硝酸鹽還原菌提高原油采收率研究進展

佘躍惠，胡琳琪，曾琦，顧永安，張凡

1.長江大學石油工程學院，湖北 武漢 430100 2.非常規(guī)油氣省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(長江大學)，湖北 武漢 430100 3.中國地質大學(北京)能源學院，北京 100083

原油資源的枯竭，全球能源需求的增加，當前原油低位的不可預測的價格，以及主要油田的成熟度不斷提高，因此需要研究成本更低和更環(huán)保的提高原油采收率技術。采用當前技術，可通過一次采油方法采出油藏中20%～40%的原油，二次采油方法可進一步采出15%～25%的原油。因此，多達約55%的原始油殘留在儲層中而未被采出。三次采油過程涉及應用不同的熱力、化學和微生物過程，以經濟上可行的速度從不良和衰竭的油井中采收額外7%～15%的原油地質儲量(original oil in place，OOIP)[1]。提高采收率可以顯著影響原油生產，因為即使采收率提高很小的幅度，也可以帶來巨大的收益，而無需開發(fā)非常規(guī)油氣資源。微生物強化采油(microbial enhanced oil recovery,MEOR)是一種有吸引力的接替采油方法，該方法有可能采收高達50%的殘余油。在MEOR過程中原位生產生物表面活性化合物不需要大量的資金投入，也不受全球原油價格的影響。與其他EOR(enhanced oil recovery)方法相比，MEOR可以是一種更經濟和更環(huán)保的選擇，因而在最近10年得到快速發(fā)展[1-4]。

近年來，微生物誘導產生生物碳酸鈣(microbial induced calcium carbonate precipitation，MICP)或者微生物自修復水泥(microbial self-healing concrete，MSHC)成為材料和環(huán)保領域的熱點研究課題，天然環(huán)境包括深部地層廣泛存在MICP過程，包括CO2地質埋藏和頁巖油氣開發(fā)等[5，6]。厭氧條件下硝酸鹽還原能強化油氣藏的MICP過程，并通過提高注入水波及效率這個途徑來提高原油采收率[7]。

硝酸鹽還原菌(NRB，也稱反硝化菌)抑制硫酸鹽還原菌(SRB)產硫化氫(H2S)技術，也稱生物競爭排斥技術，在國外油氣藏得到大量應用，被石油行業(yè)廣泛認可[8-10]。注入硝酸鹽將地下油藏的微生物群落從主要的SRB變?yōu)楦缓琋RB的微生物，包括直接氧化H2S的硝酸鹽還原硫化物氧化細菌(NR-SOB)。此外，NRB都能通過產生硝酸鹽還原途徑中形成的亞硝酸鹽來促進抑制SRB。NRB的脫氮能力是眾所周知的，其中硝酸鹽或亞硝酸鹽被轉化為含氮氣體。該功能使NRB在全球氮循環(huán)和緩解及控制由硫化物引起的海上油田儲層變酸問題中發(fā)揮重要作用[9,10]。最近，在研究油藏硝酸鹽/亞硝酸鹽的注入過程中涉及NRB-SRB相互作用的詳細微生物機制時，發(fā)現(xiàn)NRB在還原硝酸鹽時，也能產生生物表面活性劑，因而能降低油水界面張力，促進原油乳化，易被微生物降解，改善油藏巖石潤濕性，再加上硝酸鹽還原時產生的氮氣和二氧化碳可以增加油藏壓力，解除近井地帶生物硫化物堵塞，這種多功能效應能有效提高油氣采收率[9]。下面，筆者將對NRB的這種多功能特性和硝酸鹽還原介導的提高原油采收率技術進行詳細介紹。

1 油氣藏硝酸鹽還原菌資源分布

純培養(yǎng)和分子生物學方法表明NRB廣泛分布在石油油藏中，能以烴類及其代謝產物為碳源和能源，厭氧代謝硝酸鹽而生長[11-16]。油藏酸化的處理和修復策略之一是硝酸鹽處理，目前在海上油田得到廣泛應用[14-16]。項目組成員近5年來，在吐哈、青海和江漢等多個油田，開展地面污水站和油井井下NRB抑制SRB產H2S的現(xiàn)場試驗，取得了非常好的效果。在注入水中添加硝酸鹽可通過4種機制抑制儲層酸化[15]。硝酸鹽處理機制之一是刺激NRB生長，由于NRB和SRB(可還原硝酸鹽和硫酸鹽)使用相似的有機組分作為電子供體，因此NRB可以在碳源利用方面勝過SRB；硝酸鹽處理的第2種機制是使SRB的代謝途徑從硫酸鹽還原轉變?yōu)橄跛猁}還原；硝酸鹽處理的第3種機制是刺激NR-SOB生長，NR-SOB利用硝酸鹽或亞硝酸鹽將硫化物氧化成元素硫或硫酸鹽；硝酸鹽處理的第4種機制是硝酸鹽還原產物(如亞硝酸鹽)對SRB的抑制作用。

