吳昭慶，胡萍*，程華，楊欣

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省長(zhǎng)順黔南山綠色食品有限公司，貴州 黔南布依族苗族自治州 550700；3.貴州省安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 安順 561000)

貴州辣椒資源豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是一種重要的藥食同源蔬菜[1-2]。糍粑辣椒作為貴州獨(dú)具一格的地方特色辣椒制品，選用干紅辣椒、姜、蒜等為原料，經(jīng)高溫煮制、鐳砵搗碎而得，是貴州特色辣子雞和油辣椒等家常菜肴的特色佐料，具有色澤鮮艷、味道鮮美、風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)[3]。

糍粑辣椒水分含量較高，即使在冰箱中冷藏保鮮，其保質(zhì)期也不超過(guò)1周，所以出現(xiàn)了產(chǎn)品難以保存、不易貯藏、保質(zhì)期短的技術(shù)難題。目前對(duì)糍粑辣椒的研究鮮有報(bào)道[4-5]，對(duì)糍粑辣椒中腐敗微生物及致腐機(jī)理更是不清楚，為了采取有針對(duì)性的措施延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期，必須掌握糍粑辣椒的優(yōu)勢(shì)腐敗菌及其生長(zhǎng)影響因素。

PCR-DGGE技術(shù)可較為全面地體現(xiàn)樣品微生物的多樣性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于食品中微生物菌相的變化分析[6-11]，在由微生物所引起的食品腐敗變質(zhì)方面提供了較大的技術(shù)支撐[12-14]。丁文等[15]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和非培養(yǎng)(PCR-DGGE)比較的方法對(duì)熱處理辣椒醬中的殘留微生物情況進(jìn)行了研究，得出采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法不易對(duì)某些相對(duì)豐度較低的微生物菌株進(jìn)行分離，采用PCR-DGGE 技術(shù)則可更全面準(zhǔn)確地反映辣椒醬中微生物種類(lèi)的多樣性。因此，本研究基于PCR-DGGE技術(shù)對(duì)糍粑辣椒腐敗過(guò)程中細(xì)菌群落微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化監(jiān)控分析，明確其中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌群及腐敗特點(diǎn)，為后續(xù)如何利用適當(dāng)?shù)谋ｕr技術(shù)、有效的殺菌方式，有針對(duì)性地抑制糍粑辣椒腐敗微生物的生長(zhǎng)，為提高貴州糍粑辣椒制品的質(zhì)量穩(wěn)定安全性和延長(zhǎng)貨架期提供一定的科學(xué)理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：取自貴州省黔南山綠色食品有限公司，新鮮生產(chǎn)未作任何處理的糍粑辣椒樣品(約500 g)，樣品采集完成后，立即送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行0～7 d的DNA提取及相關(guān)理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

溶菌酶、去離子甲酰胺、TE緩沖液(8.0)、Tris-平衡酚：北京索萊寶科技有限公司；溴化乙錠(ethidium bromide, EB)：美國(guó)Sigma公司；PCR引物：上海捷瑞生物技術(shù)有限公司；GoTaq?Green Master Mix：美國(guó)Promega公司；無(wú)水乙醇：重慶川東化工有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其他有機(jī)、無(wú)機(jī)試劑：均為分析純，市售。

1.3 主要儀器設(shè)備

Micro 17R微量高速冷凍離心機(jī) 美國(guó) Thermo Electron公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；渦旋振蕩器、混合機(jī) 江蘇省海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀 美國(guó)BIO-RAD公司；超純水儀 上海市和泰儀器有限公司；電子天平 上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；快速水分測(cè)定儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司；便攜式pH計(jì) 深圳德圖儀表有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌總DNA的提取

