張志蘭，王 寧，唐丹丹，舒 婕，李曉虹

（蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部,分析測(cè)試中心,蘇州215123）

近年來，固體核磁共振（Solid state nuclear magnetic resonance，SSNMR）技術(shù)在結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)研究中發(fā)揮著特有的優(yōu)勢(shì).在對(duì)各種不溶物質(zhì)或材料體系結(jié)構(gòu)的研究過程中，定量信息的檢測(cè)成為了SSNMR測(cè)試的主要需求之一［1，2］.通過恰當(dāng)?shù)厥褂肧SNMR定量技術(shù)，可以獲取有關(guān)分子基團(tuán)比例［3］、混合物組分含量［4］及多相體系相結(jié)構(gòu)［5］等信息，適用的體系主要包括有機(jī)小分子、高分子、功能材料及其混合物等.SSNMR常用的定量技術(shù)為單脈沖高功率去耦（Direct polarization with dipolar decoupling，DP）技術(shù)［6］，該方法主要用于自然豐度較低的S核的檢測(cè).然而對(duì)于多數(shù)樣品體系，定量DP譜一般需要花費(fèi)十幾個(gè)小時(shí)甚至數(shù)周的時(shí)間，因此DP方法的可行性較低.與DP實(shí)驗(yàn)相比，交叉極化技術(shù)（Cross polarization，CP）通?？梢栽谳^短的時(shí)間里獲取信噪比更高的譜圖［7，8］.然而，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中不同S｛I｝體系的交叉極化效率各不相同（I為富核），即具有不同的CP動(dòng)力學(xué)行為［9］.因此，CP雖然可以節(jié)省時(shí)間，卻不具有定量性.

基于以上問題，研究者先后提出了多種定量方法［10，11］來實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)S核的定量表征，如RAMPCP［12］，SD-CP-MAS［13，14］，QUCP［15～17］和QUSP［18］方法.但這些方法僅對(duì)特定的樣品體系適用，所測(cè)定的定量信息種類同樣受到限制.2008年，Zhang等［19～22］提出了QCP/QCPRC方法，可適用于多種純凈物及混合物的基團(tuán)比例、共混組分的檢測(cè).但該方法涉及多步數(shù)據(jù)處理過程，操作相對(duì)復(fù)雜.與上述幾種定量方法相比，Multiple-CP表現(xiàn)出較高的可行性，受到了普遍的關(guān)注.該方法通過多次交叉極化過程使樣品體系中不同S核的交叉極化效率逐步提升并趨于相同，從而直接實(shí)現(xiàn)譜圖的定量性.多次交叉極化的概念由Gerstein和Dybowski［23］于1985年首次提出.1990年，Wu等［24］提出了基于多次交叉極化的定量檢測(cè)技術(shù)；2014年Schmidt-Rhor等［25］將該方法命名為Multiple-CP，并系統(tǒng)地探討了1H射頻場(chǎng)強(qiáng)度等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)定量結(jié)果的影響.2017年，他們對(duì)Multiple-CP技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，通過使用180°補(bǔ)償脈沖技術(shù)降低90°脈沖共振偏置和激發(fā)脈寬不準(zhǔn)確所導(dǎo)致的信號(hào)損失.在共振偏置為±10 kHz、90°脈寬誤差為20%的實(shí)驗(yàn)條件下，信號(hào)損失僅＜3%［26］.此外，Hirschinger等［27，28］根據(jù)β-甲酸鈣、二茂鐵和丙氨酸的Multiple-CP實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并結(jié)合理論計(jì)算，討論在不同魔角轉(zhuǎn)速下，Multiple-CP譜圖的信噪比及測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性.隨著對(duì)Multiple-CP技術(shù)的不斷探索，已實(shí)現(xiàn)對(duì)不同體系、不同定量信息的檢測(cè).2015年，de Azevedo等［29］應(yīng)用Multiple-CP方法檢測(cè)出甘蔗蔗渣中纖維素的結(jié)晶度；2016年，Martineau等［30］將該方法應(yīng)用于定量檢測(cè)纈氨酸/蛋氨酸混合物的組分含量；2018年，Zhang等［31］將Multiple-CP方法應(yīng)用于土壤有機(jī)質(zhì)中含碳官能團(tuán)比例的研究，從而探討土壤中有機(jī)碳的穩(wěn)定成分隨耕種時(shí)間長(zhǎng)短及土壤類型的變化規(guī)律；2019年，Birdwell和Mao等［32］使用Multiple-CP技術(shù)分析了多種油頁巖干酪根樣品中含碳官能團(tuán)的比例，研究雜原子濃度對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響.可見，Multiple-CP技術(shù)在分子結(jié)構(gòu)、基團(tuán)比例、共混組分及相成分分析等方面都有潛在的應(yīng)用價(jià)值.然而，通過對(duì)上述研究工作的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，Multiple-CP對(duì)于不同的樣品體系，其實(shí)驗(yàn)參數(shù)差異較大，即對(duì)于不同種類的體系或基團(tuán)，Multiple-CP所需的實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件不同.因此，如何依據(jù)樣品的種類和特性來準(zhǔn)確設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)是實(shí)現(xiàn)Multiple-CP譜圖定量性的前提.此外，對(duì)于共混體系組分含量的檢測(cè)，Multiple-CP的適用性同樣需要深入探討.這需要系統(tǒng)地掌握Multiple-CP各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)與樣品屬性之間的關(guān)系，從而確定Multiple-CP技術(shù)可適用的體系范圍以及最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍.

