藺紅蘋，謝呈媛，王 蕓，成夏嵐

(嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

桐花樹（Aegiceras corniculatum(L.) Blanco）生長在海岸潮間帶，其林帶生境受潮水的周期性浸淹，有多變的鹽度、高溫和強(qiáng)紫外等特殊環(huán)境因素，由此也創(chuàng)造了豐富的微生物群落。植物內(nèi)生固氮菌是指定殖于植物體內(nèi)，不損害植物健康[1]，并且能與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮的一類固氮微生物，屬于植物微生態(tài)系統(tǒng)的天然組分。植物內(nèi)生固氮菌于植物體內(nèi)定殖，生活在植物細(xì)胞內(nèi)、木質(zhì)部導(dǎo)管、細(xì)胞間隙等部位，并進(jìn)行固氮作用。內(nèi)生固氮菌在植物體組織內(nèi)占據(jù)著有利于營養(yǎng)供應(yīng)與微環(huán)境適宜的生態(tài)位，可有效地拮抗許多病原微生物的生長[2]，提高作物抗性，較根際、葉際等附生環(huán)境更有利于與植物形成高效的固氮體系，行使其固氮功能為宿主植物提供氮素，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長和產(chǎn)量的提高，是一類應(yīng)用前景廣泛、尚待開發(fā)的微生物資源[3]。

本研究從湛江海灘桐花樹根部取材，通過分離純化固氮菌，分析其固氮能力，初步篩選出固氮能力較好的優(yōu)良固氮菌，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,旨在培育優(yōu)良紅樹植物內(nèi)生固氮菌、研制固氮菌劑，以期應(yīng)用于紅樹林育苗造林的生產(chǎn)實(shí)踐中，為沿海防護(hù)林體系建設(shè)提供理論依據(jù)，對保護(hù)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于廣東省湛江市海濱公園觀海長廊紅樹林灘涂，隨機(jī)選取桐花樹植株5 株，采集無病蟲害、長勢良好的桐花樹植株的根部根皮組織，用于分離菌株。

1.2 內(nèi)生固氮菌的分離和純化

根部組織樣品用自來水沖洗干凈，用吸水紙吸干表面水分后稱取5 g，無菌水沖洗3～4 次后，用75%乙醇浸泡消毒5～7 min，2%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒10～20 min，無菌水沖洗3～5 次，取最后一次的沖洗液0.1 mL，涂布于無菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。樣品加入50 mL無菌水放在無菌研缽中進(jìn)行研磨，靜止10～15 min后，取0.1 mL 研磨液涂布于Ashby 無氮培養(yǎng)基平板，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)72 h[4]。根據(jù)菌落顏色、形態(tài)等挑選單菌落，分別在Ashby 無氮培養(yǎng)基平板上再次劃線，直到獲得純培養(yǎng)物，最后轉(zhuǎn)接至Ashby 無氮培養(yǎng)基斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

將已經(jīng)純化的菌株接種到Ashby 無氮培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)3 d，觀察菌落大小、形態(tài)、表面和顏色等特征，然后進(jìn)行革蘭氏染色。

1.3 凱氏定氮法檢測固氮能力

參考文獻(xiàn)[5-7]的方法，對菌株的固氮能力進(jìn)行測定。

將各菌株接種到裝有100 mL 無氮液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，28℃、180 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)4 d。量取培養(yǎng)好的菌液樣品10 mL、硫酸銅和硫酸鉀的混合物（比例為1:6）0.5 g、濃硫酸10 mL 和2 粒瓷碎片，移入凱氏燒瓶中，在通風(fēng)櫥內(nèi)，以45°斜于電磁爐上隔石棉網(wǎng)加熱，燒至液體變成藍(lán)綠色透明后，取下冷卻，轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶，加水定容。

吸取2%硼酸溶液10 mL 于錐形瓶中，加2 滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑，將冷凝管下端放置于硼酸液面之下。水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水到2/3 容積處，量取消化樣品5 mL 經(jīng)小漏斗加入到反應(yīng)管內(nèi)，用少量蒸餾水洗下，再加入濃度40%的氫氧化鈉10 mL，加上少量水于漏斗密封。酒精燈加熱發(fā)生瓶蒸餾，至指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾5 min，冷凝管提離硼酸液面后再蒸餾2 min，用蒸餾水沖洗管壁，取下裝有硼酸的錐形瓶，每樣品蒸餾重復(fù)3 次。吸取10 mL 空白消化液，按上述樣品操作步驟操作，作為空白對照。用0.01 mol·L?1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液將錐形瓶內(nèi)的硼酸溶液滴定至終點(diǎn)，變成淺灰紅色，記錄鹽酸的用量，并計算樣品含氮量（mg·L?1）。