參照臧凱麗等、樊敏等[16-17]的方法，準(zhǔn)確稱取10 g糍粑辣椒樣品放入250 mL三角瓶中，加入磷酸鹽緩沖液(137 mmol/L NaCl, 4.3 mmol/L NaH2PO4·7H2O, 1.4 mmol/L KH2PO4, 2.7 mmol/L KCl) ，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾粗渣，收集無(wú)渣濾液，用移液槍吸取至2 mL離心管中，10000×g離心6 min，倒掉清液，富集沉淀,若沉淀量少，可重復(fù)2～3次，然后加400 μL溶菌酶 (質(zhì)量濃度50 mg/mL)，在37 ℃條件下進(jìn)行1 h的水浴(每隔20 min搖勻一次)；水浴后加入200 μL的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)(10%)，在60 ℃條件下進(jìn)行20 min的水浴；水浴后先加入100 μL 5 mol/L NaCl，再加入600 μL十六烷基三甲基溴化銨 (hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)，在65 ℃條件下進(jìn)行15 min的水浴，然后將水浴后的混合溶液12000×g離心6 min，用移液槍吸取上清液與等體積的Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇為25∶24∶1溶液混勻，12000×g離心5 min；吸取上清液至新的離心管，與等體積的氯仿∶異戊醇為24∶1溶液混勻，12000×g離心5 min；吸取上清液至新的離心管，加入2倍體積分?jǐn)?shù)為30%聚乙二醇和3 mol/L 1/8體積NaCl，于4 ℃條件下放置3 h后取出于12000×g離心10 min，倒掉上清液，吸取200 μL冰乙醇洗滌，加60 μL TE緩沖液置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參照《貴州糍粑辣椒制作工藝》稍作修改。

1.4.3 菌落總數(shù)的測(cè)定

參照《微生物學(xué)試驗(yàn)教程》[18]。

1.4.4 Aw值的測(cè)定

參照GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》。

1.4.5 pH值的測(cè)定

參照GB/T 10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》[19]。

1.4.6 總酸含量的測(cè)定

參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》[20]。

1.4.7 PCR擴(kuò)增

1.4.7.1 第1輪PCR擴(kuò)增(巢式PCR)

采用27F[21](AGA GTT TGA TCC CTC AG)和1492R(GGT TAC CTT GTT ACG ACT T)通用引物對(duì)細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。反應(yīng)總體系(25 μL)：DNA模板2 μL，引物(1 μmol/L)各2 μL，Go Taq?Green Master Mix(2X)12 μL，滅菌dd H2O 6 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，58.5 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min,共25個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸2 min。

1.4.7.2 第2 輪PCR擴(kuò)增(降式PCR)

以2 μL第1輪PCR產(chǎn)物為模板DNA，采用引物GC-338F(GC-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)擴(kuò)增，反應(yīng)總體系25 μL(同上)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，退火溫度從67.5 ℃降至57.5 ℃，每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃，退火時(shí)間是3 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；恒定退火溫度下進(jìn)行94 ℃變性1 min， 57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,共10個(gè)循環(huán)。

1.4.7.3 第3輪PCR 擴(kuò)增(Reconditioning PCR)

以2 μL第2輪PCR產(chǎn)物為模板DNA，采用引物338F(ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG)和518R(ATT ACC GCG GCT GCT GG)進(jìn)行Reconditioning PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系25 μL(同上)，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，為5個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.8 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

對(duì)樣品細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。參照胡萍[22]的條件稍作改動(dòng)：8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度范圍35%～65%(其中100%變性劑含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺)；上樣后在0.5×TAE緩沖液(TAE緩沖液是由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸組成)中200 V預(yù)電泳10 min，然后85 V電泳16 h，EB染色后置于凝膠成像儀，在系統(tǒng)內(nèi)拍照，采用Quantity One (Bio-Rad)分析軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4.9 條帶回收及測(cè)序

在無(wú)菌操作下，用無(wú)菌刀片將DGGE膠上不同位置的條帶切下，放入2 mL離心管中，搗碎后加入20 μL ddH2O，于4 ℃過(guò)夜。吸取2 μL為模板DNA對(duì)16S rDNA V3可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增(條件同1.4.7.2)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DGGE證明和所割條帶在相同遷移位置后再割膠回收,使用引物(不含GC夾子)對(duì)16S rDNA V3的可變區(qū)再次進(jìn)行擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物送到上海紅生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。登錄NCBI(nationalc enter of biotechnology information)中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性比對(duì)。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2017對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，所有數(shù)據(jù)測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 糍粑辣椒貯藏過(guò)程中的感官及理化品質(zhì)

對(duì)0～7 d糍粑辣椒每隔24 h記錄其感官品質(zhì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 糍粑辣椒貯藏過(guò)程中的感官品質(zhì)Table 1 The sensory quality of Ciba pepper during storage

