李茂業(yè) 閆芳芳 劉蘇 謝云波 徐傳濤 李斌 江連強(qiáng) 何佶弦 劉明科 楊洋

摘? 要：為明確四川烤煙赤星病發(fā)生規(guī)律和生物學(xué)特性并篩選高效防治藥劑，連續(xù)3年在四川省瀘州市、涼山州、攀枝花市、廣元市、宜賓市等5個主要植煙區(qū)對煙草赤星病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，并在煙葉成熟期采集典型患病煙葉進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，通過宏觀形態(tài)學(xué)、顯微形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定其種類并測定菌落生長速率和萌發(fā)率，同時在煙田開展煙草赤星病高效防治藥劑篩選。結(jié)果表明，5個煙區(qū)采集的赤星病樣均屬于鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌，各煙區(qū)所采集分離的赤星病菌在SDAY培養(yǎng)基上菌落直徑、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率差異均不顯著。5個煙區(qū)均發(fā)生煙草赤星病，整體發(fā)病規(guī)律為：每年6月底至9月初，煙田病情指數(shù)隨著時間的推移逐漸增加，每年8月份，5個植煙區(qū)煙草赤星病病情指數(shù)顯著高于7月份并趨于峰值。10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對煙草赤星病均有較好的防治效果（防效均大于60%）。

關(guān)鍵詞：煙草赤星病菌;發(fā)生規(guī)律;生物學(xué)特性;高效藥劑

Abstract： In order to determine the periodic occurrences， biological characteristics and high effective fungicides of tobacco brown spot disease in Sichuan Province， systematic investigation was carried out to study the occurrence of brown spot of tobacco for three consecutive years in 5 major planting areas of Sichuan Province including Luzhou， Liangshan， Panzhihua， Guangyuan and Yibin. Tobacco samples with typical symptoms of brown spot were collected at maturity. To identify the causal species of the disease， colonies isolated from brown spot-infected tobacco were studied using macromorphology， micromorphology and molecular biology methods and growth rate and germination rate determined. At the same time， the screening of high efficiency emergency chemicals for brown spot of tobacco was conducted in tobacco fields. The results showed that the causal pathogens identified from tobacco samples with typical symptoms of brown spot from the 5 major planting areas of Sichuan Province were all Alternaria spp. There were no significant difference in colony diameter， spore production and germination rate among the isolates of Alternaria spp. on SDAY media. The disease index of Alternaria spp. increased gradually with time from the end of June to September every year in the 5 growing areas of tobacco. In August of every year， the disease index of Alternaria spp. in the 5 growing areas of tobacco was significantly higher than that in July and reached a peak. 10% Difenoconazole water dispersible granule and 40% mycelium net wettable powder had good control effects to control Alternaria spp of more than 60% which was stable among the 5 growing areas.

Keywords： tobacco brown spot disease; periodic occurrences; biological characteristics; high efficiency pesticides

煙草真菌侵染性病害是煙草上的重要病害，給煙農(nóng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。由鏈格孢菌引起的煙草赤星病是主要真菌性病害，該病害不僅侵染煙草葉片，還侵染煙株莖、花梗等部位，其發(fā)生特點(diǎn)為潛育期較短、傳播速度快[1-2]。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)，煙草赤星病在中國每年發(fā)生的面積達(dá)數(shù)十萬公頃，造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)上億元人民幣，煙草赤星病防治成為目前煙草生產(chǎn)中的重要任務(wù)[3-4]。

煙草赤星病以菌絲越冬，為弱寄生菌，在寄主和環(huán)境適宜時，可以多次侵染致使其爆發(fā)流行。赤星病爆發(fā)流行與濕度、溫度等環(huán)境因素和寄主本身抗性及生育期具有相關(guān)性。四川省為我國烤煙的主要產(chǎn)地之一，目前每年種植面積達(dá)8萬hm2左右。四川省各植煙區(qū)生態(tài)類型不同，每年各植煙區(qū)均報道有赤星病的發(fā)生，一般在煙草生長成熟期病株率達(dá)40%以上，嚴(yán)重制約了省內(nèi)烤煙的可持續(xù)發(fā)展。目前，有關(guān)四川省不同生態(tài)類型植煙區(qū)赤星病的發(fā)生分布特征、生物學(xué)特性及高效防治藥劑的報道較少。本研究通過調(diào)查四川省不同植煙區(qū)赤星病發(fā)生分布特征，采集發(fā)病煙葉并進(jìn)行分子鑒定，觀察赤星病菌生物學(xué)特性，同時針對不同植煙區(qū)篩選高效防治藥劑，以期為赤星病的防治提供理論和技術(shù)支持。

