海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院腫瘤科,200433 上海
肺癌是中國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤,5年生存率僅19.8%,遠(yuǎn)低于日本的32.9%[1]。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是肺癌中突變頻率最高的可治療靶點(diǎn),亞洲肺腺癌人群總突變率高達(dá)50.2%[2],EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI)應(yīng)用最為廣泛。然而多數(shù)患者仍會(huì)在TKI治療后8~13個(gè)月發(fā)生耐藥[3]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),相同突變亞型的初治患者對(duì)EGFR-TKI的反應(yīng)仍存在較大的個(gè)體差異。通過尋求EGFR-TKI的療效預(yù)測(cè)因子,縮短療效不佳患者的監(jiān)測(cè)隨訪間隔并積極開展一線TKI聯(lián)合治療,可能會(huì)改善這部分患者的療效及預(yù)后。
癌癥是基因相關(guān)性疾病,與正常組織及腫瘤細(xì)胞中的基因突變密切相關(guān)。不同腫瘤患者與不同腫瘤類型中,每種基因突變的頻率都有顯著差別[4]。通過二代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)技術(shù)全面展現(xiàn)突變頻率相關(guān)信息,進(jìn)一步指導(dǎo)精準(zhǔn)治療是近年來的研究熱點(diǎn)。腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden,TMB)是一種新型基因標(biāo)志物,可反映腫瘤基因突變的總體狀況,已廣泛應(yīng)用于免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor,ICI)治療的獲益人群篩選及療效預(yù)測(cè)[5-7],在EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中也有相應(yīng)的探索性研究。本文介紹TMB的主流檢測(cè)方法及其在EGFR突變型晚期NSCLC免疫治療、靶向治療中的應(yīng)用,梳理該領(lǐng)域進(jìn)展、爭(zhēng)議及面臨的挑戰(zhàn)。
TMB是指腫瘤基因外顯子編碼區(qū)每兆堿基(Mb)中發(fā)生置換、插入或缺失突變的總數(shù),通常按每Mb中的非同義突變數(shù)來計(jì)算[8]。腫瘤基因突變主要包括非同義突變、同義突變、插入、缺失或拷貝數(shù)的增加和減少[9]。在細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境的共同作用(如吸煙、紫外線照射等)下,體細(xì)胞突變特征可經(jīng)由mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及翻譯后修飾而留存下來。這些新生肽段由腫瘤異常蛋白(tumor abnormal protein,TAP)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,并與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complex Ⅰ,MHCⅠ)結(jié)合,表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresenting cell,APC)表面。這些新生肽段-MHCⅠ復(fù)合物被稱為新抗原,可以激活CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,從而發(fā)揮T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)[10-11]。綜上,TMB升高,產(chǎn)生新抗原的數(shù)量和頻率會(huì)增加,機(jī)體的免疫原性增強(qiáng)。
WES包含22 000個(gè)基因編碼區(qū),檢測(cè)區(qū)域?yàn)榫幋a區(qū)的錯(cuò)義點(diǎn)突變,測(cè)序長(zhǎng)度為30 Mb,對(duì)外顯子組序列檢測(cè)覆蓋率高。WES最早用于探索TMB在腫瘤患者中的分布。研究[12]發(fā)現(xiàn),黑色素瘤和肺癌的TMB最高,NSCLC是TMB變化范圍最大的癌種,有吸煙史的患者[10.5個(gè)突變(mut)/Mb]中位TMB明顯高于無(wú)吸煙史的患者(0.6 mut/Mb)[13]。但致癌誘因本身并不能完全解釋NSCLC中TMB的多樣性,其他因素如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),以及基因突變?nèi)鏟OLE突變、POLD突變、BRCA突變等,都會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞突變積累[14]。
