周小青 唐成程 鄒慶劍?

(1.五邑大學生物科技與大健康學院,廣東江門 529020;2.江門市大健康國際創(chuàng)新研究院,廣東江門 529000)

由新型冠狀病毒SARS-CoV-2 導致的新冠肺炎(COVID-19)目前正在全球蔓延,波及范圍達全球200 多個國家和地區(qū)。截止2020 年12 月25 日,全球累計確診7977 多萬例,死亡人數(shù)超174 萬例。疫情爆發(fā)后,全世界的科學家們快速報道了一系列針對SARS-CoV-2 和COVID-19 的研究,包括SARSCoV-2 病毒基因組序列[1-2],COVID-19 臨床癥狀[3-4],動物模型[5],治療方案[6]和疫苗研發(fā)[7]等。我們與SARS-CoV-2 病毒的戰(zhàn)斗還在繼續(xù),其源頭和宿主、傳播途徑、致病機理和危害性等一系列復雜問題還有待進一步的深入研究,更為重要的是相應藥物以及抗體和疫苗的開發(fā)。雖然目前全世界范圍內正在進行多項臨床試驗,但是與此同時,開展有關SARS-CoV-2 和COVID-19 的基礎研究也至關重要。對不同的模式生物體進行臨床前研究,可以幫助人們更好地了解SARS-CoV-2 病毒并測試治療藥物的安全性和有效性。有效的新冠肺炎動物模型,不僅能幫助我們了解新冠肺炎的發(fā)病機制和病理特征,同時也有助于針對新冠肺炎的藥物及疫苗的研發(fā)。本文就疫情爆發(fā)以來各種SARS-CoV-2易感實驗動物的感染情況和病理特征進行歸納總結,分析了不同實驗動物的應用范圍,為選擇合適的易感實驗動物以開發(fā)COVID-19 疫苗和藥物提供一定的參考依據(jù)。

各個物種根據(jù)對SARS-CoV-2 的敏感性,可分為易感實驗動物和不易感實驗動物。目前已經(jīng)確定的易感實驗動物有hACE2 人源化小鼠,倉鼠,雪貂,貓和非人靈長類等,不易感的實驗動物有野生型小鼠,兔子,豬,犬等。

1 小鼠

小鼠作為經(jīng)典的模式生物,一直是臨床前研究的首選實驗動物。不過前期研究表明,野生型小鼠(C57BL/6 或BALA/c 等)對SARS-CoV-2 不易感,而對SARS 病毒(SARS-CoV)易感的hACE2 遺傳修飾人源化小鼠在感染SARS-CoV-2 后,表現(xiàn)出不同程度的新冠肺炎臨床癥狀[8-18]。目前使用的hACE2遺傳修飾人源化小鼠主要有以下幾種:

1.1 hACE2 轉基因小鼠

Bao 等[14]構建了由小鼠ACE2(mACE2)啟動子啟動表達人ACE2(hACE2)基因的表達載體,然后通過顯微注射的方法獲得了hACE2 轉基因小鼠。將SARS-CoV-2 病毒接種到hACE2 轉基因小鼠后,可觀察到小鼠明顯的體重下降以及間質性肺炎,可見巨噬細胞聚集在肺泡腔內,且大量巨噬細胞和淋巴細胞浸潤肺泡間質。檢測接種了SARS-CoV-2 病毒小鼠的多個組織器官,發(fā)現(xiàn)小鼠的肺部有高水平的病毒載量,且支氣管上皮細胞、巨噬細胞和肺泡上皮中均可觀察到病毒抗原。

1.2 hACE2 基因敲入小鼠

Sun 等[15]利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術,在野生型小鼠中敲入人的ACE2 基因,制備了表達人ACE2的基因敲入小鼠。與野生型C57BL/6 小鼠相比,幼齡和老齡的hACE2 敲入小鼠在鼻內感染SARS-CoV-2后,肺、氣管和大腦中均保持高病毒載量。雖然未觀察到死亡病例,但在感染SARS-CoV-2 的hACE2 敲入小鼠中可觀察到間質性肺炎和細胞因子升高。