1.4 菌株生長培養(yǎng)條件

1.4.1 接菌量 將在28℃、180 r·min?1條件下培養(yǎng)好的菌懸液按2%的接種量接種到試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中。

1.4.2 pH 值 配制pH 值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的LB 液體培養(yǎng)基各50 mL 備用。無菌條件下，將菌懸液接種于各pH 值液體培養(yǎng)基中，搖勻，28℃、180 r·min?1條件下培養(yǎng)24 h 后，測定其在OD600下的吸光值，以不接菌的LB 培養(yǎng)基為空白對照，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。培養(yǎng)48 h 后再測定1 次OD600吸光值[8]。OD600吸光值大，表明菌株生長旺盛，反之亦然。

1.4.3 NaCl 濃度 在pH 值為7 的LB 液體培養(yǎng)基中分別加入濃度0%、1%、2%、3%、4%的NaCl，各50 mL 裝于250 mL 錐形瓶中，每濃度設(shè)3 次重復(fù)，滅菌后備用。無菌操作下，將菌懸液接種于不同NaCl 濃度的LB 液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min?1條件下培養(yǎng)24、48 h 后分別測定OD600吸光值。

1.4.4 溫度 無菌條件下，將菌懸液接種于pH 值為7 的LB 液體培養(yǎng)基中，分別置于20、24、28、32、36℃下180 r·min?1培養(yǎng)，每溫度3 次重復(fù)，以不接菌的為對照，培養(yǎng)24、48 h 后，測定OD600吸光值。

1.4.5 碳源 配制分別由乳糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖代替LB 液體培養(yǎng)基中的碳源（酵母膏）的液體培養(yǎng)基各50 mL，裝于錐形瓶中滅菌備用。無菌條件下，菌懸液接種于5 個不同碳源的pH 值為7 的LB 液體培養(yǎng)基中，搖勻，32℃、180 r·min?1條件下培養(yǎng)24、48 h 后分別測定菌株OD600吸光值。

1.5 菌株生長曲線的測定

將活化后的菌株接種于裝有100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，培養(yǎng)12 h，作為菌種。將菌種接種于分裝有50 mL pH 值為7、NaCl濃度為2%的LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，分別標(biāo)記為0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h，每處理設(shè)3 次重復(fù)，除0 h 處理組外，立即將其余的試驗(yàn)瓶放置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h 取出對應(yīng)編號的錐形瓶菌液，以0 h 的處理組作為空白對照，紫外分光光度計在600 nm 的波長下測定不同培養(yǎng)時間菌液的OD600吸光值。以測得平均OD600吸光值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 20.0 (IBM,Chicago,USA)、Excel 2010 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進(jìn)行均值顯著性檢驗(yàn)，鄧肯多重比較進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)（P<0.05），使用SigmaPlot13.0 進(jìn)行繪圖，所示數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 固氮菌的分離與形態(tài)學(xué)特征

通過Ashby 無氮培養(yǎng)基選擇分離培養(yǎng)后，從紅樹植物桐花樹根部分離得到3 株能在無氮培養(yǎng)基上生長的菌株，分別用A1、B1、C1表示。經(jīng)過4 代的分離純化后，分別進(jìn)行革蘭氏染色，確定3 種菌皆為革蘭氏陰性菌(Gram negative bacillus)。通過凱氏定氮法篩選得到高效固氮能力的菌株A1（圖1），其形態(tài)學(xué)特征：球狀菌，乳白色，菌落圓形，表面光滑，濕潤，邊緣整齊。

圖1 分離的固氮菌株A1Fig.1 Isolated nitrogen fixation strain A1

2.2 固氮菌的固氮能力測定與篩選

分離得到的菌株通過連續(xù)傳代培養(yǎng)后，用微量凱氏定氮法測定菌體固氮量。由表1 可知：所得菌株都具有一定的固氮能力，其中，菌株A1固定的氮量相對較高，達(dá)16.695 mg·L?1，且生長狀況比其他2 株好。綜合評價細(xì)菌的固氮量和生長情況，篩選出高效菌株A1。

