史 洺 邵思邁 余姊陽 原 野 張振強 張紫娟 郝 莉?

(1.河南中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院,鄭州 450046)

線粒體在生物代謝和能量轉(zhuǎn)換中處于核心地位,參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)自噬、鈣穩(wěn)態(tài)、信號傳導(dǎo)和細胞凋亡等過程。細胞內(nèi)線粒體呈動態(tài)變化的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),線粒體動力學在多種神經(jīng)退行性疾病進程中至關(guān)重要。目前AD 發(fā)生的病理及分子機制尚不清楚,但迄今為止的研究表明,線粒體在其發(fā)病過程中占重要地位。

1 線粒體動力學及其功能

線粒體是細胞的“動力源”,通過氧化磷酸化產(chǎn)生細胞代謝所需能量。線粒體在胞質(zhì)中融合、分裂、降解和再生的過程統(tǒng)稱為線粒體動力學。

分裂可以改變細胞中線粒體的形態(tài),例如神經(jīng)細胞中分布于胞體和樹突的線粒體較長,在軸突中則較為短小;分裂還可以切除不可修復(fù)的、功能失調(diào)的線粒體碎片,通過線粒體的自噬作用清除;在細胞凋亡過程中,線粒體分裂還能促進局部促凋亡細胞色素c 釋放到胞質(zhì)[1]。線粒體融合通過線粒體DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的相互補充確保了細胞器內(nèi)容的均一性,并且可能由此拮抗過量活性氧(ROS)產(chǎn)生導(dǎo)致的線粒體DNA 損傷和功能障礙[2]。線粒體分裂和融合的平衡隨著各種生理信號和細胞內(nèi)環(huán)境的變化而呈周期性改變。

2 線粒體動力相關(guān)蛋白1

哺乳動物細胞內(nèi),與動力有關(guān)的動力相關(guān)蛋白1 (dynamin-related protein1,Drp1 或 dynamin-like protein1,DLP1)在線粒體分裂中起關(guān)鍵作用。Drp1屬于發(fā)動蛋白超家族,最早被發(fā)現(xiàn)于酵母,稱為發(fā)動蛋白1(Dynamin1,DNM1),故又名DNM1L 蛋白。

目前研究認為,哺乳動物細胞中線粒體分裂和融合幾乎都只發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸區(qū)[3]。線粒體分裂可分為三步:1)Drp1 蛋白從胞漿至線粒體外膜聚合;2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌動蛋白共同驅(qū)動Drp1 蛋白收縮;3)Drp1 蛋白進一步收縮導(dǎo)致線粒體分裂。

線粒體分裂存在潛在復(fù)雜且嚴格的調(diào)節(jié)機制。Drp1 及其多種受體促進線粒體分裂,首先在預(yù)先標記的分裂位點周圍自組裝成螺旋狀聚合物,繼而寡聚化從而收縮ER 與線粒體接觸部位的膜,并產(chǎn)生切斷細胞器所需的收縮力[4]。但是,Drp1 如何通過受體被募集到線粒體表面的分子機制尚不清楚,最新研究發(fā)現(xiàn),在線粒體與ER 接觸部位募集含有反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的磷脂酰肌醇4-磷酸鹽的囊泡可能會觸發(fā)導(dǎo)致線粒體分裂的最終事件[5]。

2.1 Drp1 結(jié)構(gòu)

完整的Drp1 分子結(jié)構(gòu)主要包含以下結(jié)構(gòu)域:N端的GTP 酶結(jié)構(gòu)域、中間的螺旋形結(jié)構(gòu)域、C 端的GTP 酶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(GED)以及B-Insert 區(qū),功能區(qū)還包括三個束效應(yīng)元件(BSE)與GTPase 結(jié)構(gòu)域進行通信等。Drp1 本質(zhì)上是一類GTP 水解酶,通過N端的GTP 酶結(jié)構(gòu)域水解GTP 為線粒體提供分裂所需能量,而GED 和InsertB 區(qū)可以通過分子間的相互作用或化學修飾的方式影響Drp1 的活性從而影響其功能[6]。