1.3 非轉基因小鼠

Sun 等[16]利用鼻吸的方法將腺病毒介導的Ad5-hACE2 轉導至野生型小鼠(C57BL/6 或BALA/c小鼠)和相關基因敲除小鼠(I 型干擾素受體缺陷小鼠或干擾素通路關鍵基因STAT1 敲除小鼠),建立了肺部表達hACE2 基因的小鼠。無獨有偶,Hassan等[17]也通過鼻吸的方法將編碼人類ACE2 的腺病毒載體轉導到BALB/c 小鼠中,成功的在小鼠肺組織中表達了hACE2。此類非轉基因小鼠在感染SARS-CoV-2 后出現(xiàn)肺炎,肺部保持高滴度的病毒復制,且出現(xiàn)體重減輕和嚴重肺病理等現(xiàn)象。此方法不需要轉基因或者基因敲入技術,可以縮短動物模型建模時間,同時規(guī)避傳統(tǒng)基因修飾技術的影響。

以上三種小鼠(表1)皆能在不同程度上感染SARS-CoV-2,且表現(xiàn)出體重下降和肺病理等類人性的臨床癥狀,不過鑒于這些小鼠都是經(jīng)過hACE2 人源化修飾,且嚙齒類動物和哺乳類動物天然存在某些差異,因此小鼠更適合SARS-CoV-2 病毒的致病機制和機理等基礎研究。

2 倉鼠

Chan 等[19]首次使用敘利亞倉鼠進行COVID-19 研究,結果發(fā)現(xiàn)感染SARS-CoV-2 后,這些倉鼠表現(xiàn)出呼吸急促、體重減輕和肺泡損傷并伴有廣泛的細胞凋亡,與人類的臨床癥狀相比,較為符合人類輕度至中度疾病的發(fā)展過程。Sia 等[20]的研究工作也表明敘利亞倉鼠可以感染SARS-CoV-2,并出現(xiàn)相似的癥狀。比較有趣的是,研究還發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2可通過直接接觸和氣溶膠的方式從已感染的倉鼠傳播到幼年倉鼠,而通過污染物傳播的效率反而較低。Imai 等[21]的研究工作表明SARS-CoV-2 分離株可以在倉鼠肺中有效復制,在鼻內感染后引起嚴重的病理性肺損傷,且肺損傷與受SARS-CoV-2 感染的人肺具有共同的特征,包括嚴重的雙肺多發(fā)磨玻璃影以及浸潤影,甚至嚴重時期的肺實變。

倉鼠感染SARS-CoV-2 后,表現(xiàn)出輕度至中度肺炎的臨床癥狀,且感染的倉鼠可通過直接接觸和氣溶膠的方式傳播給幼年倉鼠;另外倉鼠相對其他大動物模型來說成本比較低,可大規(guī)模飼養(yǎng)。因此倉鼠可用于SARS-CoV-2 傳播和感染途徑的研究。

3 雪貂

由于呼吸系統(tǒng)的組織結構和解剖結構與人相似,雪貂早已被應用于模擬人類呼吸道疾病和呼吸道病毒傳播的研究,包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒和SARS-CoV 等[22-32]。Shi 等[25]在接種了SARS-CoV-2 的雪貂上呼吸道和下呼吸道器官中觀察到SARS-CoV-2 的有效復制,并在氣管和腎臟中檢測到病毒RNA。不過感染SARS-CoV-2 后的雪貂除了體溫略有升高之外,并沒有出現(xiàn)更明顯的臨床癥狀,更沒有出現(xiàn)嚴重疾病或者死亡的現(xiàn)象。Kim 等[26]的研究工作同樣表明,受SARS-CoV-2 感染的雪貂表現(xiàn)出體溫升高和病毒復制,但沒有出現(xiàn)死亡個例。Park 等[27]在雪貂感染模型中評估了不同種抗病毒藥物對SARS-CoV-2 感染的抗病毒作用,結果發(fā)現(xiàn)盡管大多數(shù)藥物治療均能稍微減輕感染雪貂的臨床癥狀,但除了恩曲他濱-替諾福韋能稍微降低病毒滴度外,其余幾種藥物并未起到降低病毒滴度的作用。此外,用硫唑嘌呤處理的免疫抑制的雪貂表現(xiàn)出延遲的病毒清除和較低的血清中和滴度,導致感染時間延長。