表1 菌株的生長狀況（OD600值）和固氮量Table 1 The growth status of the strain (OD600value) and the amount of nitrogen fixation

2.3 固氮菌的最適培養(yǎng)條件

2.3.1 pH 值對菌株生長的影響 pH 值對菌株A1的生長影響顯著（P<0.05）（圖2），菌株A1的pH 值適應(yīng)范圍較廣，在pH 值5～9 范圍內(nèi)其生長速率隨pH 值的增大呈先增大后減小的趨勢，且培養(yǎng)24 h 和48 h 時菌株A1液體培養(yǎng)基的OD600吸光值都在pH 值為7 時達(dá)到最大值；在pH 值為6～8 內(nèi)生長較好，且在pH 值為6 時（24 h，OD600吸光值為0.439；48 h，OD600吸光值為1.012）比pH值為8 時（24 h，OD600吸光值為0.320；48 h，OD600吸光值為0.904）生長狀況好，說明菌株A1是中性偏酸菌。

圖2 pH 值對菌株生長的影響Fig.2 Effects of different pH on strain growth

2.3.2 NaCl 濃度對菌株生長的影響 NaCl 濃度對菌株A1的生長影響顯著（P<0.05）（圖3）。菌株在0%～4%的NaCl 濃度下均能生長，說明菌株對NaCl 濃度有較廣的適應(yīng)性；在NaCl 濃度為1%、2%時，菌株A124 h 生長量OD600吸光值分別為0.997 和1.123，菌株A148 h 生長量OD600吸光值分別為1.265 和1.309。由此可見，該菌株的最佳NaCl 濃度為2%，較為適宜的NaCl 濃度為1%～2%。

圖3 NaCl 濃度對菌株生長的影響Fig.3 Effects of different NaCl salinity on strain growth

2.3.3 溫度對菌株生長的影響 溫度對菌株A1生長的影響顯著（圖4，P<0.05)。菌株A1在20～36℃均可生長；在20～32℃時，隨溫度升高，菌株生長量逐漸增加；在32℃時，菌株A1生長量達(dá)到最大(24 h，OD600吸光值為1.318；48 h，OD600吸光值為1.666)；在32℃之后，生長量開始下降。32℃為該菌的最佳生長溫度，而它的最適溫度為28～32℃。

圖4 溫度對菌株生長的影響Fig.4 Effects of temperature on strain growth

2.3.4 碳源對菌株生長的影響 碳源對菌株生長的影響差異顯著(圖5，P<0.05)。菌株A1對各碳源乳糖、蔗糖、淀粉、葡萄糖、麥芽糖均能利用，生長普遍較好；培養(yǎng)24 h 時，菌株對麥芽糖的利用率較高，生長量較大(OD600吸光值為1.587)；48 h 內(nèi)，菌株對淀粉的利用率更高和持久，生長量達(dá)到最大(OD600吸光值為1.861)，因此，長時間培養(yǎng)可用淀粉做其碳源。

圖5 碳源對菌株生長影響的影響Fig.5 Effects of carbon source on strain growth

2.4 菌株生長曲線的繪制

菌株A1的典型生長曲線見圖6。菌株接種后，經(jīng)過0～4 h 的延遲期，在4～20 h 進(jìn)入了快速生長的對數(shù)期，20 h 之后到達(dá)穩(wěn)定期，維持12 h后，在32 h 后開始進(jìn)入緩慢的衰亡期。說明篩選出的菌株A1有一個完整的生長過程，包括了延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，生長周期相對較長。