通過對秀麗隱桿線蟲和哺乳動物細胞中的動力蛋白同源物的分析已鑒定出Drp1,并表明Drp1是進化上高度保守的分裂因子[7],使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對不同進化程度物種的基因比對分析同樣如此[8]。人類Drp1 突變引起相關(guān)疾病,例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不全和神經(jīng)退行性疾病,但突變體的所有位置在與膜分裂和細胞器分裂相關(guān)的發(fā)動蛋白相關(guān)蛋白家族的所有成員中是完全保守的[9]。因此,盡管Drp1 具有多種突變體,但所有的變異體都具有這些結(jié)構(gòu)域,說明這是其發(fā)揮功能所必需的。

2.2 Drp1 的活性調(diào)控

不同生物功能的細胞有多種翻譯后水平機制調(diào)控Drp1 活性,如磷酸化、泛素化、SUMO 化、亞硝基化等。增加Drp1 GTP 水解活性會使構(gòu)象變化,從而增加線粒體收縮和線粒體小管的斷裂緊密度。

2.2.1 Drp1 與磷酸化

Drp1 磷酸化與去磷酸化是激活和失活的過程。Drp1 的磷酸化可發(fā)生在不同的位點,包括Ser600 位點、Ser616 位點、Ser637 位點、Ser585 位點以及Ser693 位點等。

Ser600 包含在C 末端GTPase 效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的一致性CaMKI 磷酸化位點內(nèi)。在神經(jīng)元和HeLa 細胞中,在Ser600 處Drp1 的磷酸化與Drp1 向線粒體的易位增加有關(guān),而在體外,Drp1 的磷酸化導(dǎo)致其對Fis1 的結(jié)合增加[7]。當Drp1 被Ser616 磷酸化的激酶激活時,會引起線粒體分裂[10-11],并參與線粒體鈣單向介導(dǎo)的中性粒細胞的極化和趨化作用[12]。例如,電離輻射可刺激Drp1 激活,引發(fā)線粒體分裂,但其觸發(fā)的是Ser616 處磷酸化,在Ser637 處未觸發(fā)[13]。Drp1 在Ser637 的GED 結(jié)構(gòu)域內(nèi)的磷酸化可以抑制GTP 酶的活性和線粒體的分裂[14-15]。從機制上講,GTPase 活性的這種變化可能是由于GTP結(jié)合或中間結(jié)構(gòu)域與GED 結(jié)構(gòu)域的相互作用減少所致。因此,Ser637 處的磷酸化導(dǎo)致Drp1 功能和線粒體形態(tài)明顯改變,可能參與細胞線粒體分裂的動態(tài)調(diào)節(jié),但最近研究發(fā)現(xiàn)Drp1 中的Ser637 磷酸化狀態(tài)不是控制Drp1 募集到線粒體的決定因素[16]。此外,Drp1 在Ser585 位點的磷酸化促進有絲分裂細胞的線粒體分裂,外源表達未磷酸化突變體Drp1Ser585 有助于減少線粒體有絲分裂[17]。GSK3beta 通過634-690 殘基與Drp1 結(jié)合,并在GED 結(jié)構(gòu)域中磷酸化Ser693,導(dǎo)致體外GTPase 活性降低,線粒體分裂減少,線粒體形態(tài)延長[18]。

Drp1 的單個磷酸化位點可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)線粒體的分裂和融合的進程,促進或抑制線粒體分裂,這些位點磷酸化的平衡調(diào)控著Drp1 的活性。盡管如此,Drp1 仍是目前研究公認的介導(dǎo)線粒體分裂的最關(guān)鍵蛋白。

2.2.2 Drp1 與泛素化

泛素化即通過泛素-蛋白酶體途徑降解底物,是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控的一個重要方式,在蛋白質(zhì)定位、代謝、功能和降解方面起重要作用。