基于此，本文選擇L-丙氨酸、L-纈氨酸以及二者的混合物作為模型樣品，通過對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件下Multiple-CP測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，系統(tǒng)地探討了Multiple-CP實(shí)驗(yàn)脈沖序列中弛豫恢復(fù)時(shí)間（td）、交叉極化接觸時(shí)間（tp）和交叉極化次數(shù)（n）3種實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)樣品參數(shù)TCH（交叉弛豫時(shí)間）和(自旋鎖定場(chǎng)下氫的自旋晶格弛豫時(shí)間)的依賴性.依據(jù)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，總結(jié)了Multiple-CP定量技術(shù)所適用的純凈物或共混物體系的TCH和特征，并提出Multiple-CP實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置要點(diǎn).同時(shí)提出了Multiple-CP技術(shù)適用樣品或體系的判斷依據(jù)，為使用Multiple-CP進(jìn)行定量檢測(cè)提供了可參考的參數(shù)設(shè)置方案.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

L-丙氨酸（L-alanine）和L-纈氨酸（L-valine粉末樣品）均為分析純，購于北京伊諾凱科技有限公司；L-丙氨酸和L-纈氨酸混合樣品的制備：首先，分別稱取17.2 mgL-丙氨酸固體粉末和23.4 mgL-纈氨酸固體粉末，然后將兩種樣品置于研缽中反復(fù)研磨，并使其混合均勻.將混合物樣品填充在外徑為3.2 mm的ZrO2轉(zhuǎn)子中，均勻壓實(shí)，進(jìn)行SSNMR實(shí)驗(yàn).

Bruker Advance III HD 400 WB固體核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司），實(shí)驗(yàn)使用3.2 mm H/F/X MAS DVT三共振探頭；1H和13C的共振頻率分別為400.25和100.65 MHz.

1.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

實(shí)驗(yàn)選擇的魔角旋轉(zhuǎn)速率為10 kHz，1H和13C的90°脈沖寬度為3.2μs，所對(duì)應(yīng)的射頻場(chǎng)強(qiáng)度均為78 kHz.所有交叉極化過程中1H的最大自旋鎖定場(chǎng)強(qiáng)度為78 kHz，脈沖形狀為功率由100%衰減至50%的ramp脈沖［33］，采樣期間使用異核偶極耦合去耦序列（TPPM）對(duì)1H去耦［34］.所有的13C譜圖中，13C譜峰的化學(xué)位移均以四甲基硅烷（TMS）為參比，使用金剛烷進(jìn)行三次定標(biāo)，其中CH譜峰13C的化學(xué)位移δ為38.484［35，36］.

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析中，TCH和相對(duì)差異度ΦS=[(A1-A2)/A1]×100%，其中，A1，A2分別代表不同的TCH和值，且A1＞A2.

