雞原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

鄒嫻，何燕華，何靜怡，王艷，舒鼎銘，羅成龍

技術(shù)與方法

雞原始生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

鄒嫻，何燕華，何靜怡，王艷，舒鼎銘，羅成龍

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

為獲得雞原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells, PGCs)的最佳轉(zhuǎn)染效率，本研究比較不同質(zhì)粒用量和不同細(xì)胞數(shù)在3種轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000、3000和LTX & Plus Reagent)中PGCs的轉(zhuǎn)染效率，利用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting technology, FACS)輔助優(yōu)化Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，經(jīng)FACS進(jìn)一步分選獲得帶綠色熒光蛋白(GFP)的PGCs，繼續(xù)培養(yǎng)3周后，移植回注到受體雞胚中，移植3.5 d后分離性腺拍照觀察。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000的轉(zhuǎn)染效率最高，質(zhì)粒、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑和PGCs細(xì)胞數(shù)的配比為3 μg: 4 μL: 0.5×104個(gè)，轉(zhuǎn)染5 h轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)到23.4%，與現(xiàn)有的研究結(jié)果相比提高了2倍以上。移植回注PGCs到受體雞胚中，熒光顯微鏡觀察到雞胚性腺中有GFP陽性細(xì)胞。本研究綜合考慮轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒用量和細(xì)胞數(shù)量的影響因素以優(yōu)化PGCs的轉(zhuǎn)染條件，為高效制備轉(zhuǎn)基因雞及基因編輯雞的研究奠定基礎(chǔ)。

雞；原始生殖細(xì)胞；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；脂質(zhì)體

雞()已被廣泛用于早期胚胎發(fā)生、毒理學(xué)和干細(xì)胞等研究，特別是鳥類轉(zhuǎn)基因和基因組編輯研究[1,2]。原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)是精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞的祖先細(xì)胞，能將遺傳信息傳遞給下一代。雞PGCs經(jīng)過體外培養(yǎng)及基因修飾后，仍保持其生物學(xué)特性，移植回注到雞胚血脈系統(tǒng)后可遷移到性腺并發(fā)育成功能性配子，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代[3]。近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，使基因編輯鳥類模型成為可能，包括將LOXP位點(diǎn)導(dǎo)入雞IgH位點(diǎn)、靶向卵球蛋白基因、標(biāo)記基因插入Z染色體和抗J亞型禽白血病雞模型[4~7]。但是，在利用雞PGCs為載體進(jìn)行基因操作過程中，需經(jīng)歷基因克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、PGCs移植等步驟，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)則是此過程中的重要環(huán)節(jié)。目前雞PGCs轉(zhuǎn)染技術(shù)主要有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、腺病毒或慢病毒轉(zhuǎn)染和電轉(zhuǎn)染，其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)因其安全、操作簡便、成本低而應(yīng)用較多。但雞PGCs脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較低(約5%~10%)[8]，限制了其應(yīng)用。本研究以雞PGCs為模型，用3種不同脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine 2000、3000和 LTX & Plus Reagent)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，摸索質(zhì)粒濃度、轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物配比以及細(xì)胞數(shù)量等，分析轉(zhuǎn)染效率，旨在優(yōu)化脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)的PGCs轉(zhuǎn)染條件。

1 材料與方法

1.1 材料

種蛋為惠陽胡須雞種蛋，來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所原種雞場。在Rcom PRO 50孵化箱(Rutoex)中38.5℃、相對濕度60%孵化至所需日齡。Bac轉(zhuǎn)座子和mPB轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；pPB-GFP轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，內(nèi)含由pGK啟動(dòng)子啟動(dòng)雙基因和表達(dá)的片段(圖1)。

圖1 pPB-GFP質(zhì)粒圖譜

1.2 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

從孵育至5.5 d的惠陽胡須雞胚性腺分離獲得PGCs，然后接種至經(jīng)鈷源處理的BRL飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件37℃、5% CO2。PGCs培養(yǎng)液中含56% KO-DMEM、30% BRL培養(yǎng)液、7.5%胎牛血清(FBS)、2.5%雞血清、1×GS非必需氨基酸、1×GlutaMAXTM、1×雙抗(青霉素和鏈霉素)、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhFGF)、人干細(xì)胞因子(human SCF)。細(xì)胞每2 d進(jìn)行半量換液，每3~4 d傳代1次。從孵育至5.5 d的惠陽胡須雞胚分離獲得胎兒成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblasts，CEF)，培養(yǎng)箱條件為39℃、5% CO2，培養(yǎng)液中含89% DMEM、10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)。