多項(xiàng)臨床研究應(yīng)用WES探索TMB的臨床應(yīng)用價(jià)值。Rizvi等[14]定義高TMB為每個(gè)外顯子組超過178個(gè)非同義突變,這部分接受帕博利珠單抗(pembrolizumab)治療的NSCLC患者客觀緩解率(overall response rate,ORR)、持續(xù)臨床獲益(durable clinical benefit,DCB)和無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)均有更多獲益。回顧性分析CheckMate-026研究[5]的WES數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),高TMB(≥243 mut/Mb)患者接受納武利尤單抗(nivolumab)治療,臨床獲益顯著優(yōu)于含鉑雙藥化療,美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南[15]據(jù)此將TMB列為預(yù)測(cè)ICI療效的新型生物標(biāo)志物。隨著更多研究反復(fù)證實(shí)WES在TMB檢測(cè)中的地位,美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)于2019年11月批準(zhǔn)了基于WES的體外診斷平臺(tái)Omics Core用于TMB和包含468個(gè)基因的體細(xì)胞突變檢測(cè)(表1),標(biāo)志著WES正式由研究試驗(yàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。
WES成本高、周期長(zhǎng),對(duì)腫瘤組織標(biāo)本大小和腫瘤組織含量要求高,臨床實(shí)踐中難以推廣。而CGP除了以上優(yōu)勢(shì),更重要的是其測(cè)序兼具深度和廣度,標(biāo)本中含有少量片段DNA時(shí)甚至可能提高突變檢測(cè)靈敏度,因此目前臨床更傾向于使用CGP來檢測(cè)TMB[16]。
CGP在反映TMB特征方面不遜色于WES。MSKCC-IMPACT與WES配對(duì)檢測(cè)204例NSCLC患者的TMB值,相關(guān)系數(shù)為0.86[6],100 000例泛瘤種患者的F1CDx與WES檢測(cè)TMB值一致率也高達(dá)95%[4]。目前,美國(guó)FDA已批準(zhǔn)四種NGS試劑盒用于臨床腫瘤診斷(表1)。然而在不同分子檢測(cè)平臺(tái)的CGP中,高TMB的定義仍不盡相同,因其所包含的基因數(shù)量、與腫瘤的關(guān)聯(lián)性、生信分析方式均存在一定差異。因此,統(tǒng)一跨平臺(tái)TMB檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和定義最佳閾值是臨床實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療的必要條件[17]。
表1 美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的NGSTab.1 The types of NGS approved by American FDA for clinic use
CGP確立的TMB=10 mut/Mb已成為臨床實(shí)踐及研究中公認(rèn)的ICI cut-off值。CheckMate 227研究[7]證實(shí),TMB≥10 mut/Mb的同類患者接受免疫聯(lián)合治療效果優(yōu)于化療。Ⅱ期臨床研究KEYNOTE-158[18]中高TMB組(TMB≥10 mut/Mb)數(shù)據(jù)顯示,pembrolizumab后線治療晚期泛瘤種患者的ORR及6、12、24個(gè)月的PFS率均超過低TMB組?;诖藬?shù)據(jù),2020年4月7日美國(guó)FDA授予pembrolizumab后線治療TMB≥10 mut/Mb的泛瘤種患者優(yōu)先評(píng)審資格。
并不是所有CGP都適合評(píng)估TMB,尤其是較小的基因集合(panel)。研究證實(shí),基因組覆蓋率<0.5 Mb的panel評(píng)估的TMB準(zhǔn)確性降低[4]。Endris等[19]將3種CGP panel與WES進(jìn)行對(duì)比也發(fā)現(xiàn),使用>1 Mb的panel來評(píng)估NSCLC患者TMB,檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性均顯著提高,且通過擴(kuò)大同義突變分析的有效區(qū)域也可以提高TMB計(jì)算的精準(zhǔn)度。
部分復(fù)發(fā)或多線治療失敗的晚期肺癌患者難以取得活檢組織,常令使進(jìn)一步診斷及精準(zhǔn)治療陷入困境。因此,基于外周血循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)的TMB,即bTMB檢測(cè)成為近年來研究的熱點(diǎn)。