L-丙氨酸和L-纈氨酸純凈物分子基團(tuán)比例的百分誤差計(jì)算方法：首先對(duì)分子內(nèi)各基團(tuán)譜峰積分值進(jìn)行歸一化，I′i=Ii/Iave，其中為含13C基團(tuán)的種數(shù)，Ii為分子內(nèi)某一基團(tuán)的積分值.之后依據(jù)公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)百分誤差，其中為理論值.

混合物中各組分含量的實(shí)驗(yàn)偏差計(jì)算公式為ΦM=[(φexp-φ0)/φ0]×100%，其中，φexp=Ia/(Ia+Ib)為實(shí)驗(yàn)測(cè)得混合物含量，Ia和Ib分別代表混合物中各組分的特征峰積分值，φ0為實(shí)際組分含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 3種實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)Multiple-CP定量性的影響

Multiple-CP實(shí)驗(yàn)脈沖序列如Scheme 1所示.在經(jīng)過初次交叉極化作用后，1H和13C的磁化矢量在90°脈沖的作用下，回到z方向（即沿B0場(chǎng)方向）.在td期間，1H的磁化矢量通過自旋晶格弛豫作用恢復(fù)到熱力學(xué)平衡態(tài)，1H的自旋晶格弛豫時(shí)間用T1，H表示.同時(shí)，已經(jīng)極化增強(qiáng)的13C信號(hào)則會(huì)通過自旋晶格弛豫作用發(fā)生衰減，碳的自旋晶格弛豫時(shí)間用T1，C表示.因此，td的設(shè)置既需要確保大部分1H的磁化矢量恢復(fù)到熱力學(xué)平衡態(tài)，同時(shí)應(yīng)盡可能減小13C磁化矢量的衰減.此外，td的設(shè)置直接影響Multiple-CP的實(shí)驗(yàn)時(shí)間.對(duì)于n=4，累加次數(shù)為1000的13C Multiple-CP實(shí)驗(yàn)，當(dāng)td增加1 s時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)51 min.因此，td的設(shè)置不可過長(zhǎng)，僅需確保大部分1H的磁化矢量弛豫恢復(fù)即可，一般需滿足1～2T1，H，此時(shí)約63%～86%的1H的磁化矢量弛豫恢復(fù)［25］.此外，在逐次的交叉過程中，單次交叉極化的接觸時(shí)間為tp，交叉極化總次數(shù)為n.上述實(shí)驗(yàn)參數(shù)均影響Multiple-CP測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性.

Scheme 1 Scheme of Multiple-CP pulse sequence with CP following phase cycles

Fig.1 Structural scheme of L-alanine(inset)and the 13C Multiple-CP spectrum recorded with tp of 1.0 ms,td of 2 s and n of 4