1.3 qRT-PCR驗(yàn)證分析

利用qRT-PCR驗(yàn)證多能性基因、、和在PGCs和CEF中的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增體系為10 μL，包括5 μL SYBR? Green Master Mix，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA 和3 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：95℃ 1 min；95℃ 30 s，54~58℃ 30 s，72℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)。參考NCBI中雞相關(guān)基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，作為內(nèi)參基因，由Sangon Biotech公司合成，引物信息見表1。

表1 用于qRT-PCR檢測的基因引物

1.4 免疫熒光檢測PGCs特征

PGCs鋪到有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制作細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛室溫固定10~15 min，然后Tris base緩沖液(TBS)洗凈；加入適量0.1% TritonX-100，室溫破膜10 min后TBS緩沖液洗凈；10%驢血清室溫孵育20 min；甩去血清，滴加一抗工作液，4℃過夜；次日從4℃冰箱拿出，復(fù)溫15 min，TBS緩沖液洗凈，每張切片滴加50 μL熒光二抗(稀釋比均為1∶400)，37℃孵育30 min，TBS緩沖液洗凈(此步驟開始進(jìn)行避光)；甩去TBS，每張切片滴加50 μL新鮮配置的DAPI (稀釋比為1∶500)，進(jìn)行熒光染核，室溫孵育10 min，TBS沖洗3次，每次5 min；甩去TBS，用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片，避光保存于4℃，在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組與帶綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

前期我們在DF1細(xì)胞(雞胚成纖維細(xì)胞系)中研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒pPB-GFP與轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒mPB的比例為3~4∶1時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。因此，本研究選擇二者比例為3∶1，在PGCs中進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

轉(zhuǎn)染前將PGCs轉(zhuǎn)移到24孔板中，每孔接種103個(gè)PGCs。將PGCs隨機(jī)分組，即Lipofectamine 2000 (添加質(zhì)粒和Lipofectamine 2000，用A表示)、Lipofectamine 3000 (添加質(zhì)粒和Lipofectamine 3000，用B表示)和Lipofectamine LTX & Plus Reagent(添加質(zhì)粒和Lipofectamine LTX & Plus Reagent，用C表示)。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書做如下分組：A組依質(zhì)粒劑量及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000劑量分為A1 (1 μg: 2 μL)、A2 (3 μg: 2 μL)、A3 (5 μg: 3 μL)和A4 (6 μg: 4 μL)；B組依質(zhì)粒劑量及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000劑量分為B1(1 μg: 2 μL)、B2(1.5 μg: 3 μL)、B3 (3 μg: 4 μL)和B4(5 μg: 6 μL)；C組依質(zhì)粒劑量及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine LTX劑量分為C1 (1 μg: 1 μL)、C2 (2 μg: 2 μL)、C3 (3 μg: 2 μL)和C4 (5 μg: 3 μL)。每小組3個(gè)重復(fù)。然后按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后收集細(xì)胞，離心，重懸后接種到新的飼養(yǎng)層上，加入新鮮PGCs培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡照相并分析。

篩選出較高轉(zhuǎn)染效率的組別后，提高細(xì)胞密度至0.3×104個(gè)/孔或0.5×104個(gè)/孔，減少轉(zhuǎn)染時(shí)間至5 h，并用含有血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分選穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白的PGCs

將細(xì)胞接種到T25培養(yǎng)皿中，脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染GFP蛋白質(zhì)粒。同時(shí)以轉(zhuǎn)染GFP蛋白質(zhì)粒的DF1細(xì)胞作為陽性對照，以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的DF1細(xì)胞作為陰性對照進(jìn)行流式細(xì)胞分選。上機(jī)分選前，制備無菌操作液清洗流式細(xì)胞儀(BD FACSAriaII)。分別收集PGCs和DF1細(xì)胞到15 mL離心管中，并用PBS懸浮細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)要大于106個(gè)/mL。分別用陽性和陰性對照DF1細(xì)胞設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍，再進(jìn)行PGCs分選。

1.7 陽性PGCs移植受體雞及性腺分離

將PGCs培養(yǎng)液收集到15 mL離心管中，常溫離心，用PBS洗一次，常溫離心，之后加入適量的PBS懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取所需細(xì)胞數(shù)，加PBS至總體積的90%，然后加入10%臺(tái)盼藍(lán)，混勻。取2~2.5日齡雞胚，雞蛋尖端處開殼0.5~1 cm，在體視顯微鏡下找到雞胚背主動(dòng)脈，針斜面向下，沿著血流方向輕輕吹入1~3 μL含有PGCs的溶液，溶液中PGCs總量約為2000個(gè)。在開口周圍涂上蛋清，用膜封好開口，待蛋清干了之后，放入孵化箱繼續(xù)孵化。