由表1和表2可知，糍粑辣椒貯藏0～7 d過(guò)程中，感官品質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，從第0天的色澤鮮艷呈亮棕紅色，組織狀態(tài)粘稠度好，呈泥狀，氣味濃郁，香味突出，愉悅有食欲，到第6天的色澤呈暗紅色，組織狀態(tài)粘稠度很差，質(zhì)地稀薄，有略微酸腐異味這些腐敗特征；水分活度值是決定食品腐敗變質(zhì)和保質(zhì)期的重要參數(shù)，水分活度越小的食物越穩(wěn)定，較少出現(xiàn)腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，糍粑辣椒Aw值從第0天的(61.75±0.15)%到第6天的(59.61±0.12)%，呈下降趨勢(shì)，但是糍粑辣椒總體Aw還是過(guò)高，說(shuō)明Aw值給微生物提供了一個(gè)良好的生長(zhǎng)環(huán)境，是導(dǎo)致糍粑辣椒腐敗變質(zhì)的一個(gè)重要因素；pH和菌落總數(shù)值是反映食品品質(zhì)的重要指標(biāo)，能夠反映食品在貯藏過(guò)程中的微生物代謝和生長(zhǎng)繁殖情況，總酸含量可以反映糍粑辣椒中酸味物質(zhì)含量變化，會(huì)使糍粑辣椒產(chǎn)生酸腐味，從而可判定為已腐敗變質(zhì)，糍粑辣椒pH值從第0天的5.21±0.02降到第6天的4.67±0.04，總酸值也從第0天的(4.17±0.05) g/kg升高至第6天的(6.29±0.07) g/kg；菌落總數(shù)值從第0天的(3.25±0.05) lg CFU/g增加到第6天的(7.12±0.03) lg CFU/g，說(shuō)明隨著貯藏天數(shù)的增加，微生物大量生長(zhǎng)繁殖，在酶和產(chǎn)酸菌的共同作用下產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致pH值逐漸降低，總酸含量逐漸升高，產(chǎn)品品質(zhì)急速下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生腐敗變質(zhì)。綜上所述，通過(guò)對(duì)感官的評(píng)定和理化指標(biāo)的測(cè)定得出本研究糍粑辣椒在第6天已達(dá)到肉眼可見(jiàn)的顯著腐敗。

表2 糍粑辣椒理化指標(biāo)的測(cè)定Table 2 The detection of physical and chemical indexes of Ciba pepper

2.2 細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 PCR電泳結(jié)果

2.3 DGGE細(xì)菌圖譜微生物多樣性分析

糍粑辣椒樣品0～7 d細(xì)菌總DNA的DGGE圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 樣品貯藏過(guò)程細(xì)菌總DNA的DGGE圖譜

采用2次重復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證每個(gè)取樣點(diǎn)條帶的方式，結(jié)果顯示DGGE圖譜皆無(wú)明顯差異。DGGE圖譜上條帶的多少和亮度分別代表微生物種類(lèi)的多少和數(shù)量的多少[23]，條帶越多說(shuō)明樣品的菌種種類(lèi)越豐富，條帶越粗亮說(shuō)明該種微生物數(shù)量多，占優(yōu)勢(shì)。圖譜上不同遷移位置條帶代表著不同種類(lèi)的微生物，相同的遷移位置代表著相同的條帶，同種微生物遷移位置相同，即為相同條帶，反之，則稱為差異性條帶[24]。由DGGE圖可以看出，在0～7 d糍粑辣椒貯藏動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)出較多條帶，也都比較亮，表明糍粑辣椒中微生物多樣性較高，優(yōu)勢(shì)菌較突出。將DGGE圖譜上不同的條帶進(jìn)行割膠、DNA回收、測(cè)序，登錄NCBI網(wǎng)站在Blast軟件中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行序列比對(duì)，其分析結(jié)果見(jiàn)表3，條帶8，12分別為潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、非培養(yǎng)的羅思河小桿菌屬(UnculturedRhodanobactersp.)，相似性為93%、92%，其余條帶檢測(cè)出的細(xì)菌相似性則均達(dá)95%以上，其中，條帶10，14分別為蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其相似性高達(dá)100%。

表3 DGGE條帶細(xì)菌16S rDNA部分基因序列比對(duì)分析Table 3 The sequence analysis of bacterial 16S rDNA partial genes of DGGE bands