為了探討td，tp和n3個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)Multiple-CP測(cè)試準(zhǔn)確度的影響，首先選取L-丙氨酸為模型樣品，通過改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件，研究分子中CH3，CH和CO 3種基團(tuán)譜峰強(qiáng)度的變化規(guī)律.L-丙氨酸分子結(jié)構(gòu)及13C Multiple-CP譜圖如圖1所示.通過改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp，初步探討Multiple-CP定量性對(duì)接觸時(shí)間的依賴性.同時(shí)，對(duì)比CP以及Multiple-CP條件下，各基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)度隨交叉極化時(shí)間tp的變化關(guān)系.由于L-丙氨酸的自旋晶格弛豫時(shí)間T1，H=0.977 s，因此實(shí)驗(yàn)將td設(shè)為2 s.n分別為1，2，4，8，td為2 s時(shí)，CO，CH，CH3的譜峰強(qiáng)度隨tp變化的動(dòng)力學(xué)曲線如圖2（A）～（D）所示.可見，當(dāng)交叉極化次數(shù)n=1時(shí)，即普通的CP實(shí)驗(yàn)，在0 ms＜tp＜2.0 ms的范圍內(nèi)，3個(gè)基團(tuán)的交叉極化效率在任何接觸時(shí)間均不相同，3種基團(tuán)的交叉極化動(dòng)力學(xué)曲線受基團(tuán)TCH和TH1ρ等參數(shù)的調(diào)制，CP無法實(shí)現(xiàn)定量.n=2時(shí)的交叉極化動(dòng)力學(xué)曲線與CP不同，但仍無法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè).而當(dāng)n=4時(shí)，各基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)度在1.0～1.3 ms期間內(nèi)趨于一致，且該區(qū)間內(nèi)基團(tuán)積分比值相對(duì)于理論值的百分誤差小于5%.當(dāng)n=8時(shí)，可定量的tp范圍擴(kuò)大至0.8～1.3 ms.以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Multiple-CP的動(dòng)力學(xué)曲線與常規(guī)CP不同，譜峰強(qiáng)度明顯受到tp的影響，且受到交叉極化次數(shù)n的調(diào)制.通過對(duì)CO，CH和CH3基團(tuán)TCH和TH1ρ的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3種基團(tuán)的TCH值差異較大，具體數(shù)據(jù)列于表1.其中，TCH的差異性致使3種基團(tuán)交叉極化效率在0～1.0 ms區(qū)間差異較大.此外，L-丙氨酸的TH1ρ僅為1.7 ms，說明在接觸時(shí)間為0.5～2.0 ms范圍內(nèi)，1H的磁化矢量由于TH1ρ作用衰減了20%～69%，因此，隨著接觸時(shí)間的增加，譜峰強(qiáng)度均表現(xiàn)出衰減的趨勢(shì)（圖3）.依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，對(duì)于L-丙氨酸樣品，Multiple-CP譜圖的定量性對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp的依賴性較大，當(dāng)n=4，td=2 s時(shí)，僅在tp處于1.0～1.3 ms范圍內(nèi)獲取定量結(jié)果.

Fig.2 Normalized peak-intensities of L-alanine recorded as a function of contact time tp using Multiple-CP scheme

此外，探討了Multiple-CP定量性對(duì)交叉極化次數(shù)n的依賴性.圖3（A）～（D）分別為td=2 s，tp=0.5，1.0，1.5和2.0 ms時(shí)，n值從2變化到11時(shí)繪制的各基團(tuán)信號(hào)強(qiáng)度隨n的變化關(guān)系圖.由圖3可見，隨著n值的增加，CO，CH和CH3的交叉極化效率逐漸增大，所采集的三者的信號(hào)逐漸增強(qiáng).當(dāng)tp=0.5，1.5和2.0 ms時(shí)，三者交叉極化效率在任一交叉極化次數(shù)n下都不能達(dá)到一致；而當(dāng)tp=1.0 ms，n≥4時(shí)，交叉極化效率基本一致，定量結(jié)果的實(shí)驗(yàn)百分誤差小于5%.

為了更系統(tǒng)地探討Multiple-CP測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度對(duì)td，tp及n的依賴性，測(cè)試了L-丙氨酸中CO，CH和CH3信號(hào)強(qiáng)度分別隨tp，td和tp，n的變化關(guān)系，并繪制了相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度投影圖和實(shí)驗(yàn)百分誤差投影圖，并用不同顏色表示不同的強(qiáng)度或百分誤差值（圖4和圖5）.首先，當(dāng)交叉極化次數(shù)n=4時(shí)，通過逐次改變tp和td2個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，來研究該組實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)譜峰強(qiáng)度和測(cè)試準(zhǔn)確度的影響［圖4（A）～（C）］.可見，3組譜峰信號(hào)的強(qiáng)度隨td和tp的增加，表現(xiàn)出較明顯、且各不相同的變化趨勢(shì)，這主要是由于各個(gè)基團(tuán)的TCH差異較大，且TH1ρ的影響較明顯.為了評(píng)估Multiple-CP方法在各個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件下，測(cè)試L-丙氨酸基團(tuán)比例的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)計(jì)算了定量結(jié)果的實(shí)驗(yàn)百分誤差，對(duì)應(yīng)的誤差投影圖如圖4（D）所示.其中，深紫色區(qū)域的誤差值小于5%.依據(jù)誤差投影圖的顏色信息可知，td對(duì)于測(cè)試準(zhǔn)確度的影響較低，實(shí)驗(yàn)中僅需滿足td≥1.0 s.與之不同，tp的變化對(duì)測(cè)試準(zhǔn)確度有較大的影響，僅當(dāng)tp處于1.0～1.3 ms范圍內(nèi)時(shí)，Multiple-CP表現(xiàn)出較高的定量性，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)百分誤差小于5%；對(duì)于其它的tp參數(shù)區(qū)間，百分誤差值較大，Multiple-CP不具有定量性.此外，實(shí)驗(yàn)將td定為2 s，通過逐次改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp和n來進(jìn)一步探討Multiple-CP定量性對(duì)交叉極化次數(shù)n的依賴性，所繪制的信號(hào)強(qiáng)度投影圖及對(duì)應(yīng)的誤差投影圖如圖5（A）～（D）所示.通過對(duì)該組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)交叉極化次數(shù)n≥4時(shí)，Multiple-CP方法的tp最優(yōu)范圍大致相同，并且隨著n的增大，適用于定量CP的tp范圍略有增寬.n=4時(shí)，誤差小于5%的tp范圍為1.0～1.3 ms；n=8時(shí)，可定量tp范圍增至0.8～1.3 ms；而當(dāng)n=11時(shí)，誤差小于5%的tp范圍為0.6～1.2 ms.

