張 妍，王 齊，李奧強，李龍杰，魏 林，嚴(yán)菊芬

(1.安徽工業(yè)大學(xué)a.冶金工程學(xué)院，b.化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山243032；2.華中師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，湖北武漢430079)

新冠病毒導(dǎo)致的新冠病毒肺炎(COVID-19)截至2020年3月17日先后在全球150多個國家和地區(qū)流行，世界衛(wèi)生組織將其危害程度定義為全球大流行。中醫(yī)藥在改善發(fā)熱、咳嗽、乏力等對癥治療方面具明顯優(yōu)勢，我國在COVID-19治療過程中醫(yī)藥參與度極高，湖北地區(qū)達75%以上，其他地區(qū)超過90%，針對中醫(yī)分期分型診治推薦不同的中藥湯劑和中成藥。醒腦靜注射液(簡稱醒腦靜)是被推薦用于治療重型、危重型COVID-19 的中藥注射液之一。中藥的早期介入有利于控制疾病向“細(xì)胞因子風(fēng)暴”發(fā)展。醒腦靜由冰片、郁金、梔子和麝香4味中藥提取物組成，是由中藥傳統(tǒng)名方“安宮牛黃丸”經(jīng)科學(xué)提取精制而成的新型中藥制劑，具醒腦開竅、清熱解毒和涼血活血等功效，在肺性腦病方面有良好的治療效果。家兔病毒性高熱模型研究表明，醒腦靜可減少內(nèi)源性熱源及腦內(nèi)前列腺素E2、環(huán)磷酸腺苷的合成與釋放，進而降低發(fā)熱指數(shù)及持續(xù)高熱時間；全身炎癥反應(yīng)綜合癥大鼠研究模型表明，醒腦靜可降低血清中的NF-κB，TNF-α及IL-6水平，并對TNF-α，IL-6，IL-8等炎癥因子具有抑制作用。然而現(xiàn)階段醒腦靜對抗COVID-19的有效活性成分及調(diào)控作用機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)、計算生物學(xué)、多向藥理學(xué)等多學(xué)科交叉融合學(xué)科，與中藥從整體水平調(diào)控機體并發(fā)揮藥效理念一致。該學(xué)科的出現(xiàn)為從整體角度系統(tǒng)尋找中藥復(fù)方活性成分與潛在作用靶點提供了新策略，有利于發(fā)現(xiàn)中藥多成分-多靶點之間的關(guān)系，幫助從整體角度探索中藥與治療疾病間的關(guān)聯(lián)性。分子對接是研究受體與配體間相互作用，預(yù)測兩者親和力和結(jié)合模式的分子模擬方法。文中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，通過構(gòu)建醒腦靜、有效成分、COVID-19相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析醒腦靜有效成分潛在靶點信號通路，計算醒腦靜有效成分與MAPK3，3CLpro的結(jié)合親和能，探索醒腦靜對抗COVID-19的有效成分及其潛在調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 醒腦靜主要化學(xué)成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)(traditional Chinese medicine systems pharmacology, TCMSP)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://tcmspw.com/index.php)，分別以醒腦靜中藥材冰片、郁金、梔子為關(guān)鍵詞進行主要化學(xué)成分檢索。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug like，DL)≥0.18為指標(biāo)，篩選郁金和梔子的主要化學(xué)成分。按照TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索規(guī)則，冰片含化學(xué)成分類藥性DL值較小，對冰片不作OB和DL篩選條件的限制，將TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索的冰片成分全部收錄；麝香為野生動物制品，其信息未被TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄，經(jīng)查閱藥典將麝香酮(musk ketone)作為麝香主要有效成分。