POPLAR和OAK研究[20]中,同一患者的bTMB和腫瘤TMB(tumor-based TMB,tTMB)的匹配度高,Spearman相關(guān)系數(shù)為0.6 4。B-F1RST研究[21]則發(fā)現(xiàn),cut-off值為16時(shí),共152例接受阿替利珠單抗(atezolizumab)一線治療的NSCLC患者中,高bTMB組ORR顯著更優(yōu),但bTMB未能有效預(yù)測(cè)PFS及總生存期(overall survival,OS)的獲益。Wang等[22]發(fā)現(xiàn),中國(guó)人群隊(duì)列bTMB的cut-off值為7時(shí),高ctDNA突變豐度(≥5%)的患者接受免疫治療的ORR、PFS及OS均顯著優(yōu)于低豐度的患者。
雖然有研究初步揭示了ctDNA含量為影響bTMB預(yù)測(cè)效能的潛在因素,但bTMB檢測(cè)手段與算法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。如腫瘤釋放入血的ctDNA等位基因突變頻率需≥1%,方可有效評(píng)估bTMB。ctDNA含量與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān),最大體細(xì)胞等位基因突變頻率(maximum somatic allele frequency,MSAF)≥1%的患者,其基線病灶最長(zhǎng)直徑大于MSAF<1%的患者[20]。
TMB在可靶向驅(qū)動(dòng)基因突變[EGFR突變型、間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合等]時(shí)顯著降低[23],主要原因是強(qiáng)勢(shì)驅(qū)動(dòng)基因突變抑制其他非同義突變發(fā)生。海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院腫瘤科臧遠(yuǎn)勝教授團(tuán)隊(duì)[24]對(duì)953例中國(guó)泛瘤種患者的WES數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),EGFR突變型患者中位TMB低于野生型(74個(gè)非同義突變vs113個(gè)非同義突變,P=0.003 9)。該團(tuán)隊(duì)[25]進(jìn)一步分析了1 668例歐美及292例亞洲晚期肺腺癌人群的TMB分布,總體TMB分別為6.66和4.80 mut/Mb,且野生型TMB均顯著高于各突變亞型。
EGFR突變各亞型中TMB分布也有差異。Offin等[26]分析了153例EGFR經(jīng)典突變患者的TMB分布,發(fā)現(xiàn)19del低于21 L858R(P=0.003),另一項(xiàng)研究[27]也發(fā)現(xiàn),19del突變患者TMB水平低于L858R突變患者(P<0.001),且19del與20ins及L861Q突變的TMB水平相似(P=0.35),G719X突變患者TMB水平高于19del突變患者(P<0.001)。還有研究[26]發(fā)現(xiàn),繼發(fā)性耐藥患者中,T790M陰性患者TMB在數(shù)值上高于T790M突變患者(P=0.057),這也為T790M陰性耐藥患者使用ICI治療提供了新的依據(jù)。
Offin等[26]對(duì)比了30例患者靶向治療前和耐藥后的TMB值,發(fā)現(xiàn)耐藥后TMB顯著升高(3.42 mut/Mbvs6.56 mut/Mb,P=0.000 2),但此結(jié)果尚不能成為EGFR-TKI耐藥患者ICI治療有效的理論依據(jù)。研究者認(rèn)為,TMB值升高是因?yàn)樵赥KI治療的選擇性壓力下出現(xiàn)的亞克隆多樣性增加,但這并不能使有效的免疫抗原相應(yīng)增加,故免疫治療仍不是最優(yōu)選擇。
3.2.1 預(yù)測(cè)EGFR-TKI治療效果
Offin等[26]首次證實(shí),TMB與EGFR-TKI治療EGFR突變型NSCLC患者的臨床獲益呈負(fù)相關(guān),研究納入了153例晚期EGFR經(jīng)典突變(19del和L858R)的NSCLC患者,這些患者均一線接受一/二代EGFR-TKI治療。MSK-IMPACT用于評(píng)估治療前與耐藥后的TMB,并按三分位數(shù)(2.83,4.85)分為高、中、低TMB3組,生存分析顯示,TMB與EGFR-TKI療效及EGFR突變型患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),高TMB組的治療終止時(shí)間(time to treatment discontinuation,TTD)和OS顯著短于中、低TMB組。高、中、低TMB3組TTD和OS分別為17、16、10個(gè)月(P=0.000 3)和40.6、37.3、20.6個(gè)月(P=0.02)。多變量分析顯示,中、低TMB組的TTD和OS優(yōu)勢(shì)在TP53突變狀態(tài)和EGFR突變亞型(19del和L858R)中同樣顯著。