1? 材料與方法

1.1? 赤星病調(diào)查與樣品采集

試驗(yàn)于2017—2019年6—9月開展，在四川省瀘州市、涼山州、攀枝花市、廣元市、宜賓市5個主要植煙區(qū)對煙草赤星病發(fā)生情況進(jìn)行定點(diǎn)系統(tǒng)調(diào)查，每個煙區(qū)選擇具有代表性的3個田塊，每個田塊選擇100株煙，每周調(diào)查1次。在煙葉成熟時采集病斑呈圓形或近圓形、具有顯著褐色同心輪紋并附有黑色霉層的赤星病典型癥狀的煙葉樣品，同時記錄采集時間和發(fā)病率等信息。

1.2? 赤星病病原分離純化和分子鑒定

將赤星病典型癥狀煙葉用無菌水洗去表面異物，用無菌剪刀剪下病斑組織，在無菌操作臺上， 75%酒精浸泡消毒2～3 s，0.1%升汞溶液浸泡消毒2～3 min，無菌水沖洗3次，吸干病斑組織表面水分，置于SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)[（26±1）℃，每天光照16 h]，至菌絲長出，用無菌接菌針挑取菌絲在新的SDAY培養(yǎng)基平板上純化，直至獲得單個菌落。

將獲得的單孢菌株在SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～6 d后，利用基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA;采用通用引物，上游引物PCRA-F：CTCCGAATTCTACGGACGCAAGCCGGAAGGAACC，下游引物PCRA-R：GTCGCTAACCTTCTG CTTCAGGAGCAGACCGCTG，以基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將測得的實(shí)驗(yàn)菌株序列結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫用BLAST進(jìn)行序列比對，分析其分類地位。

1.3? 病原菌生物學(xué)特性測定

將采集自四川省各市州的煙草赤星病菌株接至SDAY培養(yǎng)基上，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天利用直尺采用十字交叉法測量各菌株生長直徑，連續(xù)測量5 d。當(dāng)培養(yǎng)至第10天時采用血球計(jì)數(shù)板測量菌落單位面積的產(chǎn)孢量。用無菌水將孢子稀釋為1.0×106 cfu/mL的懸浮液，用移液槍吸取15 ?L滴在含SDAY固體培養(yǎng)基的載玻片上，將載玻片置于（25±1） ℃的無菌環(huán)境下培養(yǎng)18 h后，用顯微鏡隨機(jī)鏡檢5個不同視野，記錄孢子萌發(fā)率。

1.4? 田間藥劑篩選

于2019年6月25日在各煙區(qū)進(jìn)行藥劑篩選試驗(yàn)。設(shè)5個藥劑處理，以清水作為對照（表1）。每處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)100 m2。發(fā)病初期，每10 d施藥1次，連續(xù)施藥3次。分別于第1次施藥前1 d、第1次施藥后7 d和第3次施藥后7 d進(jìn)行3次調(diào)查。每處理定點(diǎn)調(diào)查小區(qū)中間的100株，外圍煙株視為保護(hù)行。按病情分級標(biāo)準(zhǔn)，記錄并計(jì)算各處理組煙株發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防治效果。

1.5? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

菌株生長速率、萌發(fā)率、藥劑防效等采用Excel 2019軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，DPS進(jìn)行方差分析，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。差異顯著性水平設(shè)為p<0.05。

2? 結(jié)? 果

2.1? 赤星病菌株的采集分離及生物學(xué)性狀

由表2看出，從四川攀枝花、涼山、瀘州、宜賓、廣元5個煙區(qū)分離出的赤星病菌株表現(xiàn)出鏈格孢屬真菌的典型特征，菌絲在SDAY培養(yǎng)基上生長初期為淡灰白色至灰白色，后期轉(zhuǎn)變?yōu)榛液稚a(chǎn)生褐色孢子層，在顯微鏡下可見分生孢子具有分隔，并且經(jīng)過進(jìn)一步分子鑒定確定為鏈格孢屬真菌。培養(yǎng)5 d后，各煙區(qū)所采集的赤星病菌株的菌落直徑（p=0.768 7）、產(chǎn)孢量（p=0.709 7）和萌發(fā)率（p=0.851 0）差異均不顯著。