雪貂雖然能感染SARS-CoV-2,但沒有明顯的臨床癥狀,且雪貂也不是常規(guī)的模式生物,不過雪貂可以填補SARS-CoV-2 感染小型哺乳類動物的這一空白領域,有望開發(fā)更多易感動物模型。

4 貓

先前有關SARS 病毒的研究工作表明,家貓可以感染SARS-CoV 并將病毒傳播給其他貓[32],因此貓也被用來研究對SARS-CoV-2 的易感性。Shi等[25]對貓接種了SARS-CoV-2 并分別在感染后第3天和第6 天進行檢測,發(fā)現(xiàn)可以在貓的不同組織中檢測到病毒RNA,并且感染后的貓組織病理學顯示在鼻、氣管黏膜上皮和肺部都出現(xiàn)了大量病變。這表明SARS-CoV-2 可以在貓體內有效復制,并且年幼的貓比年老的貓更容易受到感染。值得注意的是,同另一項類似研究[33]一致的是,與接種貓同籠的未接種貓也感染了SARS-CoV-2,表明該病毒可以通過空氣傳播途徑在貓之間進行傳播。

貓和雪貂類似,僅出現(xiàn)SARS-CoV-2 感染卻沒有明顯臨床癥狀,不過同一籠貓出現(xiàn)了SARS-CoV-2的空氣傳播,這為家養(yǎng)動物也感染和傳播新冠病毒提供了警醒。

5 非人靈長類:

非人靈長類(non-human primates,NHP)動物一直被認為是臨床前實驗的金標準,因為其在親緣關系上與人類非常接近,且無論是生理結構還是解剖病理結構等都與人十分類似。在此之前,NHP 動物已被廣泛應用于SARS 病毒和MERS 病毒的研究工作,結果顯示恒河猴、食蟹猴和非洲綠猴等均能在不同程度上表現(xiàn)出病毒感染后的臨床癥狀,包括發(fā)熱,腹瀉和肺炎等[34-39]。目前NHP 動物在SARSCoV-2 病毒的研究工作中同樣占據(jù)了重要位置。

5.1 恒河猴

Yu 等[40]首次在正式刊物上報道了恒河猴感染SARS-CoV-2 的研究工作,青年恒河猴和老年恒河猴同時通過氣管感染SARS-CoV-2 病毒,14 d 后檢測發(fā)現(xiàn),老年恒河猴的鼻咽拭子,肛門拭子和肺的病毒復制明顯比青年恒河猴更為活躍,且能在肺泡上皮細胞和巨噬細胞中檢測到病毒抗原。感染后的恒河猴都表現(xiàn)出典型的間質性肺炎,可觀察到肺泡間隔增厚,以及炎癥和水腫;尤其是老年恒河猴還出現(xiàn)了彌漫性嚴重的間質性肺炎,與人肺的病理特征相似。這說明SARS-CoV-2 引起的老年恒河猴的間質性肺炎比青年恒河猴更為嚴重,揭示SARSCoV-2 病毒感染后肺疾病的嚴重程度可能和年齡有關。Deng 等[41]研究工作也證實了同樣的結果;同時還發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 感染后康復的恒河猴再次暴露在SARS-CoV-2 病毒環(huán)境中并不易再次感染,這一結果同樣得到了另一項SARS-CoV-2 感染恒河猴的研究工作的證實[42]。Munster 等[43]在SARS-CoV-2 感染的恒河猴中發(fā)現(xiàn)所有恒河猴的鼻子和喉嚨以及支氣管肺泡灌洗液中可檢測到高病毒載量,同時大多數(shù)恒河猴表現(xiàn)出肺部浸潤,水腫,肺泡充血和透明膜等,都是大多數(shù)人類COVID-19 病例中觀察到的典型中度疾病特征。