Table 1 TCH,T1,H and T H1ρvalues of L-alanine and L-valine

Fig.3 Normalized Multiple-CP peak-intensities of L-alanine as a function of the number of CP contacts with td of 2 s and tpof 0.5 ms(A),1.0 ms(B),1.5 ms(C)and 2.0 ms(D)

Fig.4 Two dimentional projections of peak intensity modulated by Multiple-CP experimental parameters of tp vs.td for CO(A),CH(B)and CH3(C)in L-alanine and the two dimentional projection of the corresponding percentage errors(D)

Fig.5 Two dimentional projections of peak intensity modulated by Multiple-CP experimental parameters of tp vs.n for CO(A),CH(B)and CH3(C)in L-alanine and the two dimentional projection of the corresponding percentage errors(D)

2.2 樣品TCH和的差異度對(duì)Multiple-CP定量實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響

通過對(duì)L-丙氨酸的研究可知，在滿足td和n的設(shè)置條件下，Multiple-CP測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性受單次交叉極化接觸時(shí)間tp的影響較大.而tp在固定范圍內(nèi)，影響譜峰強(qiáng)度的因素主要包括TCH和TH1ρ.對(duì)于具有不同TCH和TH1ρ的體系或基團(tuán)，其對(duì)應(yīng)單次CP譜峰的交叉極化動(dòng)力學(xué)曲線不同，因而譜峰積分不具有定量性.而通過對(duì)L-丙氨酸樣品的研究發(fā)現(xiàn)，Multiple-CP的多次極化傳遞動(dòng)力學(xué)過程同樣受到TCH和TH1ρ的影響，但與單次CP實(shí)驗(yàn)相比，Multiple-CP的交叉極化動(dòng)力學(xué)過程對(duì)TCH和TH1ρ的寬容度更高.

Fig.6 Structural scheme of L-valine(inset)and 13C Multiple-CP spectrum recorded with tpof 1.0 ms,td of 2 s and n of 4