移植注射3.5 d后取出活胚，在體視顯微鏡下用鑷子分離雞胚性腺，置于滴有80 μL PBS的載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)處理

熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每孔綠色熒光PGCs數(shù)量，數(shù)據(jù)用JMP 8.0 (SAS Institute, Cary, NC)統(tǒng)計(jì)軟件檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析(<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGCs分離培養(yǎng)

本研究共分離40只雞胚，其中有10個(gè)雄性PGCs在第3周結(jié)束之前細(xì)胞數(shù)達(dá)到5.0×104，被認(rèn)為已成功建立了品系。這10個(gè)PGCs品系均來自單個(gè)胚胎。這些細(xì)胞呈圓形、邊緣光亮、體積較大、細(xì)胞核大等形態(tài)特征，通常能看到細(xì)胞兩個(gè)連在一起或成串，符合PGCs的形態(tài)特征(圖2A)。PGCs培養(yǎng)60 d后，qRT-PCR檢測生殖細(xì)胞標(biāo)記基因、、和，結(jié)果表明，它們在PGCs中表達(dá)量高，在CEF中表達(dá)量極低(圖2B)，表明本研究分離的PGCs具有多能性。同時(shí)，通過免疫熒光法檢測到幾乎所有PGCs均表達(dá)了生殖細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白SSEA-1和DAZL (圖2：C~F)。

2.2 PGCs轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

用3種不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染攜帶GFP蛋白的Bac轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒。結(jié)果表明，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑中B3陽性細(xì)胞數(shù)最多，高于所有組別；其次是Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑B2，第三是Lipofectamine LTX & Plus Reagent轉(zhuǎn)染試劑C3 (表2)。實(shí)驗(yàn)過程中還觀察到Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑組以及其他兩種試劑的高濃度組B4和C4對PGCs傷害較大，48 h后觀察到大量PGCs死亡。在B3轉(zhuǎn)染條件基礎(chǔ)上，提高每孔中PGCs細(xì)胞數(shù)量到0.5×104，并減少轉(zhuǎn)染時(shí)間至5 h，同時(shí)加入含有血清培養(yǎng)基，48 h后，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞數(shù)更多，每孔陽性細(xì)胞數(shù)超過了1000個(gè)。初步判斷此條件下PGCs轉(zhuǎn)染效率更佳(命名為D1)，即質(zhì)粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細(xì)胞數(shù)0.5×104的配比。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白PGCs細(xì)胞株的獲得

為了確定最佳轉(zhuǎn)染條件，根據(jù)B3轉(zhuǎn)染條件和D1轉(zhuǎn)染條件分別轉(zhuǎn)染PGCs細(xì)胞，72 h后，利用基因表達(dá)綠色熒光蛋白，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行陽性細(xì)胞分選。以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的DF1細(xì)胞作為陰性對照、轉(zhuǎn)染GFP蛋白質(zhì)粒的DF1細(xì)胞作為陽性對照。圖3可知，DF1陰性對照組中陽性細(xì)胞比例為0% (圖3A)，DF1陽性對照組中陽性細(xì)胞比例為46.2% (圖3B)，B3轉(zhuǎn)染條件下陽性PGCs比例為12.7% (圖3C)，D1轉(zhuǎn)染條件下陽性PGCs比例為23.4% (圖3D)。

將流式細(xì)胞儀分選后的PGCs接種到24孔板繼續(xù)培養(yǎng)，狀態(tài)良好(圖4)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行傳代。

圖2 PGCs的分離培養(yǎng)

A：PGCs體外培養(yǎng)3周后的形態(tài)特征；B：qRT-PCR檢測、、和基因在PGCs和CEF中表達(dá)情況；C：PGCs中生殖細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白SSEA-1(綠色熒光)、DAZL蛋白(紅色熒光)的表達(dá)；D：PGCs核染色；E ：PGCs中生殖細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白SSEA-1蛋白；F：PGCs中生殖細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白DAZL蛋白。

表2 不同轉(zhuǎn)染試劑和不同劑量GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PGCs后48 h的陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/孔)

同一列不同字母表示差異顯著(<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞儀分選陽性PGCs

A：未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的陰性DF1細(xì)胞分選結(jié)果；B：轉(zhuǎn)染了GFP蛋白質(zhì)粒的DF1細(xì)胞分選結(jié)果；C：B3轉(zhuǎn)染條件下陽性PGCs分選結(jié)果；D：D1轉(zhuǎn)染條件下陽性PGCs分選結(jié)果。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的PGCs

