原 華，劉 康，原耀楠，馮佳星

(1.河南大學(xué)，巖土與軌道交通工程研究所，開封 475004；2.河南大學(xué)土木建筑學(xué)院，開封 475004；3.河南建業(yè)置地焦作有限公司，焦作 454150；4.北京中科宏泰顧問集團(tuán)有限公司，北京 101100)

0 引 言

微生物礦化是自然界中一種廣泛存在的現(xiàn)象。隨著人們對生態(tài)環(huán)境保護(hù)力度加大，各行業(yè)都在追尋綠色環(huán)保技術(shù)，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。近年來在巖土工程領(lǐng)域，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀(microbial induced carbonate precipitation，MICP)成為一項(xiàng)新興的土體礦化技術(shù)。事實(shí)上，除微生物外，脲酶廣泛存在于植物(如豆類、瓜類[1]等)中，國外學(xué)者基于MICP又提出脲酶誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀(enzyme induced carbonate precipitation，EICP)技術(shù)[2]。

脲酶主要有三種來源：(1)通過培養(yǎng)產(chǎn)脲酶細(xì)菌，經(jīng)離心獲取脲酶。但這種脲酶活性不穩(wěn)定，且細(xì)菌培養(yǎng)步驟復(fù)雜，周期較長，不適合用來大量獲取脲酶。(2)商品化脲酶，主要從洋刀豆中提取的高純度脲酶。雖然活性較高，但價格昂貴，難以大規(guī)模使用。(3)從植物中獲取脲酶，尤其是豆類中，富含大量脲酶。在我國，大豆作為產(chǎn)量最高的豆類，價格實(shí)惠，最符合作為穩(wěn)定的脲酶來源，而大豆脲酶粗提液獲取簡單便捷，能夠有效降低成本。盡管現(xiàn)有研究已表明：在大豆脲酶誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀(soybean urease-induced calcium carbonate precipitation，SICP)[3]的過程中脲酶活性、溫度[4]、pH值[5]、Ca2+濃度[6]、尿素濃度等均會影響鈣離子的礦化。但這些研究大多僅對其中某單一因素的影響進(jìn)行分析，對SICP多因素影響的研究尚未見諸報道，且未能優(yōu)選出各個因素的最佳取值范圍。

本文從市售大豆中提取脲酶，探究脲酶濃度和溫度對脲酶活性的影響；并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計，分析不同脲酶濃度、脲酶和膠結(jié)液體積比、Ca2+濃度、溫度、pH值等多種因素對SICP的影響；并借助掃描電子顯微鏡(SEM)觀察不同因素下生成碳酸鈣的形態(tài)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

反應(yīng)液由脲酶溶液和膠結(jié)液組成，膠結(jié)液包括氯化鈣(CaCl2)和尿素(urea)。脲酶從大豆中提取，具體提取方法如下[7]：(1)將大豆粉碎烘干，然后過0.25 mm篩，所得豆粉置于低溫干燥烘箱內(nèi)保存；(2)將一定質(zhì)量的豆粉與去離子水按一定比例混合后，放置在電磁攪拌器上攪拌30 min，所得豆粉溶液放入5 ℃冰箱內(nèi)靜置2 h；(3)將豆粉溶液以3 000 r/min的速度離心15 min，隨后用土工布過濾殘?jiān)藭r所得溶液即為大豆脲酶粗提液。將該溶液在5 ℃低溫環(huán)境下儲藏，隨用隨取。CaCl2、urea及調(diào)節(jié)pH值所需的氫氧化鈉(NaOH)、無機(jī)酸等化學(xué)試劑購買于天津大茂化學(xué)試劑廠。去離子水由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

首先研究脲酶濃度和實(shí)驗(yàn)溫度對脲酶活性的影響；之后選擇脲酶濃度C1、脲酶和膠結(jié)液體積比BV、CaCl2和urea濃度比BC、Ca2+濃度C2、溫度T、pH值為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行6因素5水平正交設(shè)計(共25種工況)，分析每種工況下的Ca2+利用率，揭示不同因素對碳酸鈣礦化率的影響。實(shí)驗(yàn)原理見式(1)、(2)。

(1)

(2)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

正交實(shí)驗(yàn)中每種工況的步驟如下：(1)根據(jù)表1中C2、BC的值計算CaCl2和urea的質(zhì)量，配置膠結(jié)液，并用稀釋NaOH和無機(jī)酸溶液對其pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)；(2)配置實(shí)驗(yàn)工況所需濃度的脲酶溶液并調(diào)節(jié)其pH值；(3)根據(jù)BV推算所需膠結(jié)液和脲酶溶液的體積(反應(yīng)液總體積為40 mL)，用移液槍取樣并將兩者在試管中混合均勻；(4)反應(yīng)液在設(shè)定溫度下發(fā)生礦化反應(yīng)，用EDTA滴定法[9]測定不同時刻溶液中Ca2+濃度，以此計算Ca2+利用率，該指標(biāo)反映出碳酸鈣的沉淀效率[10]。每種工況3個平行試樣，共75個試樣。生成的碳酸鈣沉淀置于60 ℃烘箱中干燥24 h后，借助SEM觀察碳酸鈣形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 脲酶活性

