魏后軍 胡波 陳萌萌 范志宇 宋艷華 仇汝龍 朱偉峰 王芳

摘要：為分析RBM4基因在新西蘭兔不同組織的表達(dá)差異情況，本研究根據(jù)GenBank中公布的穴兔RBM4基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，從兔腎臟中擴(kuò)增出RBM4基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了RBM4基因在新西蘭兔各組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明，擴(kuò)增出的新西蘭兔RBM4基因長(zhǎng)度為1 080 bp，編碼359個(gè)氨基酸。序列比對(duì)結(jié)果顯示，新西蘭兔與穴兔、牛、鼠、人、鮭魚等動(dòng)物RBM4基因的核苷酸一致性為44.1%～99.8%。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，新西蘭兔RBM4基因與其他哺乳動(dòng)物RBM4基因親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，RBM4基因在新西蘭兔的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦中均有表達(dá)，其中在腎臟中表達(dá)量最高，在腦中表達(dá)量最低。本研究成功克隆了新西蘭兔RBM4基因，并研究了其mRNA在兔各組織中的表達(dá)情況，為研究兔RBM4基因的表達(dá)及其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：RBM4基因;克隆;序列分析;表達(dá);新西蘭兔

中圖分類號(hào)： S852.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）02-0033-04

收稿日期：2020-11-09

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-43-C-1）。

作者簡(jiǎn)介：魏后軍（1986—），男，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事家兔疾病防治與獸醫(yī)生物技術(shù)研究。E-mail：whj280941235@126.com。

通信作者：王芳，博士，研究員，主要從事家兔重要疫病致病機(jī)制及防控技術(shù)研究。E-mail：rwangfang@126.com。

RNA結(jié)合基序蛋白4（RNA binding motif protein4，RBM4）是一種多功能RNA結(jié)合蛋白，參與多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程，包括前體mRNA（pre-mRNA）的選擇性剪接、翻譯控制等[1]。人RBM4含有364個(gè)氨基酸，分子大小約40 ku，N端含有2個(gè)RNA識(shí)別基序（RNA recognition motifs，RRMs）和1個(gè)CCHC型鋅指結(jié)構(gòu)，RRMs是結(jié)合RNA的主要位點(diǎn);C端有3個(gè)富含丙氨酸的延伸，具有RBM4的細(xì)胞定位及與其他蛋白質(zhì)互作的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RBM4可以在果蠅中調(diào)控晝夜規(guī)律[3];能促進(jìn)人的肌細(xì)胞[4]、胰腺細(xì)胞[5]、神經(jīng)元細(xì)胞[6]、棕色脂肪細(xì)胞[7]分化;目前，RBM4的研究主要集中在細(xì)胞凋亡、增殖，以及炎癥反應(yīng)等方面[8-10]。兔作為一種重要的試驗(yàn)動(dòng)物，其RBM4基因的相關(guān)研究尚未開展。本試驗(yàn)以新西蘭兔為研究對(duì)象，克隆RBM4基因并進(jìn)行分析，以期為研究兔RBM4基因的表達(dá)及其生物學(xué)功能和在相關(guān)疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年10月12—23日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所完成。

1.2主要試劑

RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ、核酸凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自TaKaRa公司;DEPC水，購(gòu)自索萊寶公司;DNA Marker DL2000、2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus）、Universal Ligation Mix試劑盒、Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

2月齡新西蘭兔2只，購(gòu)自江蘇省明天農(nóng)牧科技有限公司，耳靜脈空氣針處死后，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織，置于-80 ℃保存。

1.4引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的穴兔RBM4基因序列（NO. AF233063），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增新西蘭兔RBM4基因的特異性引物（表1），由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.5RNA的提取及cDNA的合成

使用RNAiso Plus提取新西蘭兔心臟、 肝臟、脾表1引物信息

基因引物序列（5′→3′）片段大小

（bp）RBM4F：ATGGTGAAGCTGTTCATCGGAAAC;R：CCGCAATTATCCTACCTCCAGTT1 104RBM4（qPCR）F：AGATCCGCTCGCTGTTCGA;R：AAGCCTTGCTCTTGTTCTTGCTG180GAPDHF：GAATCCACTGGCGTCTTCAC;R：CGTTGCTGACAATCTTGAGAGA160

臟、肺臟、腎臟和腦組織懸液的總RNA，以PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行基因組DNA的去除和cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

以新西蘭兔肝臟提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：cDNA 4 μL，2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus） 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各 2 μL，加ddH2O 至總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，120 V，40 min，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.7目的片段克隆及測(cè)序

采用核酸凝膠回收試劑盒回收并純化PCR產(chǎn)物，利用Universal Ligation Mix試劑盒將目的片段克隆入載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落，經(jīng)PCR鑒定后，挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送至南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.8生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果以DNAStar程序進(jìn)行同源性分析，并采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)

以2只新西蘭兔不同組織提取的cDNA為模板，兔GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，按ABI Q1 PCR儀的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系：TB GreenTM Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)，使用相對(duì)定量的方法，采用2-ΔΔCT算法，計(jì)算RBM4在兔不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1RBM4基因的擴(kuò)增

以新西蘭兔腎臟總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行RBM4基因的PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，獲得大小約1 100 bp的預(yù)期條帶（圖1）。經(jīng)回收純化并與載體連接后，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（NO. MW196263）。

2.2RBM4基因序列

以DNAStar程序?qū)寺〉腞BM4基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，新西蘭兔RBM4基因全長(zhǎng) 1 080 bp，編碼359個(gè)氨基酸。與GenBank上報(bào)道的穴兔、牛、鼠、人、鮭魚等各種屬動(dòng)物RBM4基因的核苷酸一致性在41.1%～99.8%之間（表2），氨基酸一致性在29.8%～100%之間。