線粒體外膜存在E3 泛素化連接酶MARCH5(membrane-associated,RING-CH5),它可泛素化Drp1 并調(diào)節(jié)線粒體分裂。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)了有爭議的結(jié)果。首先,MARCH5 與Drp1 相互作用并導(dǎo)致其泛素化和蛋白酶體依賴性降解,從而抑制線粒體過度分裂[19-20]。Karbowski 的小組發(fā)現(xiàn)MARCH5 敲除選擇性地抑制Drp1 的線粒體受體MiD49 的泛素化和蛋白酶體降解,從而導(dǎo)致線粒體斷裂,支持MARCH5 是線粒體分裂的負調(diào)節(jié)因子的可能性[21]。但在其它研究中觀察到了MARCH5 在線粒體分裂中的相反作用,即其對Drp1 呈正向調(diào)節(jié)作用。研究人員發(fā)現(xiàn)MARCH5 突變和MARCH5 RNA 干擾可導(dǎo)致Drp1 在細胞內(nèi)的分布和線粒體結(jié)合的異常,Drp1的異位表達反過來逆轉(zhuǎn)了MARCH5 Ring 突變體誘導(dǎo)的線粒體異常,提示MARCH5 與Drp1 具有很強的功能依賴性[22]。另一項研究中,PARK 等人發(fā)現(xiàn)MARCH5 蛋白低表達的細胞中,線粒體高度互連且拉長。由此,缺乏MARCH5 導(dǎo)致線粒體延伸,其通過阻斷Drp1 活性、促進線粒體中融合相關(guān)蛋白Mfn1 的積累來促進細胞衰老[23]。

哺乳動物細胞線粒體分裂需要MARCH5,它是OMM 上的E3 泛素連接酶,其C-末端結(jié)構(gòu)域在MARCH5 底物的降解中起關(guān)鍵作用,可能是通過促進OMM 中泛素化蛋白的釋放[24]。MARCH5 對其底物尤其是Drp1 的調(diào)控可能存在一些特異性,與修飾位點、結(jié)構(gòu)變化以及是否與Drp1 受體相互作用等有關(guān),并且需要綜合考慮多種信號平臺的參與,包括細胞內(nèi)特異性蛋白表達的變化以及與分裂相關(guān)分子活性的調(diào)節(jié)。

此外,Drp1 被APC/CCdh1(促進相位的復(fù)合物/環(huán)體及其輔激活物Cdh1)E3 泛素連接酶復(fù)合物泛素化時,這種在分裂周期由M 到G1 期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)細胞分裂時G1/S 期線粒體形態(tài)[25]。另一種E3 連接酶Parkin,在穩(wěn)定狀態(tài)下主要定位于胞漿中,也誘導(dǎo)Drp1 的蛋白酶體降解[26],提示Parkin 以Drp1 為底物,在線粒體分裂中起抑制作用。

這些研究表明Drp1 泛素化修飾在線粒體分裂過程中有重要作用,但其具體作用機制仍需進一步研究。

2.2.3 Drp1 與SUMO 化

小泛素相關(guān)修飾物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)是一種類泛素分子,主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用、細胞內(nèi)定位和活性等。SUMO 和泛素修飾同一底物時,SUMO 化通常阻止底物被UPS 降解,有時兩種修飾方式也協(xié)同調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能,即二者既有拮抗作用,也有協(xié)同作用。

研究發(fā)現(xiàn),DRP1 是MAPL(線粒體錨定蛋白連接酶)的底物,MAPL 同時具有泛素連接酶和SUMO連接酶活性,可以通過促進的Drp1SUMO 化顯著提高被募集到線粒體分裂位點上形成的復(fù)合體的穩(wěn)定性,從而增強線粒體分裂[27-28]。SUMO 化的Drp1在功能上穩(wěn)定了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的接觸位點,這些位點與線粒體收縮,鈣離子通道,線粒體嵴重建和細胞色素c 釋放有關(guān)[29]。

2.2.4 Drp1 與亞硝基化

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化是指一氧化氮及其衍生物修飾蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基-SH 生成-SNO,這是一氧化氮發(fā)揮其廣泛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的重要途徑。