A：白光視野；B：綠色熒光視野。由于雞PGCs是懸浮細(xì)胞，無法固定，會(huì)漂來漂去，導(dǎo)致PGCs并不總在同一平面或同一位置，因此綠色熒光視野下拍攝的PGCs熒光有強(qiáng)有弱，A和B圖并不能完全匹配上。

2.4 雞早期胚胎注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞

陽性PGCs培養(yǎng)3周后，大量細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)GFP蛋白，表明基因已穩(wěn)定整合到PGCs中。把它們注射到2~2.5胚齡的100只受體雞胚中，繼續(xù)孵化至5.5~6胚齡，分離性腺，在熒光顯微鏡下觀察到有2只雞胚性腺表達(dá)綠色熒光蛋白(圖5)，表明本研究分離、篩選的PGCs能夠在受體雞中繼續(xù)發(fā)育?？紤]到此次注射的PGCs在體外培養(yǎng)時(shí)間較長(約200 d)，本文重新分離PGCs并轉(zhuǎn)染pPB-GFP質(zhì)粒，流式細(xì)胞術(shù)分選陽性PGCs，繼續(xù)培養(yǎng)3周后注射到200只雞胚中，隨機(jī)取了15枚，熒光顯微鏡下觀察到5枚雞胚性腺表達(dá)綠色熒光蛋白。經(jīng)PCR鑒定性腺中基因表達(dá)情況，結(jié)果表明陽性性腺中可以檢測到基因的表達(dá)，而陰性性腺則無法檢測到(圖5E)。

3 討論

雞肉是人類最重要的食物來源之一，也是用于生產(chǎn)藥用蛋白的生物反應(yīng)器[9]。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，雞胚胎作為發(fā)育和細(xì)胞生物學(xué)的模型有了更多的機(jī)遇，但鳥類在基因組編輯技術(shù)方面一直落后于哺乳動(dòng)物[1,10,11]。本研究旨在探究提高雞PGCs轉(zhuǎn)染效率的方法，為家禽基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究利用Bac轉(zhuǎn)座子，比較了3種不同轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率最高達(dá)到了23.4%，PGCs回注到雞胚血液中，獲得了表達(dá)GFP蛋白的雞胚。Macdonald等[12]利用Bac及Tol2轉(zhuǎn)座子有效轉(zhuǎn)染PGCs后回注到雞胚血脈系統(tǒng)，獲得表達(dá)GFP蛋白的轉(zhuǎn)基因雞，Bac的轉(zhuǎn)染效率為10.5%。陳美娟等[8]利用Bac轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染PGCs后回注到雞胚血脈系統(tǒng)，獲得表達(dá)GFP蛋白的雞胚，轉(zhuǎn)染效率最高為6.16%。由此可知，本研究中PGCs的轉(zhuǎn)染效率高于上述研究結(jié)果，篩選出的陽性PGCs可以在受體雞胚中繼續(xù)發(fā)育，為后續(xù)開展基因編輯雞的研究奠定了良好基礎(chǔ)。

圖5 含有表達(dá)綠色熒光蛋白PGCs的雞胚性腺

A：陰性雞胚性腺(白光視野)；B：陰性雞胚性腺(綠色熒光視野)；C：陽性雞胚性腺(白光視野)；D：陽性雞胚性腺(綠色熒光視野)；E：PCR鑒定陽性性腺。泳道1和2為表達(dá)GFP蛋白的性腺，3和4為注射了陽性PGCs但不表達(dá)GFP蛋白的性腺，5和6為未注射陽性PGCs的性腺，M為DL2000 Marker。

本研究用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染PGCs，比較轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細(xì)胞數(shù)104的配比時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。據(jù)報(bào)道，在一定范圍內(nèi), 質(zhì)粒用量和轉(zhuǎn)染效率成正比，但當(dāng)DNA加入過量時(shí)，轉(zhuǎn)染效率反而下降，與本研究結(jié)果一致[13,14]。本研究還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒濃度和轉(zhuǎn)染試劑劑量相同情況下，提高細(xì)胞密度，可以提高轉(zhuǎn)染效率。這可能是由于細(xì)胞密度大，細(xì)胞間空隙較小，質(zhì)粒DNA與細(xì)胞接觸面多，進(jìn)入細(xì)胞的阻力變小，從而提高轉(zhuǎn)染水平。Lipofectamine 3000試劑在操作過程中不需要使用無血清、無雙抗培養(yǎng)基，對PGCs后續(xù)生長影響較小。另外，在PGCs傳代后第2 d、3 d、4 d時(shí)用最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率差異不顯著(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，表明PGCs傳代后第2~4 d均可進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