2.3RBM4基因遺傳進(jìn)化

使用MEGA 7軟件對(duì)新西蘭兔、穴兔、人、牛、鼠、斑馬魚等的RBM4基因核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，新西蘭兔與穴兔、人、黑猩猩、牛、綿羊、野豬、鼠等哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系較近，并位于同一個(gè)大的分支，與爪蟾、斑馬魚、家蠶、鮭魚等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。

2.4RBM4基因在新西蘭兔各組織中的表達(dá)

以檢測(cè)兔RBM4基因的特異性引物對(duì)新西蘭兔各組織的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，RBM4和GAPDH的熔解曲線為單峰，特異性良好（圖3）。RBM4 mRNA在兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦中均可檢測(cè)到，其中在腎臟中表達(dá)量最高，在腦中表達(dá)量最低。經(jīng)GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析表明，RBM4基因在腦中的表達(dá)水平與在心臟和肺臟中的表達(dá)水平存在顯著性差異（P<0.05）;在脾臟、腎臟中的表達(dá)水平與腦中的表達(dá)水平之間存在極顯著性差異（P<0.01）（圖4）。

3討論

pre-RNA的選擇性剪接是形成蛋白多樣性的重要原因[11]。通過(guò)不同的mRNA的剪接異構(gòu)體，編碼具有不同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì);選擇性剪接因子分別在細(xì)胞、個(gè)體發(fā)育的不同階段、不同組織及不同生理、病理?xiàng)l件下，參與多種信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵生理過(guò)程[12-13]。對(duì)選擇性剪接因子的研究有助于我們更深入地了解基因表達(dá)的方式、蛋白質(zhì)的功能及疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究首次通過(guò)PCR方法獲得了新西蘭兔RBM4基因，大小為1 080 bp。通過(guò)對(duì)新西蘭兔RBM4基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)其與穴兔、牛、鼠、人等哺乳動(dòng)物RBM4基因的一致性均高于80%，而與爪蟾、斑馬魚、家蠶、鮭魚等的一致性均低于60%。研究結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物中，RBM4在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。隨后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了RBM4基因在新西蘭兔不同組織中mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBM4基因在新西蘭兔不同組織中的表達(dá)存在一定差異，其在脾臟和腎臟中表達(dá)量較高，在腦和肝臟中表達(dá)量較低，這與RBM4基因在人的組織中表達(dá)情況類似[14]。

本研究克隆了新西蘭兔RBM4基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并研究了其在新西蘭兔各組織中的表達(dá)差異，為以新西蘭兔作為研究對(duì)象或模型動(dòng)物的RBM4相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Markus M，Morris B J. RBM4：a multifunctional RNA-binding protein[J]. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2009，41（4）：740-743.

[2]Markus M，Morris B J. Lark is the splicing factor RBM4 and exhibits unique subnuclear localization properties[J]. DNA and Cell Biology，2006，25（8）：457-464.

[3]Huang Y，Genova G，Roberts M，et al. The LARK RNA-binding protein selectively regulates the circadian eclosion rhythm by controlling E74 protein expression[J]. PLoS One，2007，2（10）：e1107.

[4]Lin J C，Tarn W Y. RBM4 down-regulates PTB and antagonizes its activity in muscle cell-specific alternative splicing[J]. The Journal of Cell Biology，2011，193（3）：509-520.

[5]Lin J C，Yan Y T，Hsieh W K，et al. RBM4 promotes pancreas cell differentiation and insulin expression[J]. Molecular and Cellular Biology，2013，33（2）：319-327.

[6]Tarn W Y，Kuo H C，Yu H I，et al. RBM4 promotes neuronal differentiation and neurite outgrowth by modulating Numb isoform expression[J]. Molecular Biology of the Cell，2016，27（10）：1676-1683.

[7]Lin J C，Tarn W Y，Hsieh W K. Emerging role for RNA binding motif protein 4 in the development of brown adipocytes[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2014，1843（4）：769-779.

[8]Wang W Y，Quan W，Yang F，et al. RBM4 modulates the proliferation and expression of inflammatory factors via the alternative splicing of regulatory factors in HeLa cells[J]. Molecular Genetics and Genomics，2020，295（1）：95-106.

[9]Yong H M，Zhao W，Zhou X Y，et al. RNA-Binding motif 4 （RBM4） suppresses tumor growth and metastasis in human gastric cancer[J]. Medical Science Monitor：International Medical Journal of Experimental and Clinical Research，2019，25：4025-4034.

[10]Wang Y，Chen D，Qian H L，et al. The splicing factor RBM4 controls apoptosis，proliferation，and migration to suppress tumor progression[J]. Cancer Cell，2014，26（3）：374-389.

[11]Bechara E G，Sebestyén E，Bernardis I，et al. RBM5，6，and 10 differentially regulate NUMB alternative splicing to control cancer cell proliferation[J]. Molecular Cell，2013，52（5）：720-733.

[12]Lee Y，Rio D C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mRNA splicing[J]. Annual Review of Biochemistry，2015，84：291-323.

[13]Luco R F，Allo M，Schor I E，et al. Epigenetics in alternative pre-mRNA splicing[J]. Cell，2011，144（1）：16-26.

[14]Lin J C，Tarn W Y. Exon selection in α-tropomyosin mRNA is regulated by the antagonistic action of RBM4 and PTB[J]. Molecular and Cellular Biology，2005，25（22）：10111-10121.陳海元，朱曉妹，張所兵，等. 2個(gè)水稻葉片卷曲變窄突變體的遺傳分析和基因定位[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（2）：37-43.