2.2? 赤星病在四川省5個煙區(qū)的發(fā)生程度

圖1顯示，2017年至2019年6月底至9月初，煙草赤星病在宜賓、攀枝花、涼山、瀘州、廣元5個煙葉產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，整體發(fā)病規(guī)律為：煙草赤星病病情指數(shù)隨著時間的推移逐漸升高，每年8月，各煙區(qū)赤星病病情指數(shù)均顯著高于7月并趨于峰值。相同時間，各煙區(qū)赤星病病情指數(shù)存在差異。由此可以推測赤星病主要為害期為煙草成熟期及成熟后期。5個植煙區(qū)2019年煙草赤星病病情指數(shù)相對于2017年有所下降，但差異不顯著。2017年至2019年5個植煙區(qū)煙草赤星病病情指數(shù)分別為：宜賓11.59～10.15，攀枝花12.67～10.59，涼山11.74～8.89，瀘州11.89～9.41，廣元10.04～9.26。

2.3? 赤星病高效防治藥劑篩選

田間試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），第1次施藥后7 d，各煙區(qū)藥劑處理組的病情指數(shù)與對照組相比均有所下降，說明各藥劑對赤星病的發(fā)生起到了一定的控制作用，但不同藥劑在不同地區(qū)間控制效果不一致。在宜賓和廣元，多數(shù)藥劑控制效果顯著，病情指數(shù)均與對照達(dá)到了顯著差異，而在瀘州、攀枝花和涼山只有1～2種藥劑控制效果明顯。除宜賓的T2和涼山的T3處理外，同一地區(qū)不同藥劑之間的防治效果沒有顯著差異。第3次施藥后7 d，隨著赤星病的發(fā)展，處理組的防治效果逐漸顯現(xiàn)，各地區(qū)5種藥劑處理的病情指數(shù)均顯著低于對照，防治效果均高于第1次施藥后。從同一地區(qū)不同藥劑的防治效果來看，各地區(qū)10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對赤星病的防治效果均優(yōu)于其他3種藥劑，表現(xiàn)出較為一致的規(guī)律。

3? 討? 論

鏈格孢菌具有生長周期短、產(chǎn)孢量大等特點(diǎn)，在田間易引發(fā)爆發(fā)性流行[5]。在前人研究中，我國部分地區(qū)煙草赤星病的病原菌均以鏈格孢屬真菌為主，如唐明等[6]在不同植煙區(qū)采集煙草赤星病21個樣品，鑒定結(jié)果表明所采集的赤星病病原均為鏈格孢菌;?？≥V等[7]在黑龍江省和吉林省煙田采集了320個煙草赤星病典型病樣，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法確定2個省的煙草赤星病均為鏈格孢菌。本研究從四川5個煙區(qū)分離了煙草赤星病病原菌，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)出鏈格孢屬的典型特征，并且經(jīng)過進(jìn)一步分子鑒定確定為鏈格孢屬。這與前人研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)四川5個煙區(qū)的赤星病孢子在SDAY培養(yǎng)基上的生長速率、產(chǎn)孢量及萌發(fā)率無顯著差異，且都表現(xiàn)出生長速率快和產(chǎn)孢量大等特點(diǎn)，具有在四川各市州引發(fā)流行的可能。

赤星病的發(fā)生與溫度、濕度等環(huán)境因素密切相關(guān)。劉學(xué)敏等[5]發(fā)現(xiàn)越冬赤星病孢子或菌絲在適宜的溫度和高濕環(huán)境下可以迅速生長并引發(fā)流行病。近年來，有學(xué)者研究了赤星病最適生長發(fā)育溫度，發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度在25～31 ℃時易引發(fā)赤星病流行[8-9]。本研究在四川5個煙區(qū)通過連續(xù)3年的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)每年在7月底至8月，當(dāng)連續(xù)陰雨或雨后晴天極易引發(fā)田間赤星病爆發(fā)，與上述相關(guān)研究結(jié)果一致。

赤星病主要侵染成熟期煙葉，此時煙葉細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞壁被分解致使抗性減弱[10]，赤星病病原易于侵入;同時，煙葉細(xì)胞內(nèi)可溶性糖含量增多，赤星病病原易于利用營養(yǎng)快速侵染[5]。賀剛等[11]研究了不同煙草品種對赤星病的抗性，發(fā)現(xiàn)云煙97表現(xiàn)出抗性，云煙87相對易感，因此種植抗病品種或利用免疫誘抗劑提高煙株自身抗病性是防治赤星病的有效手段。本研究在調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，煙田赤星病呈逐年下降趨勢，主要原因是隨著煙草病蟲害綠色防控技術(shù)的推廣，煙農(nóng)逐漸接受綠色防控技術(shù)理念和產(chǎn)品，在煙葉生產(chǎn)過程中采用壯苗移栽和在苗期使用煙草免疫誘抗劑，提高了煙株自身的抗性。

