喬予希，丁小明，王 穎，丁晨光，鄭 瑾，項和立，薛武軍，李 楊

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎移植科，陜西 西安 710061）

2 型糖尿病是我國常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，以胰島素抵抗及胰島素分泌相對不足為基本特征。隨著2 型糖尿病病程的延長，患者會出現(xiàn)胰島β 細(xì)胞數(shù)目減少，引起胰島功能減退［1］。胰島β 細(xì)胞數(shù)目的減少與細(xì)胞凋亡激活、細(xì)胞周期停滯等引起的細(xì)胞損傷密切相關(guān)，多項關(guān)于胰島β 細(xì)胞損傷的研究認(rèn)為，持續(xù)存在的高糖環(huán)境能夠引起胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯［2-4］，但具體的分子機(jī)制仍不十分明確。

P27 是靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的分子，能夠靶向抑制細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）與激酶的結(jié)合并引起細(xì)胞周期停滯，也能激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8（cysteinyl aspartate specif?ic proteinase-8，caspase-8）并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。多項糖尿病相關(guān)的研究表明，高糖能夠使神經(jīng)、腎臟等組織中P27 表達(dá)增加并引起神經(jīng)及腎臟損害［5，6］；也有胰島β 細(xì)胞相關(guān)的研究表明，P27 參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控［7］。但P27 在高糖引起胰島β 細(xì)胞損傷中的作用尚不明確。為此，本實驗將以胰島INS-1 細(xì)胞為對象，具體分析高糖通過P27 途徑誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

胰島INS-1 細(xì)胞購自ATCC 公司。

1.2 試劑

P27 siRNA 及陰性對照（negative control，NC）siRNA 購自上海吉瑪公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectamine2000 購 自Invitrogen 公 司，MTS 細(xì) 胞 活 力檢測試劑盒購自MTS 公司，TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司，RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，P27、caspase-3、cyclinD1 的一抗購自Abcam 公司。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo 公司，顯微鏡購自Nikon 公司，流式細(xì)胞儀購自BD 公司，酶標(biāo)儀、凝膠成像儀購自Bio-rad 公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 INS-1 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后按照1∶3 比例傳代，傳代后的細(xì)胞分為對照組、高糖組、高糖+si-NC 組、高糖+si-P27 組。處理方法如下：（1）對照組用普通培養(yǎng)基處理；（2）高糖組用含有25 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基處理；（3）高糖+si-NC 組用含有25 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基處理并轉(zhuǎn)染NC siRNA；（4）高糖+si-P27 組用含有25 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基處理并轉(zhuǎn)染P27 siR?NA。均采用Lipofectamine2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。每個條件設(shè)置5 個復(fù)孔、連續(xù)處理24 h。

1.4.2 細(xì)胞活力檢測 用于分組的INS-1 細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組處理24 h 后用MTS 試劑盒檢測細(xì)胞活力，按照試劑盒說明性進(jìn)行染色及孵育后，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm 波長的吸光值A(chǔ)490。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測 用于分組的INS-1 細(xì)胞接種在24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組處理24 h 后用TUNEL 試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，按照試劑盒說明性進(jìn)行染色后，在顯微鏡下觀察TUNEL 陽性染色和DAPI 陽性染色的細(xì)胞并計數(shù)，計算TUNEL 陽性染色細(xì)胞數(shù)與DAPI 陽性染色細(xì)胞數(shù)的比值，即為凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞周期檢測 用于分組的INS-1 細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿內(nèi)，分組處理24 h 后用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，?20℃預(yù)冷的70%乙醇在?20℃冰箱內(nèi)固定24 h，離心收集細(xì)胞，PI 避光染色20 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期G0/G1 期、S 期、G2/M期的分布情況。

1.4.5 蛋白表達(dá)檢測 用于分組的INS-1 細(xì)胞接種在12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，分組處理24 h 后用RIPA 裂解液提取細(xì)胞內(nèi)的蛋白、用BCA 試劑盒檢測蛋白含量，取含有30 μg 蛋白的樣本與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行western blot 實驗。電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF 膜1 h，1∶1 000 稀釋的P27、caspase-3、cyclinD1 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin 一抗4℃孵育過夜；次日，1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin 為內(nèi)參計算蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高糖對INS-1 細(xì)胞中P27 表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)染P27 siRNA 敲 低P27 表 達(dá) 的 效 果

