山東省肉雞養(yǎng)殖場大腸桿菌的分離鑒定及抗藥性監(jiān)測

趙效南，張印，胡明，張慶，李璐璐，駱延波，許曉輝，劉玉慶

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

大腸桿菌是一種常見的人畜共患病病原菌，可導(dǎo)致禽的敗血癥、氣囊炎、輸卵管炎、蜂窩組織炎、心周炎、腹膜炎和卵黃囊感染等，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。動(dòng)物糞便被認(rèn)為是大腸桿菌的主要來源。

抗生素主要用于治療或者預(yù)防動(dòng)物疾病，其中一些抗生素被作為飼料添加劑用于促進(jìn)動(dòng)物生長[2-4]。由于抗生素不合理的使用，導(dǎo)致耐藥菌株和多重耐藥菌株的出現(xiàn)[5]。據(jù)報(bào)道，在巴西，商品肉雞多重耐藥大腸桿菌的分離率為71.0%[6]；在意大利，從雞肉中分離出的大腸桿菌66.9%屬于多重耐藥菌[7]；在埃及，禽源大腸桿菌分離株100%屬于多重耐藥菌[8]。耐藥性大腸桿菌可能會(huì)通過食物鏈傳遞給人類，造成人類感染治療的失敗，從而對(duì)公共安全造成危害[9]。

山東是我國肉雞養(yǎng)殖大省，商品肉雞年出欄量在16.5億只。由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致動(dòng)物源耐藥菌大量產(chǎn)生和快速傳播。因此對(duì)肉雞養(yǎng)殖場大腸桿菌的抗藥性進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測是非常必要的。本研究于2018—2019年從山東省3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)雞場中采集新鮮糞便樣品，對(duì)其進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定和抗藥性分析，旨在了解山東地區(qū)養(yǎng)雞場耐藥特點(diǎn)，為養(yǎng)殖場抗生素的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018—2019年從山東省3個(gè)規(guī)?；怆u養(yǎng)殖場采集123份新鮮糞便樣品，每個(gè)養(yǎng)雞場規(guī)模均超過15萬只。樣品采集后，置于無菌采樣袋中，并放置于冰盒中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析。

1.2 大腸桿菌的分離與鑒定

取約2 g新鮮糞便至5 mL胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃孵育24 h，然后取100 μL涂布于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取粉紅色、邊緣光滑濕潤的扁圓菌落進(jìn)行純化，對(duì)純化后的可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌DNA，通過PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，上游引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為1429R：5′-GGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：H2O 18.375 μL，Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶 0.125 μL。反應(yīng)程序：94℃ 10 min；94℃ 30 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。陽性菌株使用胰蛋白酶大豆肉湯甘油(20%)在-20℃下保存。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行11種常用抗生素的敏感性試驗(yàn)，包括氟苯尼考、慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻呋、多粘菌素、新霉素、恩諾沙星、美羅培南、多西環(huán)素、氨芐西林和安普霉素。以大腸埃希氏菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果通過2018年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[10]和歐洲抗菌藥物敏感性試驗(yàn)委員會(huì)(http://www.eucast.org/ Clinical.breakpoints)進(jìn)行評(píng)估。如對(duì)3類或3類以上抗生素耐受，則判定為多重耐藥菌。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌的分離和鑒定結(jié)果

大腸桿菌分離株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，短小呈桿狀。生化試驗(yàn)特征：V-P試驗(yàn)為陰性、吲哚試驗(yàn)為陽性、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、不分解尿素，發(fā)酵甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖等。通過16S rRNA 基因測序比對(duì)，最終從3個(gè)規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場123份新鮮糞便樣品中共分離到123株大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(圖1)顯示，123株大腸桿菌分離株對(duì)11種抗生素的耐藥率在0～100%。所有分離株對(duì)多西環(huán)素耐藥、對(duì)美羅培南敏感；大多數(shù)大腸桿菌分離株耐藥率超過50%。由表1可知，對(duì)9種抗生素耐藥的菌株多達(dá)34株，對(duì)8種抗生素耐藥的菌株有28株，對(duì)10種抗生素耐藥的菌株有26株，對(duì)7種抗生素耐藥的菌株有24株，對(duì)6種抗生素耐藥的菌株有5株，對(duì)5種抗生素耐藥的菌株有3株，對(duì)4種抗生素耐藥的有2株。其多重耐藥率為99.2%。

圖1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表1 大腸桿菌耐藥譜

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的常見菌，且廣泛存在于自然界中，在一定條件下可引起動(dòng)物的敗血癥、腸炎等疾病，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。為了解山東地區(qū)養(yǎng)雞場大腸桿菌的耐藥特點(diǎn)，本試驗(yàn)于2018—2019年通過采集3個(gè)規(guī)?；B(yǎng)雞場的新鮮糞便樣品，分離并鑒定出123株大腸桿菌，并對(duì)大腸桿菌的抗藥性進(jìn)行監(jiān)測。

由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)的濫用，導(dǎo)致高抗或多抗大腸桿菌不斷被檢出。大腸桿菌的耐藥性已經(jīng)對(duì)公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌分離株對(duì)多西環(huán)素的耐藥率高達(dá)100%，與Jahantigh等[2]報(bào)道的從感染大腸桿菌的雞場中分離的大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素耐藥率高達(dá)96%一致[2]。多西環(huán)素的副作用小，且價(jià)格低廉，是治療和控制各種家禽疾病最常用的抗生素[12，13]。大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素的高耐藥率與養(yǎng)殖場中過度使用該類抗生素有關(guān)。本研究中大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、氟苯尼考、頭孢噻呋、多粘菌素、新霉素、慶大霉素和恩諾沙星的耐藥率達(dá)到50%以上。王志浩等[14]報(bào)道的山東省雞源大腸桿菌對(duì)氨芐西林和氟苯尼考的耐藥率在67%以上，對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥率高達(dá)38.4%～44.9%，對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥率在26.8%～50.0%。Adesiyun等[15]研究表明，大腸桿菌分離株對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥率在58.5%，對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥率在9.3%～25.4%。Jahantigh等[16]試驗(yàn)結(jié)果表明，從雞中分離的大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥率在17%～100%，對(duì)頭孢菌素類抗生素耐藥率在50%，對(duì)四環(huán)素類抗生素耐藥率在95%。本研究結(jié)果與以上報(bào)道一致，表明養(yǎng)雞場中大腸桿菌的耐藥性非常嚴(yán)重。本試驗(yàn)中所有大腸桿菌分離株對(duì)美羅培南敏感，這可能與養(yǎng)殖場中很少使用這種抗生素有關(guān)。

多重耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成威脅。本研究表明養(yǎng)雞場中99.2%大腸桿菌呈多重耐藥性且耐藥譜大多在7種以上，與報(bào)道的禽源大腸桿菌分離株多重耐藥率為100%結(jié)果一致[8]，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于吳少鵬等[17]報(bào)道的山東省某地區(qū)奶牛源大腸桿菌的多重耐藥率(22.2%)。這可能與地域、物種、養(yǎng)殖場用藥不同有關(guān)。

肉雞是人類蛋白質(zhì)的主要來源，但其容易感染大腸桿菌，因此養(yǎng)雞場應(yīng)做好管理，避免繼發(fā)細(xì)菌感染。為降低大腸桿菌的抗藥性，應(yīng)防止包括肉雞在內(nèi)的食用動(dòng)物中抗生素的濫用。