仇午丹，方 倩

（浙江人欣檢測研究院股份有限公司，浙江 寧波 315000）

1.引言

土壤是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，土壤微生物是土壤的重要組成部分，其在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化循環(huán)、統(tǒng)穩(wěn)定性和抗干擾能力以及土壤可持續(xù)發(fā)展中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)之一，其活性和群落結(jié)構(gòu)的變化能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況[2]。隨著城市化的發(fā)展，城市中土壤微生物的多樣性受到影響，以道路為例來說，大量的汽車尾氣排放，會對該土壤中的微生物群落造成一定的影響。長期以來純培養(yǎng)技術(shù)是人們對環(huán)境中的微生物進(jìn)行調(diào)查研究和開發(fā)的主要方法。本研究在對土壤微生物進(jìn)行純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定的手段來研究不同城市化程度的區(qū)域中土壤微生物多樣性的變化。

2.實驗方法與材料

2.1 土樣采集

選取嘉興市中山路為主軸從西至東分別在市區(qū)、城鄉(xiāng)交界處、鄉(xiāng)村土地共五處五點取樣法采取土樣。采樣前除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表土，挖好深度為10-15厘米的剖面后，先取下層土樣，再取上層土樣于無菌袋中，貼上標(biāo)簽用橡皮筋寬松扎口，帶回實驗室4℃冷藏。

2.2 細(xì)菌、放線菌分子鑒定

細(xì)菌、放線菌分子鑒定采用PCR-RFLP技術(shù)此技術(shù)克服了微生物培養(yǎng)技術(shù)的限制，能在遺傳本質(zhì)的層面上對微生物群落進(jìn)行較客觀的分析，較精確地揭示了微生物的種類和遺傳多樣性[3]。土樣DNA的提取及PCR擴(kuò)增：用DNA母液pH 8.0(100mmol/L Tris， 100 mmol/L EDTA， 100 mmol/L磷酸鈉，1.5 mol/L NaCl， 1%CTAB)提取土樣DNA后進(jìn)行凝膠電泳驗證。將DNA運(yùn)用16sRNA作為通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。和T載體連接：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和T-載體在T4ligase的作用下，22℃連接2h或16℃連接過夜。篩選陽性克?。簩⑦B接后的產(chǎn)物，涂布與相應(yīng)的抗性平板，并平板中添加IPTG和x-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色克隆，分別進(jìn)行PCR驗證。酶切：將PCR驗證正確的PCR產(chǎn)物，采用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ，HaeⅢ酶切PCR產(chǎn)物；酶切產(chǎn)物電泳檢測最后綜合各個陽性克隆雙酶切圖譜類型，來判斷土壤中不同類型的細(xì)菌。

2.3 微生物數(shù)量測定

微生物的數(shù)量測定采用稀釋平板法[4]。稱取10g于90ml無菌水中，37℃搖床30分鐘。對搖床后的土壤樣液進(jìn)行10-3～10-7系列稀釋后，取100μL涂布在倒好平板的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌），高氏一號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）和馬丁培養(yǎng)基（培養(yǎng)真菌）上。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，高氏一號培養(yǎng)基和馬丁培養(yǎng)基平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。對每次培養(yǎng)后的菌落計數(shù)。挑選合適的平板計算菌落總數(shù)。土樣微生物數(shù)量計算公式：

每克干土中真菌數(shù)量=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/樣土質(zhì)量

2.4 真菌的鑒定

2.4.1 真菌的分離純化

將28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后的真菌在操鏡臺內(nèi)用接種針點樣至平板中單個培養(yǎng)。

2.4.2 真菌的觀察和鑒定。

將分離獲得的真菌培養(yǎng)一段時間后，制片顯微鏡觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、菌絲分枝、有無孢子孢子形態(tài)和菌核特征等形態(tài)特征[6]，結(jié)合《真菌鑒定手冊》[7]鑒定真菌所屬。

2.5 真菌多樣性指數(shù)計算

運(yùn)用多樣性指數(shù)(H)、Pielou均勻度指數(shù)(J)和豐富度指數(shù)(E)等，研究不同生態(tài)環(huán)境土壤真菌多樣性之間的關(guān)系[5]。

Shannon—Wiener多樣性指數(shù)：H′=-ΣPi*lnPi

Pielou均勻度指數(shù)：J = lnNi / lnN

豐富度指數(shù)：E = (S - 1) / lnN

式中，Pi = ni /N表明第i個種所占的比例，n為第i種的個體數(shù)目，N為所有物種的數(shù)目，S為物種數(shù)目。

2.6 細(xì)菌和放線菌分子鑒定

選用細(xì)菌16S rDNA通用引物分別為：5’—AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC—3’和 5’—TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C—3’。