與對照組比較，高糖組INS-1 細(xì)胞中P27 的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+si-NC 組INS-1 細(xì)胞中P27 的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與高糖組、高糖+si-NC 組比較，高糖+si-P27 組INS-1 細(xì)胞中P27 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組細(xì)胞中P27 的蛋白條帶Fig 1 Protein bands of P27 in cells

2.2 敲低P27對高糖條件下INS-1細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，高糖組INS-1 細(xì)胞活力A490明顯降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+si-NC 組INS-1 細(xì)胞活力A490無明顯變化（P＞0.05）；與高糖組、高 糖+si-NC 組 比 較，高 糖+si-P27 組INS-1 細(xì)胞活力A490明顯增加（P＜0.05）。見表2。

2.3 敲低P27 對高糖條件下INS-1 細(xì)胞凋亡率及凋亡基因表達(dá)的影響

與對照組比較，高糖組INS-1 細(xì)胞的凋亡率及caspase-8 表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+si-NC 組INS-1 細(xì)胞的凋亡率及cas?pase-8 表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）；與高糖組、高糖+si-NC 組比較，高糖+si-P27 組INS-1 細(xì)胞的凋亡率及caspase-8 表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。見圖2、3 及表3。

表1 各組細(xì)胞中P27 蛋白水平的比較（±s）Tab 1 Comparison of P27 protein expression in cells（±s）

表1 各組細(xì)胞中P27 蛋白水平的比較（±s）Tab 1 Comparison of P27 protein expression in cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與高糖+si-NC 組比較，&P＜0.05。

P27 0.25±0.08 0.89±0.15*0.95±0.17 0.45±0.08#&36.002 0.000組別對照組高糖組高 糖+si?NC 組高 糖+si?P27 組n 5 5 5 5 FP

表2 四組細(xì)胞活力的比較（±s）Tab 2 Comparison of cell viability（±s）

表2 四組細(xì)胞活力的比較（±s）Tab 2 Comparison of cell viability（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與高糖+si-NC 組比較，&P＜0.05。

組別對照組高糖組高 糖+si?NC 組高糖+si?P27 組n 5 5 5 5 A490 1.02±0.22 0.42±0.09*0.45±0.08 0.93±0.17#&23.181 0.000 FP

圖2 4 組細(xì)胞TUNEL 染色圖Fig 2 TUNEL staining image

圖3 4 組細(xì)胞中caspase-8 的蛋白條帶Fig 3 Protein bands of caspase-8 in cells

2.4 敲低P27 對高糖條件下INS-1 細(xì)胞周期分布及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，高糖組INS-1 細(xì)胞中G0/G1 期比例明顯增加，S 期、G2/M 期比例及cyclinD1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與高糖組比較，高糖+si-NC 組INS-1 細(xì)胞的細(xì)胞周期及cyclinD1 表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）；與高糖組、高糖+si-NC 組比較，高糖+si-P27 組INS-1 細(xì)胞中G0/G1 期比例明顯降低，S 期、G2/M 期比例及cyclinD1 表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）。見圖4、表4。

表3 各組細(xì)胞凋亡率及caspase-8蛋白水平的比較（n=5,±s）Tab 3 Comparison of apoptosis rate and caspase-8 protein expression in cells（n=5,±s）

表3 各組細(xì)胞凋亡率及caspase-8蛋白水平的比較（n=5,±s）Tab 3 Comparison of apoptosis rate and caspase-8 protein expression in cells（n=5,±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與高糖+si-NC 組比較，&P＜0.05。

Caspase?8 0.29±0.07 0.79±0.18*0.74±0.19 0.48±0.09#&17.675 0.000組別對照組高糖組高糖+si?NC 組高糖+si?P27 組FP凋亡率2.81±0.72 20.23±5.58*19.77±3.57 6.59±1.32#&39.447 0.000

圖4 4 組細(xì)胞中cyclinD1 的蛋白條帶Fig 4 Protein bands of cyclinD1 in cells

表4 四組細(xì)胞周期及cyclinD1 蛋白水平的比較（n=5,±s）Tab 4 Comparison of cell cycle and cyclinD1 protein expression（n=5,±s）

表4 四組細(xì)胞周期及cyclinD1 蛋白水平的比較（n=5,±s）Tab 4 Comparison of cell cycle and cyclinD1 protein expression（n=5,±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，#P＜0.05；與高糖+si-NC 組比較，&P＜0.05。