在油藏本源NRB研究中，比較有意思的是TSESMETZIS等[17]通過油藏巖心中本源微生物分析表明NRB是原位油藏中主要的功能菌。TSESMETZIS從東南亞一個未開發(fā)海上油田探井中，使用油基鉆井液鉆探采集的巖心樣品，研究了高溫(溫度95℃)非水驅油藏中本源微生物菌群，在無菌條件下盡量排除污染，從每個巖心內部提取DNA，并通過對16SrRNA基因進行測序來推導巖心本源微生物群落分布情況。結果表明草酸桿菌科是最主要的科(豐度31.4%±16.6%)。在土壤和水樣中普遍發(fā)現(xiàn)草酸桿菌科的幾個屬，以有氧降解芳香烴；在厭氧條件下還原硝酸鹽[18]。第二豐富的是假單胞菌科(豐度22.3%±7.9%)。已知該科包含的種能夠好氧或厭氧降解多環(huán)芳烴(PAH)。據(jù)報道，在厭氧條件下，許多假單胞菌種使用硝酸鹽或氯酸鹽作為首選電子受體[19]。豐度排名第三的細菌科是叢毛單胞菌(豐度10.1%±2.8%)。該科包含需氧和兼性厭氧細菌，它們能夠在需氧條件下和厭氧條件下降解單芳烴(BTEX)。已知其許多叢毛單胞菌種在厭氧條件下還原硝酸鹽和氯酸鹽[20，21]。

從低溫稠油油藏中，以石油烴作碳源和能源，硝酸鹽作電子受體，也分離到2類厭氧NRB，表明NRB在高溫和低溫油藏中都普遍存在[21,22]。這些主要微生物類群的代表種都能在厭氧條件下降解碳氫化合物并使用硝酸鹽作為末端電子受體。從油藏地層水的化學分析中，表明含有高質量濃度低分子量的有機酸鹽(如乙酸鹽質量濃度1308mg/L，丙酸鹽質量濃度177mg/L，丁酸鹽質量濃度34mg/L)，說明油藏中存在高活性的原位厭氧降解石油烴代謝活動。如果這些主要的微生物是油藏儲層中固有的，并且沒有被油基鉆井液污染，它們可能對硝酸鹽注入以控制油藏變酸顯示出相對快速的響應，說明油藏本源NRB的存在，在存在硝酸鹽作為電子受體的情況下，NRB的性能將明顯優(yōu)于SRB，并能防止儲層變酸。相反，在這些巖心樣品中只檢測到了極少量的SRB(豐度<0.01%)，測得的H2S濃度接近零，這表明該油藏條件不利于SRB的生長。但是，在不添加硝酸鹽的情況下，注入富含硫酸鹽的海水后，情況可能會迅速發(fā)生變化，這也可以解釋為何很多海上油田注海水后，或者陸上油田清水和污水混注，能刺激SRB快速生長，產生硫化氫而使油藏變酸。

目前關于油藏巖心中微生物研究的報道很少，盡管該巖心中微生物群落結果與文獻中結果無可比性，但各種證據(jù)表明該非水驅高溫油藏的硝酸鹽還原可能是一個重要的原位過程，只是由于缺乏營養(yǎng)物和硝酸鹽電子受體，硝酸鹽還原菌菌體含量很低。相反，盡管地層水中硫酸鹽含量適中，但微生物特征表明硫酸鹽還原活動卻很低。如果檢測的微生物特征反映了儲層的原位微生物群落，則表明硝酸鹽還原可能會在比以前認為的更高溫度下發(fā)生。該項研究盡管存在很多疑問和不足(如沒有開展巖心中的古菌研究)，但是關于巖心中本源微生物的研究還是非常有意義，建議今后加強類似研究，加深人們對油藏本源微生物的認識。