圖6 高效菌株的生長曲線Fig.6 Typical growth curve of strain

3 討論

無氮液體培養(yǎng)基中菌株生長繁殖所需要的氮源全部來于對氮?dú)獾墓潭?，劉欣林[9]用凱氏定氮法測得不同小麥內(nèi)生固氮菌的固氮量分別為3.6、3.0、2.8、2.7 mg·L?1；欒敏[10]用凱氏定氮法測得土壤自生固氮菌的固氮量分別為4.0、3.0、2.7 mg·L?1；本實(shí)驗(yàn)用凱氏定氮法測得試驗(yàn)菌的固氮量為16.695 mg·L?1，顯示出良好的固氮性能；而楊從發(fā)等[11]取小麥、水稻、玉米和蔬菜根際土壤測得的自生固氮菌的固氮量從13.6 mg·L?1到72.2 mg·L?1不等，說明取材地點(diǎn)對固氮菌的固氮量影響較大。楊從發(fā)等[11]通過乙炔還原法和凱氏定氮法比較了自生固氮菌的固氮能力，結(jié)果表明，2 種方法都能很好的測定固氮酶活性。紅樹林內(nèi)生固氮菌在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)、可持續(xù)發(fā)展以及紅樹植物的保育和繁殖方面應(yīng)用前景廣闊[12]。然而，開發(fā)固氮資源還需要做進(jìn)一步的研究，比如接種固氮劑到作物上，評估接種對作物生長的影響等。

培養(yǎng)液中不同pH 值對菌體的生產(chǎn)量影響較大，在pH 值 ≤ 5 的培養(yǎng)液中，菌株不能正常生長，培養(yǎng)液中的pH 值對細(xì)菌代謝產(chǎn)物的解離有影響，引起細(xì)胞膜的電荷變化，從而影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。此外，pH 值還影響酶的合成，導(dǎo)致影響細(xì)菌對物質(zhì)的分解利用效率；pH 值過高或過低都不利于細(xì)菌的生長和代謝物質(zhì)的產(chǎn)生，從而影響細(xì)菌的固氮能力[13]。菌株A1在5

NaCl 在維持滲透壓方面起重要作用，Na+和Cl?是維持細(xì)胞外液滲透壓的主要離子。目前，關(guān)于滲透壓影響固氮菌生長和功能的研究較少，因?yàn)榧?xì)菌的有關(guān)耐鹽機(jī)理較復(fù)雜，多數(shù)認(rèn)為細(xì)菌可合成或積累一些“親和性溶質(zhì)”的有機(jī)化合物，這些有機(jī)化合物在細(xì)菌體內(nèi)迅速合成和分解，對于不同的鹽濃度環(huán)境有很好的適應(yīng)作用。本試驗(yàn)菌株A1在NaCl濃度為2%時，生長量最大，與侯偉等[14]對廣東箣竹內(nèi)生竹內(nèi)生固氮菌在NaCl 濃度為0.5～2.5 g·L?1時能保持旺盛生長且固氮酶活性較強(qiáng)的研究結(jié)論一致。本試驗(yàn)菌株在NaCl 濃度0%～4%的條件下均能較好地生長。

低溫時，細(xì)胞的酶活性較低，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力較弱，進(jìn)而影響生物的生長；隨著溫度升高，酶活性升高，對營養(yǎng)物質(zhì)利用加快，提高了細(xì)菌生長分化速度；超過一定溫度時，酶會逐漸失活，導(dǎo)致細(xì)菌減少甚至死亡。本研究菌株最適宜溫度為32℃，在此溫度可以達(dá)到細(xì)菌生長的較高水平；28～32℃時，菌株生長勢較強(qiáng)。劉彩霞等[16]認(rèn)為，杉木林土壤中固氮菌的適宜生長溫度為28℃，較為適宜生長區(qū)的溫度為 20、28、37℃；侯偉等[14]認(rèn)為，廣東箣竹內(nèi)生固氮菌在26～37℃時，菌液OD600吸光值和固氮酶活性都維持在較高水平，溫度偏高于本研究結(jié)果。筆者認(rèn)為，紅樹根部長期處于海水的浸泡中，溫度低于陸地上溫度，適宜溫度略低于陸地植物內(nèi)生菌是長期適應(yīng)的結(jié)果。

碳源是細(xì)胞生命活動所需的重要能量來源，同時提供合成產(chǎn)物的碳架。在微生物的培養(yǎng)中，碳源為微生物的正常生長和分裂提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，菌株A1在對碳源的長期利用中，淀粉的供能利用效果更好，淀粉也是植物光合作用的主要產(chǎn)物。

4 結(jié)論

本研究從湛江海灘桐花樹根部獲得1 株高效固氮菌，對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，其最適生長條件為：溫度32℃，pH 值7，NaCl 濃度2%，最適碳源淀粉。本實(shí)驗(yàn)為培育優(yōu)良的紅樹植物內(nèi)生固氮菌與研制高效固氮菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論依據(jù)。