為了探討樣品的TCH和TH1ρ的差異度對(duì)Multiple-CP測(cè)試準(zhǔn)確度的影響，選取了L-纈氨酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn).L-纈氨酸的分子化學(xué)結(jié)構(gòu)較L-丙氨酸復(fù)雜，其分子內(nèi)同時(shí)存在TCH值相近和差異較大的基團(tuán)，可以作為Multiple-CP方法評(píng)估的模型樣品.L-纈氨酸的分子化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖、13C Multiple-CP譜圖和譜峰歸屬如圖6所示.L-纈氨酸分子內(nèi)各個(gè)基團(tuán)的TCH和值如表1所示.其中，相同種類基團(tuán)之間的TCH值相近，如同為CH基團(tuán)的C5，C6和同為CH3基團(tuán)的C4，C8，而不同種類基團(tuán)之間的TCH值相差較大；如分別為CO，CH和CH3的C7，C5和C6.實(shí)驗(yàn)首先設(shè)定n=4，td=2 s，通過改變tp，得到L-纈氨酸中各基團(tuán)譜峰的動(dòng)力學(xué)曲線圖，如圖7（A）所示.通過對(duì)各基團(tuán)譜峰比例的計(jì)算，得到相對(duì)理論值的實(shí)驗(yàn)百分誤差［圖7（B）］.依據(jù)測(cè)試結(jié)果可知，當(dāng)tp為1.0～1.3 ms時(shí)，實(shí)驗(yàn)誤差小于5%，與L-丙氨酸Multiple-CP的定量區(qū)間一致.通過對(duì)比表中2種氨基酸的TCH和發(fā)現(xiàn)二者的TCH和雖然不同，但相同種類基團(tuán)的TCH和接近.基于此，L-纈氨酸的Multiple-CP實(shí)驗(yàn)參數(shù)與L-丙氨酸基本一致.此外，L-纈氨酸中的C5和C6，C4和C8的Multiple-CP譜峰強(qiáng)度隨tp變化的動(dòng)力學(xué)曲線幾乎一致，其中C4和C8的TCH相差6%，而C5和C6的TCH相差8%.由此可見，與CP相比，Multiple-CP的極化傳遞動(dòng)力學(xué)過程受TCH和差異度的影響較低.圖8對(duì)比了C5和C6，C4和C8，C5和C8，C6和C7 4組碳譜峰的積分比值相對(duì)于理論值的誤差.對(duì)于均相的純凈物體系，各個(gè)基團(tuán)的相同，但TCH往往不同.其中，C5和C6，C4和C8 2組基團(tuán)的TCH最大相差約8%［圖8（A）和（B）］；而C5和C8，C6和C7 2組基團(tuán)的TCH相差分別78%和88%［圖8（C）和（D）］.由圖中數(shù)據(jù)可見，對(duì)于TCH差異性較小的C5和C6，C4和C8，其Multiple-CP定量結(jié)果在tp為0.1～2.0 ms時(shí)，百分誤差均小于5%；而對(duì)于TCH差異性較大的C5和C8，C6和C7，其獲取Multiple-CP定量結(jié)果的tp范圍逐步減小，當(dāng)TCH相差88%時(shí)，僅在0.9～1.4 ms范圍內(nèi)時(shí)，誤差小于5%.由此可見.對(duì)于TCH差異較大的基團(tuán)，其Multiple-CP的定量準(zhǔn)確度受實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp的影響較大.

Fig.7 Normalized peak intensities of L-valine recorded as a function of contact time tp using Multiple-CP scheme(A)and the corresponding percentage errors modulated by tp(B)

Fig.8 Percentage errors of the group ratio as determined using Multiple-CP with the variation of tp for L-valine

為了進(jìn)一步探討Multiple-CP對(duì)于共混體系組分含量測(cè)定的可行性，選取L-纈氨酸和L-丙氨酸的混合物作為模型樣品，通過分析幾組TCH和差異度不同的基團(tuán)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，總結(jié)Multiple-CP定量分析的實(shí)驗(yàn)策略.圖9為L(zhǎng)-纈氨酸/L-丙氨酸摩爾比1∶1的混合物的13C Multiple-CP譜圖.混合物譜圖中，L-丙氨酸的C2，C3和L-纈氨酸的C5，C6，C7原子核譜峰基本沒有重疊，可以通過Multiple-CP譜圖中每個(gè)組分的特征峰強(qiáng)度來計(jì)算混合組分的摩爾比.為了對(duì)比TCH和TH1ρ的差異度對(duì)定量準(zhǔn)確度的影響，實(shí)驗(yàn)選取4組不同的基團(tuán)作為研究對(duì)象，包括2組TCH差異較小的CH基團(tuán)：C2和C5，C2和C6，相對(duì)差異度為21%；以及2組TCH相差較大的CH，CO基團(tuán)：C3和C6，C2和C7，相對(duì)差異度為91%.與L-纈氨酸和L-丙氨酸純凈物相同，實(shí)驗(yàn)參數(shù)：td=2 s，n=4，通過改變tp由0.1 ms至2.0 ms，采集一系列Multiple-CP譜圖，計(jì)算各tp下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，繪制的誤差圖如圖10所示.對(duì)于TCH差異較小的2組基團(tuán)C2和C5，C2和C6，Multiple-CP在tp為0.1～2.0 ms時(shí)均表現(xiàn)出很高的測(cè)試準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)誤差小于5%［圖10（A）和（B）］；而對(duì)于TCH差異較大的2組基團(tuán)C3和C6，C2和C7，Multiple-CP的定量性對(duì)tp實(shí)驗(yàn)參數(shù)的依賴性較大，僅當(dāng)tp為0.9～1.2 ms時(shí)，組分比例的測(cè)試結(jié)果與理論結(jié)果接近［圖10（C）和（D）］.