5.2 食蟹猴

Rockx 等[44]對感染了SARS-CoV-2 的食蟹猴進行檢測發(fā)現(xiàn),盡管所有感染的食蟹猴都產(chǎn)生了SARS-CoV-2 特異性抗體,但均沒有表現(xiàn)出明顯的臨

床癥狀,不過解剖發(fā)現(xiàn),一半以上的食蟹猴有肺泡水腫,透明膜和白細胞浸潤等癥狀。通過RT-qPCR和鼻拭子、喉拭子以及直腸拭子檢測發(fā)現(xiàn),SARSCoV-2 RNA 在幼年食蟹猴感染后的第2 天達到峰值,而老年食蟹猴則在第4 天達到峰值,個別食蟹猴在感染21 d 后還能檢測到病毒RNA,且部分感染的食蟹猴病毒排出現(xiàn)象和人類無癥狀感染者情況類似。該研究還比較了SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2 三種冠狀病毒對食蟹猴的感染情況,發(fā)現(xiàn)MERS-CoV 主要感染食蟹猴的II 型肺細胞,而SARS-CoV 和SARS-CoV-2 則同時感染I 型和II 型肺細胞,而I 型肺細胞的損傷可以導致肺水腫和透明膜的形成。

表1 SARS-CoV-2 易感實驗動物比較Table 1 Comparison of SARS-CoV-2 susceptible laboratory animal

5.3 狨猴

相比于恒河猴和食蟹猴,狨猴用作病毒感染實驗的比較少,這可能和其易感程度比較低有關。Lu等[45]選擇了非人靈長類動物的3 個常用品種(恒河猴、食蟹猴和狨猴)進行SARS-CoV-2 的感染實驗,結果發(fā)現(xiàn),恒河猴對SARS-CoV-2 感染最為敏感,無論是病毒的組織分布,肺部影像變化,還是排毒現(xiàn)象以及各種細胞因子水平和抗體水平變化等,皆和人臨床感染的情況類似。其次是食蟹猴,而狨猴對SARS-CoV-2 感染的敏感性是3 個品種中最低的。

5.4 非人靈長類用于疫苗開發(fā):

除了SARS-CoV-2 感染實驗,恒河猴和食蟹猴還被應用于針對COVID-19 的疫苗和藥物開發(fā)。Gao 等[46]使用一種純化的滅活SARS-CoV-2 病毒候選疫苗--PiCoVacc,分別在不同天數(shù)給恒河猴接種疫苗后再接種SARS-CoV-2 病毒。后期檢測發(fā)現(xiàn),接種PiCoVacc 的恒河猴均未出現(xiàn)發(fā)熱和體重下降現(xiàn)象;血液生化檢測顯示接種組與對照組的淋巴細胞亞群和關鍵細胞因子等指標并無明顯差別;心、肝、脾、肺、腎、腦等各器官的組織病理學評估顯示沒有引起明顯的病理變化。這表明PiCoVacc 疫苗在恒河猴中起到了一定的保護作用的。Wang 等[47]開發(fā)了一種新型滅活候選疫苗BBIBP-CorV,此疫苗可誘導包括食蟹猴和恒河猴在內的多種動物模型產(chǎn)生高水平的中和抗體,以提供對SARS-CoV-2 病毒的保護作用。Yu 等[48]開發(fā)了一種表達S 蛋白的DNA 候選疫苗,并在35 只食蟹猴中進行了評估,結果發(fā)現(xiàn)接種疫苗的食蟹猴都產(chǎn)生了體液免疫和細胞免疫應答;且在后續(xù)接種SARS-CoV-2 后,食蟹猴支氣管肺泡灌洗液和鼻黏膜中的病毒載量與對照組相比明顯減少。這表明該疫苗在食蟹猴中具有針對SARS-CoV-2 攻擊的免疫原性和保護作用。Van 等[49]五月初在bioRxiv 上發(fā)表了編碼SARSCoV-2 突觸蛋白的腺病毒載體疫苗ChAdOx1 nCoV-19 在食蟹猴中的研究工作,研究稱,與對照動物相比,疫苗接種的食蟹猴支氣管肺泡灌洗液和呼吸道組織中的病毒載量顯著降低,并且未觀察到肺炎。不過隨后沒多久有報道稱接種ChAdOx1 nCoV-19疫苗的食蟹猴在接觸SARS-CoV-2 病毒后全部感染并出現(xiàn)了明顯癥狀,說明ChAdOx1 nCoV-19 疫苗并沒有起到該有的保護作用。