1.2 醒腦靜有效成分與COVID-19潛在相關(guān)靶點基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載冰片、郁金、梔子主要化合物靶點基因，借助UniProt數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一靶點基因名稱，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“musk ketone”為關(guān)鍵詞檢索麝香酮可作用靶點基因，綜合以上信息得到醒腦靜可作用靶點基因，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“pneumonia”為關(guān)鍵詞，檢索肺炎相關(guān)靶點基因，綜合ACE2共表達基因，取兩者交集，得到與COVID-19相關(guān)的靶點基因。取醒腦靜可作用靶點基因與COVID-19相關(guān)靶點基因交集，得到醒腦靜可作用的COVID-19潛在相關(guān)靶點基因。在此基礎(chǔ)上對步驟1.1醒腦靜主要化學(xué)成分進行逆向精篩，得到與COVID-19相關(guān)靶點基因有關(guān)的醒腦靜有效成分。利用Cystoscape3.7.2 軟件(http:www.cytoscape.org/)構(gòu)建醒腦靜有效成分與COVID-19 相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.3 醒腦靜潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述與醒腦靜相互作用的COVID-19相關(guān)靶點基因錄入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)，選擇多種蛋白質(zhì)，限定物種為人，選擇高置信度(0.700)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開節(jié)點，得到COVID-19相關(guān)靶蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。提取PPI網(wǎng)絡(luò)文件，得到所有節(jié)點和連線數(shù)據(jù)，使用R語言得到核心基因，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用最強的前20蛋白圖表。

1.4 醒腦靜潛在靶點基因GO富集與KEGG通路分析

為進一步了解醒腦靜潛在COVID-19 相關(guān)靶點功能及其在信號通路中的作用，將醒腦靜作用的COVID-19 相關(guān)潛在靶點基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，輸入靶基因名稱，限定物種為人并校正名稱為office gene symbol，對其進行生物學(xué)過程基因本體(gene ontology，GO)富集分析，將所得結(jié)果導(dǎo)入Excel繪制成條形圖進行可視化。以通路中差異表達的基因數(shù)目為標(biāo)準(zhǔn)，判斷京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集程度，以顯著性參數(shù)P值為限定條件，使用R語言將其繪制成氣泡圖進行可視化處理，同時作出部分相應(yīng)KEGG通路圖用于分析。

1.5 醒腦靜有效成分與MAPK3，3CLpro分子的對接

使用ChemOffice 軟件構(gòu)建醒腦靜有效成分3D 結(jié)構(gòu)，采用MMFF94 力場對其進行能量最小化，保存為mol2 格式文件。在PDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載MAPK3 晶體結(jié)構(gòu)(PDB：2ZOQ)和3CLpro 晶體結(jié)構(gòu)(PDB：6LU7)。使用Sybyl分子對接軟件中的Surflex-Dock模塊，將醒腦靜有效成分分別對接到MAPK3和3CLpro的活性空腔。對于分子對接所得構(gòu)象，使用X-Score程序計算醒腦靜有效成分與靶點蛋白的結(jié)合親和能。

2 結(jié)果與分析

2.1 醒腦靜主要化學(xué)成分

通過TCMSP檢索到冰片、郁金、梔子化學(xué)成分共351個，其中31個來自冰片，222個來自郁金，98個來自梔子。郁金、梔子以O(shè)B≥30%且DL≥0.18進一步篩選，分別得到主要化學(xué)成分15個。按照TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索規(guī)則冰片所含化學(xué)成分類藥性DL值較小，綜合考慮醒腦靜制作時取冰片全部藥材為原料的生產(chǎn)工藝，將TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到的31種化合物全部作為冰片主要化學(xué)成分。麝香為野生動物制品，其信息未被TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄，查閱藥典將麝香酮(musk ketone)作為麝香主要化學(xué)成分。

2.2 COVID-19相關(guān)靶點基因及醒腦靜有效成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺篩選出冰片、郁金和梔子上述61個化學(xué)成分可能作用的相關(guān)靶點基因，分別得到冰片可作用靶點基因49個，郁金可作用靶點基因54個，梔子可作用靶點基因167個。利用GeneCards通過關(guān)鍵詞“musk ketone”檢索到麝香主要有效成分麝香酮可作用靶點基因663個。綜合冰片、郁金、梔子、麝香主要化學(xué)成分可作用靶點基因，去除重復(fù)部分得到醒腦靜主要化學(xué)成分可作用靶點基因761個。

利用GeneCards，通過關(guān)鍵詞“pneumonia”檢索得到肺炎相關(guān)靶點基因4 562個。相關(guān)研究表明：ACE2是新冠病毒感染人體細(xì)胞的重要受體，是病毒感染細(xì)胞必不可少的蛋白，與ACE2共表達的基因中存在與COVID-19相關(guān)的重要靶點基因。綜合ACE2共表達基因(5 556個)與肺炎相關(guān)靶點基因(4 562個)，取兩者交集得到與COVID-19相關(guān)的靶點基因995個。