由圖2和表3可知，糍粑辣椒在0～7 d的貯藏過(guò)程中,微生物多樣性較高，有明顯的差異動(dòng)態(tài)演替性。共檢測(cè)出14種不同種屬的細(xì)菌:Leuconostoclactis，Klebsiellaoxytoca，Weissellasp.,Serratiasp.,Leclerciaadecarboxylata, UnculturedChroococcidiopsissp.,Pantoeacypripedii,Alliummonanthum,Arthrobactersp.,Paenarthrobacternitroguajacolicus,Glutamicibacterarilaitensis, UnculturedRhodanobactersp.,Alliumcepa和Alliumxichuanense。貯藏1 d時(shí)，糍粑辣椒微生物菌相較0 d時(shí)發(fā)生了明顯的變化，條帶顯著增多，變亮，條帶4，5，9，11，12顯現(xiàn)且較亮，分別屬于沙雷氏菌(Serratiasp.)、阿德萊斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、節(jié)桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、西川蔥屬(Alliumxichuanense)、非培養(yǎng)的羅思河小桿菌(UnculturedRhodanobactersp.)。貯藏2 d時(shí)，菌相又有不同變化，條帶4，5，11，12消失，條帶2，6，8，9明顯變亮，分別屬于產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、蔥屬菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節(jié)桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)，直到貯藏第6天時(shí)，條帶8，9完全消失，原因可能是樣品貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，所在環(huán)境的不利影響和樣品本身水分含量高，pH偏低，總酸升高，細(xì)菌大量增長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，從而抑制了條帶8，9的生長(zhǎng)[25]。樣品的貯藏過(guò)程就是樣品的腐敗過(guò)程，條帶8，9是在樣品貯藏過(guò)程中逐步出現(xiàn)最后在腐敗終點(diǎn)時(shí)才消失的，這與Gram等[26]關(guān)于特定腐敗菌(SSO)的理論相符：特定腐敗菌在產(chǎn)品貯藏初期數(shù)量很少，僅占微生物群落的很少部分，但在產(chǎn)品腐敗過(guò)程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位。從DGGE圖中可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，主要優(yōu)勢(shì)條帶 6，7，10，13，14從樣品初期0 d到整個(gè)腐敗后期都一直存在，并且一直處于高濃度亮度，分別屬于蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養(yǎng)的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關(guān)節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，不僅粗而且亮，在腐敗過(guò)程中占據(jù)著絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)主導(dǎo)地位，說(shuō)明它也是糍粑辣椒的主要腐敗菌，且還是糍粑辣椒貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。因此，綜上分析，可以確定糍粑辣椒的主要腐敗菌群為蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養(yǎng)的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關(guān)節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，而潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節(jié)桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)為糍粑辣椒貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

將細(xì)菌DGGE圖譜上切割條帶測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

所得測(cè)序結(jié)果可以分為3個(gè)類(lèi)別：類(lèi)別Ⅰ為未培養(yǎng)的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、節(jié)桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、非培養(yǎng)的羅思河小桿菌(UnculturedRhodanobactersp.)、阿德萊斯特菌(Leclerciaadecarboxylata)、西川蔥屬(Alliumxichuanense)、蔥屬菌(Alliummonanthum)、潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，包含條帶為7，9，10，12，5，11，6，8，14，類(lèi)別Ⅱ?yàn)殛P(guān)節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)，包含條帶是13，類(lèi)別Ⅲ是乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytocastrain)、魏斯氏菌(Weissellasp.)、沙雷氏菌(Serratiasp.)，包含條帶為1，3，2，4。

3 結(jié)論

本研究基于PCR-DGGE技術(shù)對(duì)糍粑辣椒腐敗過(guò)程中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，研究結(jié)果表明：樣品貯藏0～7 d過(guò)程中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，pH和Aw值呈下降趨勢(shì)，菌落總數(shù)和總酸值則顯著升高，感官評(píng)定呈逐漸降低趨勢(shì)，綜合分析得出在第6天達(dá)到肉眼可見(jiàn)的腐敗終點(diǎn)。通過(guò)DGGE共檢測(cè)出14種不同種屬的細(xì)菌，從而確定糍粑辣椒腐敗過(guò)程中的主要腐敗菌群是蔥屬菌(Alliummonanthum)、未培養(yǎng)的球菌(UnculturedChroococcidiopsissp.)、蔥屬洋蔥菌(Alliumcepa)、關(guān)節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、阿里谷氨酸桿菌(Glutamicibacterarilaitensis)，其中，優(yōu)勢(shì)腐敗菌則是潘氏泛酸菌株(Pantoeacypripedii)、節(jié)桿菌(Paenarthrobacternitroguajacolicus)。本研究結(jié)果將為糍粑辣椒貯藏過(guò)程中微生物的腐敗研究提供非常重要的生物學(xué)數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)也為如何延長(zhǎng)糍粑辣椒保質(zhì)期技術(shù)的研究及采用針對(duì)性的抑制手段提供了強(qiáng)大的理論支撐。