5.5 非人靈長類用于藥物開發(fā)

除了疫苗,食蟹猴還被用來測試抗病毒藥物。Williamson 等[50]在感染SARS-CoV-2 病毒并出現(xiàn)下呼吸道疾病的食蟹猴身上靜脈注射雷姆昔韋,定期檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)雷姆昔韋治療的食蟹猴沒有顯示出呼吸道疾病的跡象,并且肺部浸潤減少。首次治療后12 h,可發(fā)現(xiàn)食蟹猴支氣管肺泡灌洗液中的病毒滴度出現(xiàn)了顯著降低的現(xiàn)象。接種后第7 天進行尸檢時,雷姆昔韋治療的食蟹猴肺部病毒載量顯著降低,并且肺組織的損害明顯減少。這意味著瑞姆昔韋對早期感染SARS-CoV-2 的食蟹猴具有明顯的臨床治療效果。

與前面幾種實驗動物相比,非人靈長類動物因其與人類親緣關系相近而備受青睞,幾乎所有的疫苗和藥物在真正應用之前都會經(jīng)過非人靈長類動物的臨床前試驗。多項研究表明,恒河猴和食蟹猴不僅可以感染SARS-CoV-2,還能表現(xiàn)出與人類相似的臨床癥狀,且在疫苗試驗中可以產(chǎn)生中和抗體,因此非人靈長類動物非常適合SARS-CoV-2 疫苗和藥物的開發(fā)試驗。

6 總結與展望

目前研究的實驗動物雖然能在一定的程度上模擬人感染SARS-CoV-2 病毒后的癥狀,但是還沒有辦法完全復制人類臨床癥狀,或多或少存在一定的缺陷(表1)。有的實驗動物能感染SARS-CoV-2病毒,可以檢測出病毒滴度或者抗體,但是沒有表現(xiàn)出臨床癥狀,比如雪貂和貓;有的實驗動物感染SARS-CoV-2 病毒后,只出現(xiàn)了部分臨床癥狀,比如小鼠;有的實驗動物感染SARS-CoV-2 病毒后,不同組織的病毒復制和病毒滴度不一樣,比如非人靈長類動物。因此可以根據(jù)實驗目的和研究對象的不同,選擇合適的實驗動物。比如要研究SARS-CoV-2病毒的致病機理或針對COVID-19 的藥物研發(fā),可以優(yōu)先選擇能表現(xiàn)出與人類相似癥狀的實驗動物;而在COVID-19 疫苗研發(fā)中,則應優(yōu)先考慮SARSCoV-2 病毒可以在實驗動物各組織中進行復制且達到一定水平的病毒滴度。不同實驗動物可以根據(jù)他們的感染情況和病理特征進行不同目的的試驗,從而更好更充分地發(fā)揮實驗動物的作用。

雖然現(xiàn)有的實驗動物不能完全模擬人類臨床癥狀,但依然能發(fā)揮一定的作用,推動SARS-CoV-2和COVID-19 的基礎研究,以及藥物研發(fā)和疫苗開發(fā)的測試工作。相信隨著轉基因技術和基因編輯技術的發(fā)展,以及對SARS-CoV-2 和COVID-19 研究的不斷深入,有望獲得更為理想的SARS-CoV-2易感實驗動物,更好的應用于COVID-19 機制機理研究以及相應疫苗和藥物的研發(fā)。