取醒腦靜主要化學(xué)成分可作用靶點基因與COVID-19 相關(guān)靶點基因的交集，得到醒腦靜可作用于COVID-19的潛在相關(guān)靶點基因，172個。由醒腦靜潛在作用的COVID-19相關(guān)靶點基因?qū)ι鲜鲂涯X靜62個主要化學(xué)成分逆向分析，得到醒腦靜與COVID-19相關(guān)的有效化學(xué)成分22種，結(jié)果如表1。

表1 醒腦靜與COVID-19相關(guān)的有效成分Tab.1 Active components in Xingnaojing associated with COVID-19

續(xù)表1

2.3 醒腦靜-有效成分-相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用Cystoscape3.7.2軟件構(gòu)建醒腦靜、有效成分、COVID-19相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖1。

圖1 醒腦靜-有效成分-相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Interaction network of Xingnaojing-active compounds-potential target

藥材節(jié)點4個，化合物節(jié)點22個，COVID-19相關(guān)靶點節(jié)點172個，邊236條。其中長方形代表冰片及其化合物，菱形代表郁金及其化合物，三角形代表梔子及其化合物，平行四邊代表麝香及其化合物，圓形代表COVID-19相關(guān)靶點，連線表示疾病和藥材、藥材和成分、成分和靶點、靶點和疾病的關(guān)系。該網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物平均與10.73個靶點有相互作用，每個靶點平均與1.37個化合物相互作用，說明醒腦靜具有整體調(diào)控、多成分作用多靶點的治療特點。從化合物角度看，通過分析化合物-靶點的中心度值、親中心度值以及等級值可知，在醒腦靜有效成分中，與COVID-19相關(guān)靶點結(jié)合最多的前5個化合物是麝香酮(musk ketone)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)，分別能和145，36，10，9，8個潛在靶點發(fā)生相互作用。5個化合物中，槲皮素、山奈酚、柚皮素屬于黃酮類化合物，生物活性多樣。槲皮素具抗病毒、抗炎作用，山奈酚具明顯的抗炎作用，柚皮素則是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，麝香酮具抗癡呆、抗腦缺血、抗炎等藥理作用，β-谷甾醇具抗炎、保護胃黏膜等藥理活性。從靶點角度看，與醒腦靜有效成分作用個數(shù)最多點的前5個靶點為PTGS1，CASP3，PPARG，BAX，ACHE，分別能與17，7，6，5，5個醒腦靜有效成分有相互作用。

2.4 醒腦靜潛在相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

使用STRING網(wǎng)站分析醒腦靜潛在相關(guān)靶點基因，得到其PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖2。

圖2 醒腦靜相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of potential targets of Xingnaojing

圖中節(jié)點表示靶點基因翻譯蛋白，蛋白之間連線的粗細(xì)表示兩者的潛在相關(guān)性，連線越粗，相關(guān)性越強。PPI圖中，共涉及節(jié)點172個，連線835條，平均節(jié)點9.71個，平均局部聚類系數(shù)為0.468，PPI富集顯著性參數(shù)P＜1.0×10。圖3為PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用個數(shù)前20的蛋白，這些蛋白有與細(xì)胞因子風(fēng)暴關(guān)系密切的MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，也有與細(xì)胞凋亡有關(guān)的CASP3，BCL2L1，TNFRSF1A，F(xiàn)ASLG，CASP8，CTLA4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用個數(shù)前20的蛋白Fig.3 Top 20 proteins interacting with other proteins in the PPI network

2.5 醒腦靜相關(guān)靶點通路可視化分析

使用DAVID網(wǎng)站對醒腦靜相關(guān)靶點進行GO富集分析，得到GO條目共計713個（P＜0.05），其中包括生物過程(biological process)613個，細(xì)胞組分(cellular component)50個，分子功能(molecular function)50個，占比分別為86%，7%，7%，各類別前20條通路如圖4。