本研究中，5種供試藥劑在四川不同煙區(qū)對煙草赤星病的防治效果不同?？傮w上看，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對赤星病有較好的防治效果，且防效穩(wěn)定。與陳杰等[12]、張彬彬等[13]范敬修等[14]研究結(jié)果一致。苯醚甲環(huán)唑?yàn)槿蝾悮⒕鷦?，能夠高效防治多種真菌性病害，同時該藥劑安全、低毒，不污染環(huán)境和農(nóng)副產(chǎn)品[15-16]。但是，也有學(xué)者報道苯醚甲環(huán)唑和菌核凈在云南、貴州、吉林、黑龍江等地對煙草赤星病菌的防效效果降低[17-20]。為了降低病原抗藥性，提高防治煙草赤星病效果，建議交替使用10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑進(jìn)行防治。

4? 結(jié)? 論

四川攀枝花、涼山、瀘州、宜賓、廣元5個煙區(qū)的赤星病病原菌均屬于鏈格孢屬菌（Alternaria spp.），各煙區(qū)赤星病病原菌生物學(xué)特性差異均不顯著;5個煙區(qū)均發(fā)生煙草赤星病，整體發(fā)病規(guī)律為：每年6月底至8月，赤星病病情指數(shù)隨著時間的推移逐漸增加;10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和40%菌核凈可濕性粉劑對煙草赤星病防治效果最好，且防治效果穩(wěn)定，可以作為應(yīng)急藥劑防治煙草赤星病。

參考文獻(xiàn)

[1]JING C L， ZHAO J， HAN X B， et al. Essential oil of Syringa oblata Lindl. as a potential biocontrol agent against tobacco brown spot caused by Alternaria alternata [J]. Crop Protection， 2018， 104： 41-46.

[2]WANG H C， ZHANG C Q. Multi-resistance to thiophanate-methyl， diethofencarb， and procymidone among Alternaria alternata populations from tobacco plants， and the management of tobacco brown spot with azoxystrobin[J]. Phytoparasitica， 2018， 46： 677-687.

[3]李六英，竇彥霞，馬冠華，等. 我國煙草赤星病菌遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2018，45（4）：846-855.

LI L Y， DOU Y X， MA G H， et al. Genetic diversity analysis of tobacco brown spot pathogens in China by ISSR[J]. Journal of Plant Protection， 2018， 45（4）： 846-855.

[4]CHENG D D， JIA Y J， GAO H Y， et al. Characterization of the programmed cell death induced by metabolic products of Alternaria alternata in tobacco BY-2 cells[J]. Physiologia Plantarum， 2011， 141： 117-129.

[5]劉學(xué)敏，常穩(wěn)，李大壯. 煙草赤星病研究現(xiàn)狀及存在問題[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，31（1）：80-85.

LIU X M， CHANG W， LI D Z. Researching advance of tobacco brown spot caused by Alternaria alternata[J]. Journal of Northeast

Agricultural University， 2000， 31（1）： 80-85.

[6]唐明，向金友，謝冰，等. 宜賓烤煙赤星病致病力分化、生物學(xué)特性及抑菌藥劑篩選研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，22（10）：96-101.

TANG M， XIANG J Y， XIE B， et al. Study on pathogenicity differentiation， biological characteristics of Alternaria alternata and screening of the effective fungicides in Yibin[J]. Tianjin Agricultural Sciences， 2016， 22（10）： 96-101.

[7]?？≥V，盧寶慧，劉麗萍，等. 吉林省和黑龍江省煙草赤星病病原鑒定[J]. 中國煙草科學(xué)，2019，40（5）：52-59.

NIU J K， LU B H， LIU L P， et al. Identification of the pathogens causing tobacco brown spot disease in Jilin and Heilongjiang Provinces[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（5）： 52-59.

[8]STAVELY J R， MAIN C E. Influence of temperature and other factors on initiation of tobacco brown sopt[J]. Phytopathology， 1970（60）： 1591-1596.

[9]郭永峰. 赤星病抗源的抗性比較[J]. 中國煙草科學(xué)，1997（1）：1-6.

GUO Y F， ZHU X C， KONG F Y， et al. Comparison of resistance in various brown spot resistant varieties[J]. Chinese Tobacco Science， 1997（1）： 1-6.

[10]康子騰，蔣黎明，羅義勇，等. 植物病原鏈格孢屬真菌的致病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，2013，25（9）：908-914.

KANG Z T， JIANG L M， LUO Y Y， et al. The research advances of mechanism of pathogenicity of Alternaria phytopathogenic fungi[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences， 2013， 25（9）： 908-914.

[11]賀剛，廖衡斌，李文宇，等. 煙草品種和打頂時期對煙草赤星病發(fā)病情況的影響[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報，2017（12）：65-69.