PCR擴(kuò)增 采 用20μL體 系：10×PCR buffer 2.0、10mM dNTPs 0.5μL、上 下 游引物各 10pmol、25mM MgCl22μL、TaqDNA聚合酶0.5μL、模板DNA 1μL，最后加ddH2O補(bǔ)齊至20μL。反應(yīng)條件為：95℃10min；94℃1min；40℃45s；72℃1 min30s，30個循環(huán)；72℃10min。

16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，挑選陽性克隆，再進(jìn)行PCR驗證，將驗證時擴(kuò)增到的16S rRNA，采用Hind Ⅲ和BsuRⅠ進(jìn)行雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)酶切譜型分析，樣品中含有的優(yōu)勢菌種的種數(shù)。

3.結(jié)果與分析

3.1 土壤中微生物數(shù)量分析

表1結(jié)果顯示，市區(qū)，城鄉(xiāng)交界，鄉(xiāng)村三處土樣真菌和細(xì)菌的數(shù)量逐漸減小，放線菌的數(shù)量及土樣微生物的總數(shù)卻逐漸增加。

表1 土樣細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量

3.2 土樣中微生物組成的變化

結(jié)果如圖1所示， 5個土樣中細(xì)菌、放線菌和真菌的組成較為相似，表現(xiàn)出細(xì)菌 > 放線菌 > 真菌，但是具體各種微生物占的比例還是表現(xiàn)出明顯的不同。其中真菌的比例隨著城市化程度降低而表現(xiàn)出明顯增加，而放線菌的比例則略有減少。

圖1 各菌含量百分比圖

3.3細(xì)菌、放線菌分子鑒定結(jié)果分析

對市區(qū)、城鄉(xiāng)交界和鄉(xiāng)村的土樣中的細(xì)菌和放線菌DNA進(jìn)行16sRNA擴(kuò)增，酶切電泳后可探討土樣中優(yōu)勢菌種的分布，結(jié)果，A1（市區(qū)）土樣經(jīng)酶切電泳后有3種不同條帶，故有3種優(yōu)勢菌；A3（城鄉(xiāng)交界）土樣有10種不同條帶，故有10種優(yōu)勢菌；A4（鄉(xiāng)村）土樣有12種不同條帶，故有12種優(yōu)勢菌，結(jié)果表明優(yōu)勢菌數(shù)量市區(qū)<城鄉(xiāng)交界<鄉(xiāng)村。可見，土樣中細(xì)菌、放線菌優(yōu)勢菌的數(shù)量與城市化程度成反比。

3.4 真菌多樣性分析

3.4.1 真菌種屬鑒定

本研究對5個土樣中的真菌進(jìn)行鑒定，研究表明，5個土樣中的真菌共有19屬，其中A1土樣有6屬，A2土樣有5屬，A3土樣有7屬，A4，A5土樣均有8屬。5個土樣中共有的屬有：青霉屬。A1特有的屬有：刺頭束梗霉屬、梭孢霉屬。A2特有的屬有：輪枝霉屬。A3特有的屬有：單梗頭孢霉屬。A4特有的屬有：頭狀束梗霉屬、稀絲頭孢霉屬、木霉屬。A5特有的屬有：暗梗穗孢霉屬、束絲菌屬。結(jié)果表明，鄉(xiāng)村土樣中的真菌種屬最多，城鄉(xiāng)交界土樣次之，市區(qū)土樣中的真菌種屬最少。

3.4.2 真菌多樣性分析

通過對五個土樣真菌多樣性的分析，結(jié)果如表2所示。多樣性指數(shù)表現(xiàn)為農(nóng)村>城鄉(xiāng)交界>市區(qū)，豐富度指數(shù)表現(xiàn)出農(nóng)村>城鄉(xiāng)交界>市區(qū)。從豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)2項生態(tài)指數(shù)可以看出，農(nóng)村土壤真菌的豐富度和多樣性明顯高于城鄉(xiāng)交界處土壤和市區(qū)土壤。這主要由于農(nóng)村道路兩旁的土壤受污染較小，土壤中的真菌處于一種自然的生長環(huán)境下生長，受人類活動影響小。

表2 真菌多樣性指數(shù)

4.結(jié)語

第一，本研究中，不同城市化程度區(qū)域土壤中微生物的組成都表現(xiàn)為細(xì)菌>放線菌>真菌，這與土壤理化性質(zhì)和營養(yǎng)條件有關(guān)。但是放線菌的比例從市區(qū)到鄉(xiāng)村表現(xiàn)出降低趨勢，真菌的比例則有明顯增加。

第二，本研究著重分析了真菌、細(xì)菌放和線菌的多樣性，結(jié)果表明真菌的豐富度指數(shù)及多樣性指數(shù)都表現(xiàn)為：鄉(xiāng)村>城鄉(xiāng)交界>市區(qū)，細(xì)菌、放線菌優(yōu)勢菌數(shù)量：鄉(xiāng)村>城鄉(xiāng)交界>市區(qū)，推測城市化進(jìn)程中人類活動會降低土壤中微生物的多樣性。