CyclinD1 0.93±0.15 0.39±0.08*0.43±0.07 0.85±0.15#&5.675 0.015組別對照組高糖組高糖+si-NC 組高糖+si-P27 組FP G0/G1 期49.59±8.68 66.23±10.23*67.41±10.77 54.52±7.58#&4.349 0.020 S 期26.59±6.84 20.95±3.48*21.11±3.96 25.72±4.58#&3.734 0.032 G2/M 期23.82±4.47 12.82±2.42*11.48±2.75 19.76±3.25#&6.585 0.011

3 討論

2 型糖尿病的特征是胰島素抵抗及胰島素分泌相對不足。在胰島素抵抗的狀態(tài)下，胰島素代償性分泌增多，隨著病情延長，會出現(xiàn)胰島β 細(xì)胞損傷、胰島功能減退［8，9］。有研究報道，持續(xù)高糖刺激是造成胰島β 細(xì)胞損傷的重要原因之一，相關(guān)的基礎(chǔ)實驗發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)基處理能夠引起胰島β 細(xì)胞增殖活力下降［10-12］。本實驗以胰島INS-1 細(xì)胞為實驗對象，用高糖培養(yǎng)基處理后同樣觀察到增殖活力A490下降，與既往其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)高糖引起β 細(xì)胞增殖活力下降的結(jié)果一致，表明高糖能夠引起胰島β 細(xì)胞損傷，但具體的機(jī)制尚未闡明。

P27 是參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控的基因，糖尿病的相關(guān)研究表明，糖尿病神經(jīng)病變大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中以及糖尿病腎病大鼠腎臟中P27 的表達(dá)均明顯增加［5-6］，提示高糖可能通過上調(diào)P27 的表達(dá)來引起背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、腎小球細(xì)胞發(fā)生損傷，進(jìn)而引起糖尿病神經(jīng)病變及腎臟病變。本實驗在用高糖培養(yǎng)基處理胰島INS-1 細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中P27 的表達(dá)增加，與高糖在其他組織中增加P27 表達(dá)的報道一致，提示上調(diào)P27 可能是高糖引起β 細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。為了進(jìn)一步驗證這一機(jī)制，本實驗通過轉(zhuǎn)染siRNA 的方式敲低P27 的表達(dá)，在高糖培養(yǎng)基處理的同時轉(zhuǎn)染P27 的siRNA、敲低P27 的表達(dá)后，INS-1 細(xì)胞的增殖活力A490增加，表明敲低P27 能夠減輕高糖引起的胰島β 細(xì)胞損傷，高糖可能通過激活P27 引起胰島β 細(xì)胞損傷。

P27 相關(guān)生物學(xué)功能的研究主要集中在惡性腫瘤，多項基礎(chǔ)研究表明P27 對多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用、也能引起惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期停滯［13-18］。在高糖引起胰島β 細(xì)胞損傷的過程中，細(xì)胞凋亡的激活、細(xì)胞周期的阻滯起重要作用，本實驗觀察到：高糖培養(yǎng)基處理INS-1 細(xì)胞后凋亡率及G0/G1 期比例增加、而S 期及G2/M 期比例降低，表明高糖引起了胰島β 細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞周期停滯在G0/G1 期；在高糖處理的同時敲低P27 的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率及G0/G1 期比例降低，S 期及G2/M 期比例增加，表明敲低P27 能夠減輕高糖引起的胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯、高糖可能通過激活P27 參與胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯。

Caspase-8 及cyclinD1 是P27 下游調(diào)控細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的重要基因，P27 增加caspase-8 的表達(dá)后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制cyclinD1 的表達(dá)后引起細(xì)胞周期停滯［19，20］。本實驗在觀察到高糖通過P27 參與胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯后，進(jìn)一步從基因表達(dá)的層面驗證了上述變化。在高糖培養(yǎng)基處理INS-1 細(xì)胞后，細(xì)胞中caspase-8 的表達(dá)水平增加、cyclinD1 表達(dá)水平降低，與高糖引起細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯的作用吻合；在敲低P27 的表達(dá)后，細(xì)胞中caspase-8 的表達(dá)水平降低、cyclinD1 表達(dá)水平增加，這一變化既符合P27 在其他細(xì)胞中的生物學(xué)功能、也與敲低P27 后細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯的變化一致，由此進(jìn)一步證實高糖可能通過激活P27途徑、調(diào)節(jié)下游caspase-8 及cyclinD1 表達(dá)并參與胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯。

綜上所述，高糖具有誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用，這一作用與激活P27 途徑、調(diào)節(jié)下游caspase-8 及cyclinD1 表達(dá)有關(guān)。