作為第一項(xiàng)探索TMB預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效的研究,Offin等[26]的研究在設(shè)計(jì)方面仍有值得探討的地方。首先,該研究定義高TMB值(4.85 mut/Mb)是低于既往研究的。同樣使用MSK-IMPACT,Rizvi等[6]分析84例晚期NSCLC患者的免疫治療效果,定義高TMB為>7.4 mut/Mbo。另一種NGS panel F1CDx檢測(cè)EGFR/ALK陰性NSCLC,定義>10 mut/Mb為高TMB[7]。其次,153例患者僅有36個(gè)TMB值,很可能是因?yàn)镋GFR突變型患者TMB絕對(duì)值較低,TMB值間隔不大。另外,研究者考慮到緩慢進(jìn)展時(shí)仍可繼續(xù)使用EGFR-TKI治療,實(shí)際用藥時(shí)間多超過PFS,故用TTD替代PFS及ORR,而不是在評(píng)估藥物療效方面更有說服力的PFS。研究者也只納入了隨訪數(shù)據(jù)更完整的一/二代EGFR-TKI治療的患者。隨著奧希替尼一線適應(yīng)證的獲批,更多的研究將會(huì)證實(shí)TMB在三代EGFR-TKI中的療效預(yù)測(cè)作用。
海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院腫瘤科臧遠(yuǎn)勝教授團(tuán)隊(duì)[25]篩選癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中289例EGFR突變型NSCLC患者,分析了TMB與預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果表明,將患者按TMB中位數(shù)(3.37)、三分位數(shù)(2.83,5.10)及四分位數(shù)(2.83,3.77,6.12)劃分組別來進(jìn)行生存分析,TMB最高組的中位OS分別24.03、21.27及21.27個(gè)月,均為最短(P=0.002,P=0.0135,P=0.018),通過更細(xì)致的劃分TMB,再次證實(shí),高TMB是EGFR突變型晚期肺腺癌的不良預(yù)后因素,研究還發(fā)現(xiàn),按中位TMB與TP53是否突變將患者分為4組,高TMB及TP53突變組的EGFR突變型肺腺癌患者OS最短(P=0.000 9),TMB聯(lián)合TP53可作為EGFR突變型晚期肺腺癌患者的預(yù)后標(biāo)志物。然而,該研究的OS數(shù)據(jù)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),無(wú)法獲得確診時(shí)間、治療方案等臨床細(xì)節(jié)。另一方面,該研究雖然納入了燃石數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)人群的TMB數(shù)據(jù),但多數(shù)患者隨訪數(shù)據(jù)不成熟,未能明確TMB對(duì)中國(guó)人群接受EGFR-TKI治療的效果及預(yù)后預(yù)測(cè)作用。
為探究中國(guó)人群TMB與靶向治療效果的關(guān)系,童琳等[28]納入了3年間51例敏感驅(qū)動(dòng)突變且接受小分子TKI治療的晚期NSCLC患者,進(jìn)行組織標(biāo)本的panel測(cè)序,并同樣按三分位數(shù)將患者分為高TMB與中低TMB兩組。分析發(fā)現(xiàn),高TMB組患者中位PFS顯著短于中低TMB(410 dvs217 d,HR=0.331,95% CI:0.165~0.665,P=0.001 2),EGFR突變型亞組(n=42)中也得到了相似結(jié)果(410 dvs189 d,HR=0.256,95%CI:0.108~0.608,P=0.002)。入組患者的治療藥物包含了一、二代EGFR-TKI及克唑替尼,并以PFS作為研究終點(diǎn),結(jié)論更貼近真實(shí)世界情況,但該研究仍存在樣本量較少、缺乏OS數(shù)據(jù)及非前瞻性研究的缺陷。
隨著CGP的進(jìn)一步推廣,針對(duì)中國(guó)人群更大規(guī)模的回顧性研究數(shù)據(jù)于近期發(fā)布。利用包含425個(gè)熱點(diǎn)基因的CGP panel,Lin等[29]評(píng)估了98例一線接受EGFR-TKI治療患者的TMB分布,同樣是按三分位數(shù)(3.4,5.7)分析,該研究發(fā)現(xiàn),低TMB組ORR顯著高于中、高TMB組(53.8%、23.0%、8.3%,P=0.037),且3組PFS分別為16.4、9.0、7.4個(gè)月(P=0.006)。PFS相關(guān)影響因素的亞組分析顯示,低TMB組的19del、TP53突變及年輕患者,比中、高TMB組更容易在PFS方面獲益(P=0.02)。為使結(jié)論更加嚴(yán)謹(jǐn),該研究還設(shè)計(jì)了多因素分析以排除其他臨床因素對(duì)PFS的影響,發(fā)現(xiàn)性別、年齡、吸煙史、EGFR突變亞型及TP53突變狀態(tài)均與PFS無(wú)關(guān),強(qiáng)調(diào)了TMB是PFS的獨(dú)立預(yù)后因素的結(jié)論。