不同脲酶濃度和溫度下脲酶活性隨時間的變化如圖1所示。相同溫度下，脲酶濃度越大，脲酶初始活性越高。100 g/L脲酶的初始活性高達(dá)19.5 mmol·min-1，之后隨著尿素水解反應(yīng)的進(jìn)行，脲酶活性持續(xù)降低，24 h時脲酶活性不足4 mmol·min-1。脲酶濃度相同時，環(huán)境溫度越高脲酶失活越快，說明高溫不適宜脲酶的儲存(見圖1(a))。5 ℃時不同濃度的脲酶均可在較長時間內(nèi)(21 d以上)保持一定活性，同一溫度脲酶濃度越高，脲酶完全喪失活性的時間越短(見圖1(b))。

圖1 不同溫度下的脲酶活性隨時間的變化曲線Fig.1 Curves of urease activity with time at different temperatures

2.2 Ca2+利用率

每種工況3次平行實(shí)驗(yàn)的Ca2+利用率平均值如表1所示。借助正交實(shí)驗(yàn)直觀分析法研究各因素對Ca2+利用率的影響，用Ai、Di和R(i=1、2、3、4、5)分別表示所有工況中該列因素取水平i值時，所對應(yīng)Ca2+利用率之和、Ca2+利用率平均值和極差(最大值與最小值之差)。如C1列A2表示工況ZJ6至ZJ10的Ca2+利用率之和。3個正交分析的參數(shù)也列于表1。各因素對應(yīng)的極差大小關(guān)系為pH值>BV>C2>C1>T>BC，pH值和BV對應(yīng)的極差遠(yuǎn)大于其他因素，說明pH值和BV是影響SICP礦化的主因。

表1中各因素所對應(yīng)Ca2+利用率平均值隨因素值的變化如圖2所示。隨著脲酶濃度的提高，Ca2+利用率持續(xù)增大；脲酶和膠結(jié)液體積比達(dá)到1后，Ca2+利用率反而隨脲酶摻量的增大而減小，說明此時脲酶摻量不再是影響礦化的主要因素(見圖2(a))。CaCl2與urea濃度比為1.5時，Ca2+利用率最高；Ca2+濃度超過1 mol/L后Ca2+利用率陡降。這是由于過高濃度的Ca2+抑制脲酶活性，削弱脲酶催化作用，降低尿素水解能力[11](見圖2(b))。pH值為8時，Ca2+利用率達(dá)到峰值79.6%，說明弱堿性環(huán)境有利于碳酸鈣礦化；盡管溫度對Ca2+利用率的影響較弱，但仍能清晰看到Ca2+利用率隨溫度的升高而增大(見圖2(c))。

2.3 碳酸鈣的外貌形態(tài)

圖3顯示了不同工況下生成碳酸鈣的微觀形態(tài)。當(dāng)脲酶濃度過低時(ZJ1、ZJ2、ZJ3)除生成球形碳酸鈣外，局部尚有六面體形碳酸鈣形成；但脲酶濃度增大后，碳酸鈣形態(tài)逐漸演變?yōu)榍蛐?ZJ5、ZJ15、ZJ25)。即隨著脲酶中天冬氨酸(Asp)濃度提高，生成的碳酸鈣逐漸向球形轉(zhuǎn)變[12]。其他學(xué)者也曾發(fā)現(xiàn)大豆中富含的Asp等物質(zhì)是控制碳酸鹽結(jié)構(gòu)成核、生長的重要因素[13-14]，并利用提純Asp誘導(dǎo)生成球霰石。因此，可以認(rèn)為碳酸鈣形態(tài)的轉(zhuǎn)變與豆液脲酶中富含的Asp有關(guān)。這是由于碳酸鈣晶體形狀取決于晶面數(shù)量。當(dāng)溶液中Asp濃度較高時，其羧基先與Ca2+螯合，使Ca2+形成12配位數(shù)的空間結(jié)構(gòu)即球形碳酸鈣晶核，之后通過離子交換反應(yīng)生成球形碳酸鈣[15]。球形碳酸鈣因具有比表面積大、分散流動性好等優(yōu)點(diǎn)，在造紙、電子、塑料、油墨等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[16-17]。

表1 不同因素下Ca2+利用率Table 1 Ca2+ utilization ratio at different factors

圖2 不同因素對鈣離子利用率平均值的影響Fig.2 Influence of different factors on the average value of Ca2+ utilization ratio

圖3 不同工況下生成碳酸鈣的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM images of calcium carbonate formed under different working conditions

3 結(jié) 論

(1)高溫不利于脲酶保存及脲酶活性的發(fā)揮，5 ℃下脲酶活性可保持21 d以上；相同溫度下，脲酶濃度越大，脲酶初始活性越高，脲酶完全喪失活性的時間越短。

(2)大豆脲酶誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀過程中，反應(yīng)液pH值、脲酶與膠結(jié)液體積比為影響Ca2+利用率的主要因素。Ca2+利用率隨脲酶濃度的增大而持續(xù)上升。為實(shí)現(xiàn)較高的Ca2+利用率，脲酶和膠結(jié)液最佳體積比為1，CaCl2與urea最優(yōu)濃度比為1.5，Ca2+最佳濃度為1 mol/L。反應(yīng)液pH值宜控制在中性或弱堿性；溫度和Ca2+利用率之間呈正相關(guān)變化，但提升幅度較??；Ca2+濃度過高時會抑制脲酶活性。

(3)豆液中富含的Asp是控制碳酸鈣外貌形態(tài)的重要因素，隨著脲酶濃度的增大，生成的碳酸鈣逐漸由六面體狀向球形轉(zhuǎn)變。本研究中大豆脲酶誘導(dǎo)生成的碳酸鈣多為球形，為借助生物礦化誘導(dǎo)生成球形碳酸鈣提供了新思路。