目前獲得PGCs的方法主要有兩種：一是從孵化2.5 d左右雞胚循環(huán)血液中獲得；二是從孵化5 d左右雞胚性腺中獲得。血液和性腺PGCs的細(xì)胞生長和特性基本沒有差異，均表現(xiàn)出FGF依賴性的生長速率，且兩種方法獲得的PGCs均能在體外培養(yǎng)并進(jìn)行基因修飾后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雞[3,7,15~21]。本研究從孵化5.5 d雞胚性腺中分離培養(yǎng)PGCs。與循環(huán)血液中PGCs相比，使用性腺PGCs的優(yōu)點(diǎn)是可以從一個(gè)胚胎中獲得更多的PGCs，且每個(gè)胚胎都更容易發(fā)育出許多PGCs，更有效地篩選出具有生殖細(xì)胞多能性的PGCs系，以產(chǎn)生胚系嵌合體和轉(zhuǎn)基因雞。

相比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和Lipofectamine LTX & Plus Reagent，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑更適用于轉(zhuǎn)染PGCs，最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件為：質(zhì)粒3 μg、Lipofectamine 3000試劑4 μL和PGCs細(xì)胞數(shù)0.5×104的配比，且可以用有血清有雙抗的培養(yǎng)基。本研究綜合考慮轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒用量和細(xì)胞數(shù)量的影響因素以優(yōu)化PGCs的轉(zhuǎn)染條件，為高效制備轉(zhuǎn)基因雞及基因編輯雞的研究奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of transfection conditions of chicken primordial germ cells

Xian Zou, Yanhua He, Jingyi He, Yan Wang, Dingming Shu, Chenglong Luo

To improve the transfection efficiency of chicken primordial germ cells (PGCs), the present study evaluated the plasmid dosage and cell number on the efficiencies of three transfection reagents (Lipofectamine 2000, 3000 and LTX & Plus Reagent). PGCs was isolated from embryonic gonads of Huiyang bearded chicken. After 60 days of culture, the cells were transfected by using Lipofectamine transfection reagents withBac vectors coding for the green fluorescence protein (GFP). PGCs were passaged in culture and fluorescent cells were screened and selected by flow cytometry at three days after transfection. At three weeks post transfection, about 2000 cells were injected into the stage 16 Hamburger and Hamilton (HH) embryos and incubated until stage 30 HH. The results showed that Lipofectamine 3000 was the best for transfection of PGCs. The highest transfection efficiency of PGCs could be achieved with a combination of 3 μg plasmid, 4 μL Lipofectamine 3000 transfection reagent and 0.5×104PGCs cells. Flow cytometry analysis showed a 23.4% efficiency of stable transfection of PGCs using Lipofectamine 3000 withBac vector, which was improved 2 times or more over current commonly used methods. After reinjecting PGCs into recipient chicken embryos, GFP-positive cells were observed in the gonads of the recipient chicken embryo by fluorescence microscopy. The study comprehensively evaluated the factors of transfection reagents, plasmid dosage and cell number to optimize the transfection of PGCs, thereby providing a foundation for the efficient preparation of transgenic and gene-edited chickens.

chicken; primordial germ cells; stable transfection; Lipofectamine

2020-07-07;

2020-12-21

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2018B030311044)，廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2017B020232003，2019A050505007)，2020年省級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技聯(lián)盟建設(shè)共性關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào)：2020KJ106)，國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家項(xiàng)目(編號(hào)：CARS-41)和科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)資金—高水平農(nóng)科院建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：R2017PY-QY007)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2018B030311044), the Science and Technology Program of Guangdong Province (Nos. 2017B020232003, 2019A050505007), 2020 Provincial Modern Agricultural Science and Technology Alliance Construction of Common Key Technology Innovation Team Project (No. 2020KJ106), the Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (No. CARS41), and Special Fund for Scientific Innovation Strategy-construction of High Level Academy of Agriculture Science (No. R2017PY-QY007)]

鄒嫻，博士，副研究員，研究方向：動(dòng)物種質(zhì)資源保護(hù)、育種與繁殖。E-mail: zouxian08@163.com

舒鼎銘，博士，研究員，研究方向：動(dòng)物種質(zhì)資源保護(hù)與創(chuàng)新利用。E-mail: shudingming@gdaas.cn羅成龍，博士，研究員，研究方向：家禽種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳育種與健康生產(chǎn)。E-mail: chenglongluo1981@163.com

10.16288/j.yczz.20-212

2021/2/1 15:08:18

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210201.1110.005.html

(責(zé)任編委: 姜雨)