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)是一種重要的脫氨?；?研究表明GSNOR 缺乏會促進線粒體亞硝基化應(yīng)激,包括Drp1 和Parkin 的過度S-亞硝基化,從而損害線粒體動力學和線粒體[30]。在分子水平上,也有報道稱Drp1 在受到NO 的S-亞硝基化作用時可以呈活性形式,從而導(dǎo)致線粒體過度分裂并引起神經(jīng)毒性[31]。MAP1B-LC1(亞硝化微管相關(guān)蛋白1B-輕鏈1)被鑒定為MARCH5 的結(jié)合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)MARCH5 特異性識別并誘導(dǎo)S-亞硝基化修飾的MAP1B-LC1 的降解[32],這表明MARCH5 具有選擇性識別其底物并部分地通過降解活性Drp1 和MAP1B-LC1 來防止線粒體動力學失衡的作用。

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化對細胞生存的作用需要結(jié)合其在組織中的位置結(jié)構(gòu)、功能水平和生理階段等綜合效應(yīng),但目前研究表明Drp1 亞硝基化對細胞的損害與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。

3 Drp1 與AD

蛋白組學分析證明了退行性疾病與全身變化有關(guān),其中包括線粒體功能障礙,能量減少和氧化應(yīng)激等[5]。Drp1 廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),進一步的觀察表明,Drp1 在抑制性神經(jīng)元中高度異質(zhì)表達。在透射電鏡下,Drp1 在樹突中的分布高于神經(jīng)元中的其他區(qū)域,并且只有少量的Drp1 位于線粒體中[33]。在應(yīng)激狀態(tài)下,胞漿內(nèi)的Drp1 以多種形式修飾后,活性發(fā)生改變,導(dǎo)致其聚集在線粒體外膜,進一步引起線粒體分裂。

3.1 Drp1 介導(dǎo)的線粒體分裂與AD

研究認為,Drp1 高表達引起的線粒體分裂增多及碎片化與AD 病理高度相關(guān)。研究人員從患有早老素1(PS1)突變患者的外周血中分離出單核細胞,其衍生的神經(jīng)元中,融合相關(guān)蛋白Mfn1 顯著減少,而DRP1 增加[34]。AD 小鼠體內(nèi)實驗證明,認知功能下降與Drp1 的過度活化相關(guān)[35]。

由于線粒體過度分裂與AD 等神經(jīng)退行性疾病相關(guān),因此調(diào)控線粒體分裂有望成為一種新的治療策略。但與期望結(jié)果不同,Drp1 敲低雖然減少了線粒體碎片化,但不能提高細胞生存能力或線粒體功能。因此,糾正線粒體形態(tài)或分布無法恢復(fù)其生物能效率,神經(jīng)元仍無法恢復(fù)健康狀態(tài)[36]。

化合物Mdivi-1 是目前公認的Drp1 抑制劑,可直接減少線粒體片段化[37]。動物實驗證明,Mdivi-1 預(yù)處理可防止Drp1 依賴性的過度線粒體分裂,減輕神經(jīng)細胞凋亡和突觸損傷,并改善長期認知功能[38]。而對Mdivi-1 作用機制的研究表明,慢病毒低表達Drp1 不能降低NMDA 誘導(dǎo)的線粒體分裂和毒性。因此Mdivi-1 對細胞的保護作用可能不依賴于Drp1,而主要通過調(diào)節(jié)線粒體功能和細胞內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)來防止NMDA 受體介導(dǎo)的興奮性毒性[39]。