Fig.9 Structural scheme of L-alanine and L-valine(inset)and the 13C Multiple-CP spectrum recorded with tpof 1.0 ms,td of 2 s and n of 4

Fig.10 Percentage errors of the group ratio as determined using Multiple-CP with the variation of tp for L-alanine and L-valine mixture

依據(jù)對(duì)L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-纈氨酸/L-丙氨酸混合物的研究數(shù)據(jù)，可以看到分子基團(tuán)的TCH和對(duì)Multiple-CP實(shí)驗(yàn)參數(shù)的設(shè)置影響較大.對(duì)于常規(guī)SSNMR實(shí)驗(yàn)條件下的純凈物或均相體系，由于氫原子核間的自旋擴(kuò)散作用，使得各個(gè)基團(tuán)的基本一致.此時(shí)，TCH是影響tp參數(shù)設(shè)置的關(guān)鍵.依據(jù)L-纈氨酸分子內(nèi)基團(tuán)比例的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以看到當(dāng)2種基團(tuán)的TCH差異度為8%時(shí)，Multiple-CP對(duì)tp參數(shù)的寬容度較高.而當(dāng)2種基團(tuán)的TCH差異度達(dá)到88%時(shí)，實(shí)現(xiàn)Multiple-CP定量檢測(cè)的tp參數(shù)范圍較窄.此時(shí)，對(duì)于13C Multiple-CP譜圖信噪比較差的樣品體系，tp的優(yōu)化存在困難.此外，應(yīng)用Multiple-CP測(cè)試混合物的組分含量時(shí)，同樣需要考慮各個(gè)組分TCH和的差異性.首先，混合物中各組分的需相近，實(shí)驗(yàn)選取的L-丙氨酸和L-纈氨酸的差異度為32%；此外，對(duì)于各組分的特征峰，需盡量選取種類相同的基團(tuán)，這樣確保TCH的差異度不大.對(duì)于L-纈氨酸和L-丙氨酸的混合物樣品，當(dāng)TCH的差異度為21%時(shí)，Multiple-CP仍可在較寬的tp范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)定量.

3 結(jié) 論

通過Multiple-CP定量技術(shù)對(duì)L-丙氨酸、L-纈氨酸及二者共混物的定量檢測(cè)，研究了在該方法中實(shí)驗(yàn)參數(shù)td，tp和n對(duì)樣品屬性參數(shù)的依賴性，并總結(jié)了Multiple-CP方法適用的樣品屬性參數(shù)特征.研究結(jié)果表明，在3種實(shí)驗(yàn)參數(shù)中，tp對(duì)樣品屬性的依賴性最強(qiáng)，該參數(shù)的設(shè)置受樣品的TCH和的影響最大.對(duì)于純凈物和均相體系而言，不同基團(tuán)的TCH的差異度是影響實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp設(shè)置的關(guān)鍵；而對(duì)于混合物體系或多相體系，需同時(shí)考慮各個(gè)基團(tuán)的TCH和各組分的對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)tp的影響.對(duì)于各組分的特征峰，需盡量選取種類相同的基團(tuán)，可確保TCH的差異度不大.還需進(jìn)一步通過改進(jìn)Multiple-CP實(shí)驗(yàn)脈沖序列簡(jiǎn)化Multiple-CP的優(yōu)化過程，提高實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品屬性TCH和的寬容度.