回顧性研究反復(fù)證實(shí),TMB是預(yù)測(cè)EGFR突變型晚期NSCLC療效及預(yù)后的有效標(biāo)志物。然而,不同NGS panel覆蓋的不同基因位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致TMB分布的多樣性,很難定義廣泛適用的cutoff值。目前,仍需要前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證在EGFR突變型和其他敏感驅(qū)動(dòng)基因突變的NSCLC中,TMB作為預(yù)后生物標(biāo)志物的前景。
3.2.2 預(yù)測(cè)免疫治療效果
作為優(yōu)勢(shì)驅(qū)動(dòng)基因,EGFR突變型患者在免疫治療中總體獲益不大,這與EGFR突變型患者腫瘤微環(huán)境的弱免疫原性、TMB低水平的特征有關(guān)[30]。CheckMate 057、KEYNOTE-010和POPLAR研究的meta分析[31]顯示,程序性死亡[蛋白]-1(programmed death-1,PD-1)/程序性死亡[蛋白]配體-1(programmed death ligand-1,PD-L1)抑制劑對(duì)比多西他賽二線治療能顯著延長(zhǎng)總體患者(n=1 903,HR=0.68,95% CI:0.61~0.77,P<0.000 1)和EGFR野生型患者(n=1 362,HR=0.66,95% CI:0.58~0.76,P<0.000 1)的OS,但在EGFR突變型患者中OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=186,HR=1.05,95%CI:0.70~1.55,P<0.81)。臨床前研究[32]顯示,約20 000個(gè)黑色素瘤樣本中發(fā)現(xiàn)的20種新抗原只有8%的新抗原來自驅(qū)動(dòng)基因突變,另外92%的新抗原全部來自非驅(qū)動(dòng)基因突變。而新抗原的產(chǎn)生與TMB密切相關(guān),是激活特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)的重要介質(zhì),這也是驅(qū)動(dòng)基因突變腫瘤患者免疫治療效果不佳的重要原因之一。
也有一些研究探討了EGFR突變型患者后線免疫治療的可能性,并提出TMB高表達(dá)是生存獲益的潛在機(jī)制。一項(xiàng)日本的研究[33]探索EGFRTKI耐藥后nivolumab的療效,亞組分析顯示,9例接受WES評(píng)估TMB值的患者中,有應(yīng)答的3例TMB值顯著高于無(wú)應(yīng)答的6例(P=0.038),由此推測(cè)高TMB很可能是nivolumab獲益的原因。但因樣本量較小,未發(fā)現(xiàn)TMB在T790M突變與陰性患者中的差異(P=0.71)。另一項(xiàng)日本的單中心分析[34]納入了24例經(jīng)nivolumab治療的EGFR突變型患者,單變量分析表明,高布林克曼指數(shù)(>600)、一線EGFR-TKI持續(xù)緩解時(shí)間短、罕見EGFR突變型可延長(zhǎng)PFS,多變量分析提示,罕見EGFR突變是nivolumab療效的獨(dú)立預(yù)后因素,這與罕見突變和重度吸煙患者TMB更高有關(guān)。
EGFR突變各亞型對(duì)免疫治療的反應(yīng)存在差異。Hastings等[27]評(píng)估了126例EGFR經(jīng)典突變患者的ICI療效與預(yù)后,發(fā)現(xiàn)19del突變患者ORR(7%vs22%,P=0.002)和OS(HR=0.69,95% CI:0.493~0.965,P=0.03)都顯著差于L858R突變,這與19del突變患者TMB水平更低有關(guān)。另外,該研究還發(fā)現(xiàn),L858R突變與EGFR野生型的ORR(16%vs22%,P=0.42)和OS(HR=0.917,95% CI:0.597~1.409,P=0.69)相似。Haratani等[33]納入了25例二線接受nivolumab治療的EGFR-TKI耐藥患者,T790M陰性耐藥患者的中位PFS長(zhǎng)于T790M突變患者(HR=0.48,95% CI:0.20~1.24,P=0.099),提示EGFR21 L858R突變及T790M陰性的耐藥患者二線可嘗試使用免疫治療。
盡管NCCN指南不推薦EGFR突變型患者行免疫治療[15],但以上研究均證實(shí),一線EGFRTKI耐藥后的患者仍可從ICI治療中獲益,尤其是T790M陰性獲得性突變及L858R突變的患者。這兩類突變亞型,均是EGFR突變中TMB相對(duì)較高的,因此高TMB可指導(dǎo)ICI在EGFR突變型NSCLC中的應(yīng)用。
TMB是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的參數(shù),易于計(jì)算和重復(fù)檢測(cè),可以在各類患者隊(duì)列中交叉比較。TMB的泛瘤種相關(guān)性、檢測(cè)標(biāo)本多樣性、與免疫治療、靶向治療效果及預(yù)后的密切關(guān)聯(lián)都預(yù)示著其有廣闊的臨床應(yīng)用前景。TMB在EGFR突變型NSCLC領(lǐng)域亟需更多探索,包括TMB低表達(dá)的分子機(jī)制、繼發(fā)性非T790M突變耐藥患者中的TMB動(dòng)態(tài)變化、TMB在化療或聯(lián)合免疫治療中的療效預(yù)測(cè)應(yīng)用等。