雖然如此,但值得思考的是,抑制Drp1 的表達是否對挽救AD 病程起至關(guān)重要的作用。最近的研究表明,細胞損傷時,鈣離子流入和Drp1 介導(dǎo)的損傷部位線粒體快速分裂有助于極化修復(fù)反應(yīng)。顯然,線粒體分裂會產(chǎn)生細胞存活所需的局部信號[40]。功能紊亂的線粒體積累與衰老有關(guān),但線粒體分裂對衰老過程的影響需要更深入的研究。于果蠅體內(nèi)的研究顯示上調(diào)Drp1 可促進線粒體分裂,延長果蠅壽命和健康期[41]。Drp1 通過mRNA 剪接可產(chǎn)生多種亞型,其中Drp1ABCD 亞型富含樹突棘,并且其作用獨立于線粒體分裂,調(diào)節(jié)突觸后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、神經(jīng)元形態(tài)和功能[42]。Drp1的外源表達降低了Aβ 轉(zhuǎn)基因果蠅大腦中的ATP 水平,并抑制了神經(jīng)元變性,這是通過保護線粒體功能實現(xiàn)的,提示Drp1 可能是AD 的潛在治療策略[43]。

3.2 Drp1 與AD 病理產(chǎn)物

AD 的病因和發(fā)病機制尚未明確,目前有許多假說,包括線粒體功能障礙、β 淀粉樣斑塊沉積、tau蛋白學說、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、自噬等,其中線粒體動力學改變尤其是Drp1 的表達與AD 病理產(chǎn)物相互影響逐漸備受關(guān)注。

AD 病理產(chǎn)物主要包括Aβ 沉積和異常磷酸化的tau 蛋白。Aβ-42通過靶向線粒體誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,包括促進線粒體分裂,破壞線粒體膜電位,增加細胞內(nèi)ROS 水平和激活線粒體自噬過程等[44]。Drp1 是細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)的直接靶標,并且Cdk5 介導(dǎo)的Drp1 在Ser579 的磷酸化,調(diào)節(jié)Aβ1-42誘導(dǎo)的線粒體分裂和神經(jīng)元毒性[45]。Aβ 通過Akt 的持續(xù)磷酸化直接激活Drp1 并通過mTOR 途徑抑制自噬。這些變化共同引起大量線粒體斷裂,導(dǎo)致ROS 介導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡[46]。細胞實驗證明,反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞中線粒體分裂和融合的多態(tài)性調(diào)節(jié)是由炎癥條件下的獨特信號介導(dǎo)的,并通過產(chǎn)生ROS 來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞表型[47]。

tau 對肌動蛋白的穩(wěn)定作用對于蛋白質(zhì)的神經(jīng)毒性至關(guān)重要,研究表明肌動蛋白介導(dǎo)的線粒體動力學破壞是體內(nèi)神經(jīng)元tau 毒性的直接機制[48]。而對AD 患者以及AD 轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中的GTPase 活性檢測表明,線粒體分裂相關(guān)的GTP 酶活性顯著升高,其對于線粒體片段化至關(guān)重要。Drp1、Aβ 與異常磷酸化tau 相互作用可能加劇線粒體過度斷裂,線粒體功能異常和突觸缺乏,最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和認知能力下降[49]。

這種Drp1 參與的線粒體動力學改變和非局限于線粒體的病理改變,在AD 病程中起重要作用。因此針對抑制Drp1,Aβ 和tau 表達的治療可能會降低其相互作用,從而保護神經(jīng)元免受過量Drp1,Aβ和異常磷酸化tau 的毒性傷害。

4 結(jié)語

Drp1 的表達與調(diào)控影響線粒體動力學平衡,異常的線粒體分裂導(dǎo)致線粒體從管狀形態(tài)碎片化,相反,線粒體的過度分裂導(dǎo)致相鄰線粒體融合。Drp1通過介導(dǎo)哺乳動物的線粒體分裂過程影響細胞存活和凋亡,其功能可能在很大程度上超出線粒體分裂。

因此,筆者認為Drp1 的表達與功能需結(jié)合環(huán)境因素、生物體的生理病理狀態(tài)、多種胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及作用途徑綜合研究。目前研究對Drp1 對線粒體分裂的作用尚不完全明確,不能單面評估其對細胞、疾病乃至整個生命體的作用。我們希望Drp1 與線粒體之間的關(guān)系可能對AD 的研究和臨床治療具有指導(dǎo)意義,但是在體內(nèi)和體外闡明這種關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)機制后,它才能為治療線粒體分裂相關(guān)疾病樹立一個里程碑。