通過KEGG通路分析得到共123條通路（P＜0.05），關(guān)于病毒感染、肺炎和肺部損傷的通路包括influenza A，viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor，non-small cell lung cancer，small cell lung cancer，HIF-1 signaling pathway，toll-like receptor signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，TNF signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，MAPK signaling pathway，apoptosis 等。如圖5 所示，排名前20 的通路中，有21個和16個醒腦靜有效成分潛在作用靶點分別在influenza A 和TNF signaling pathway通路中發(fā)揮重要作用。醒腦靜、有效成分、COVID-19相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有重要調(diào)控作用的CASP3和BAX也富集在其中，PPI 網(wǎng)絡(luò)中前20 位核心蛋白也有多個在兩條通路發(fā)揮重要作用，包括MAPK3，CASP3，CASP8，CYCS，CSF2，TNFRSF1A，F(xiàn)ASLG。

圖4 醒腦靜潛在作用靶點的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets of Xingnaojing

圖5 醒腦靜潛在作用靶點的KEGG通路分析及其在TNF signaling pathway中的分布Fig.5 KEGG pathway analysis of potential targets of Xingnaojing and their distribution in the TNF signaling pathway

2.6 醒腦靜有效成分與MAPK3，3CLpro的分子對接結(jié)果分析

為進一步探索醒腦靜對抗COVID-19的核心有效成分及其調(diào)控機制，選擇網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的醒腦靜潛在靶標(biāo)MAPK3和新冠病毒重要蛋白3CLpro為研究對象，使用Sybyl軟件中的Surflex-Dock模塊將醒腦靜有效成分對接到MAPK3，在3CLpro活性中心獲得結(jié)合構(gòu)象，計算不同構(gòu)象與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合親和能，評價對接分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合能力。

如表2所示，以MAPK3靶蛋白為例，以結(jié)合親和能≤-31.0 kJ/mol為標(biāo)準(zhǔn)，醒腦靜有效成分中多個化合物與MAPK3有較強的結(jié)合能力。其中：冰片中的齊墩果酸(oleanolic acid)、郁金中的β-谷甾醇(β-sitosterol)、梔子中的槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、麝香中的麝香酮(musk ketone)結(jié)合能力最強；β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚、麝香酮也分別是醒腦靜、有效成分、相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測作用靶點最多的前5個化合物；醒腦靜中部分有效成分與3CLpro也有較好的結(jié)合能力。β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚與MAPK3、3CLpro可能的結(jié)合方式如圖6。

表2 醒腦靜有效成分與MAPK3和3CLpro的結(jié)合親和能Tab.2 Binding affinity of the active component of Xingnaojing with MAPK3 and 3CLpro

圖6 β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚與MAPK3、3CLpro可能的結(jié)合方式Fig.6 Possible combination of β-sitosterol,naringin and kaempferol with MAPK3 and 3CLpro

3 結(jié) 論

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對醒腦靜注射液對抗COVID-19的調(diào)控機制進行研究，所得主要結(jié)論如下：

1)醒腦靜對抗COVID-19存在整體調(diào)控和多成分作用多靶點的特點。從化合物角度看，醒腦靜有效成分中與COVID-19相關(guān)靶點有潛在作用最多的前5個化合物分別是麝香酮、槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇。分子對接的醒腦靜核心有效化學(xué)成分與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2)醒腦靜潛在靶點中相互作用最強的前20個蛋白包括與細(xì)胞因子風(fēng)暴關(guān)系密切的MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的CASP3，BCL2L1，TNFRSF1A，F(xiàn)ASLG，CASP8，CTLA4。醒腦靜可作用包括Influenza A，TNF signaling pathway 等在內(nèi)的多個病毒感染、肺炎和肺部損傷通路。醒腦靜通過與MAPK3，CSF2，IL4，IL13，IL17A，TNF等核心靶點相互作用，參與抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等整體綜合調(diào)節(jié)過程，具有干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的重要作用。

3)分子對接結(jié)果顯示，醒腦靜有效成分與COVID-19復(fù)制中重要蛋白3CLpro也有一定的結(jié)合能力，進一步說明醒腦靜作用方式的多樣性。

本研究只是通過挖掘數(shù)據(jù)預(yù)測醒腦靜有效成分及其治療COVID-19的藥理作用機制，沒有通過具體實驗和臨床驗證，詳細(xì)結(jié)果有待進一步通過相關(guān)實驗證實。