體相比于未分化材料的原生質(zhì)體合成細胞壁的能力要弱。細胞壁的形成與細胞分裂有直接關系，凡是不能再生細胞壁的原生質(zhì)體也就不能進行正常的有絲分裂。凡能繼續(xù)分裂的細胞經(jīng)2～3周培養(yǎng)后可長出細胞團。由此可見，原生質(zhì)體只有在再生細胞壁后，才能進行細胞分裂。[例4]（2020年1月浙江選考T29）原生質(zhì)體在培養(yǎng)過程中，只有重新形成后，才可進行有絲分裂。

分析：細胞壁的形成直接影響了原生質(zhì)體的分裂。不能再生細胞壁的原生質(zhì)體將難以進行分裂。

參考答案：細胞壁。

5原生質(zhì)體的活性如何鑒定

原生質(zhì)體活動檢測方法有形態(tài)觀察法、二乙酸熒光素法、酚藏花紅染色法、伊文斯藍染色體法。1形態(tài)觀察法，主要觀察原生質(zhì)體形態(tài)及胞內(nèi)環(huán)流。有活力的原生質(zhì)體形態(tài)規(guī)則完整，顏色鮮艷，胞內(nèi)環(huán)流明顯;無活力原生質(zhì)體胞內(nèi)渾濁，無色澤且透光，胞內(nèi)環(huán)流不顯著。2酚藏花紅染色法，其原理是活性原生質(zhì)體染色后在熒光顯微鏡下可觀察到紅色;而無活性原生質(zhì)體無色。3伊文斯藍染色法。其原理就是死細胞或受損細胞可吸收伊文斯藍，而完整活細胞不吸收或積累該物質(zhì)。4二乙酸熒光素法。該方法的原理是FDA自由穿越細胞膜，并積累在活細胞中，被活細胞酯酶酶解產(chǎn)生熒光素。在熒光顯微鏡下可以觀察熒光產(chǎn)生。而熒光素無法在死細胞中積累。因此，無活力的原生質(zhì)體無熒光產(chǎn)生。由此可見，原生質(zhì)體的活性可以通過形態(tài)觀察，著色等方法進行鑒定。

[例5]（2020年1月浙江選考T29）（1）為了獲取某植物葉片無菌的原生質(zhì)體，先將葉片經(jīng)表面消毒并去除下表皮，再將其置于經(jīng)滅菌處理的較高滲透壓的混合酶液中。酶解后，經(jīng)多次離心獲得原生質(zhì)體。然后測定該原生質(zhì)體的活性，可采用的方法有（答出2點即可）。

分析：該題中提到的染色法，可以是酚藏花紅染色法，也可以是伊文斯藍染色法，也可以參考浙科版教材中“驗證活細胞吸收物質(zhì)的選擇性”活動中的紅墨水染色。還可以用形態(tài)觀察法，觀察胞質(zhì)環(huán)流的情況。該題中提到的滲透吸水失水，是參考浙科版教材中“觀察洋蔥表皮細胞的質(zhì)壁分離及質(zhì)壁分離復原”活動，能發(fā)生滲透吸水失水的是活細胞。

參考答案：染色法、滲透吸水失水。

參考文獻：

[1]陳勁楓.植物組織培養(yǎng)與生物技術[M].北京：科學出版社，2018.

[2]李浚明朱登云.植物組織培養(yǎng)教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2005.

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