2 硝酸鹽還原菌介導選擇性封堵

ZHU等[23]研究了一種獨特的方法，基于自生生物礦物沉淀改變儲層巖石孔隙通道，提高水力和體積波及效率。該方法由厭氧無機營養(yǎng)硝酸鹽還原-Fe2+氧化微生物Acidovoraxebreus(nitrate-dependent Fe(II)-oxidizing，NDFO)介導，在厭氧條件下，以硝酸鹽作為唯一的電子受體，氧化可溶性亞鐵離子(Fe2+)，生成不溶性鐵氧化物礦物沉淀[24]。這種穩(wěn)定的生物礦物沉淀填充孔隙，減少巖石基質孔喉直徑，降低高滲透區(qū)的滲透率，使注入水均勻分布。

NDFO過程伴隨氮氣產生。在該研究中，在處理的模擬柱中觀察到氮氣小氣泡的產生。由于氮氣在油中的混溶性，能降低原油的黏度。此外，就地生產氮氣增加油藏的驅動壓力，從而使原油易于流動。因為廉價和無腐蝕性，氮氣已經長期被成功地用作注入流體提高采收率，以及廣泛用于油藏壓力保持和氣體舉升[25]。在油藏高壓下，氮氣與原油能形成可混相的段塞，這有助于從油藏巖石中驅替原油。該研究代表傳統(tǒng)微生物提高采收率方法的一個新的方向，并表明硝酸鹽還原-Fe2+生物氧化改善體積波及效率，以及提高原油采收率的巨大潛力。

MARTIN等[27]報道兼性厭氧菌Halomonashalodenitrificans在厭氧和高壓(8MPa)下,利用硝酸鹽還原誘導產生碳酸鈣沉淀，能固結地層砂，降低高滲透層滲透性，結果與之前報道的在厭氧常壓下產生的碳酸鈣沉淀類似，用來封堵裂縫和穩(wěn)定固結頁巖氣壓裂地層支撐劑，說明油藏在高溫高壓下，也能實現(xiàn)硝酸鹽還原誘導碳酸鈣沉淀封堵高滲透層。DOPFFEL等[7]在德國北部油田進行短期和長期(10-160d)注硝酸鹽控制油藏酸敗提高原油采收率時，發(fā)現(xiàn)脫鐵桿菌也能產生鐵和鈣質沉淀。砂巖模擬柱試驗表明，產生的生物沉淀會明顯降低砂巖滲透率。雖然油藏中的礦物沉淀會隨著時間的推移降低儲層滲透性，造成嚴重的注入問題，但由于滲透性較高的通道流量減少，導致原油產量增加，原位產生礦物沉淀可能是改善液流方向的方法。MICP是微生物活動的副產品，在自然地質環(huán)境中起著重要的金屬共沉淀和固結作用，在土壤加固、二氧化碳地質埋藏和微生物提高原油采收率中具有廣泛用途[3-6]。

盡管已經研究了油藏環(huán)境高壓下的MICP過程，通過模擬試驗評價了以改善波及效率為目的的提高原油采收率效果，地下固結巖層裂縫的礦場試驗也取得了成功。但是，還需要全面調查原位油藏中能誘導產生生物沉淀或導致生物礦化的本源微生物分布及其生物活性，加強各類油藏高溫高壓高鹽度下的模擬驅油效果研究，結合微生物產生胞外多糖(exopoly saccharides，EPS)增加MICP強度，降低微生物營養(yǎng)物的成本，提高驅油效率。

3 硝酸鹽還原菌產生的生物表面活性劑

MULLIGAN等[27]和RODRIGUES等[28]研究注硝酸鹽刺激油藏本源NRB生長，抑制SRB和修復油藏酸敗時，提出該過程中有可能產生生物表面活性物質，以提高油溶性碳源(原油)利用率，促進NRB快速生長，提高NRB對SRB的生物競爭能力。FALLON等[29]發(fā)表的專利證實天然的NRB能產生生物表面活性劑。作為能夠利用碳氫化合物作為碳源和能源的微生物，NRB將產生的生物表面活性劑作為副產物，以促進疏水性烴類底物的降解[30]。NRB產生的生物表面活性劑增加了疏水性水不溶性底物的表面積,并增加了其溶解度，從而提高了NRB對烴類化合物的生物利用度。當在NRB的細胞表面附近產生乳狀液時，每個細胞簇都會形成自己的微環(huán)境，并刺激NRB在油氣藏中的生長[30]。

HUI等[31]使用依賴于培養(yǎng)和不依賴于培養(yǎng)的方法，對來自淺層、中溫和低鹽度大慶油田陸上油藏的3種采出水樣品中的微生物群落結構和功能進行了研究。首次分離到多功能惡臭假單胞菌BBAL5-01，能代謝硝酸鹽，產生生物表面活性劑和生物聚合物，這表明厭氧本源NRB具有在油層中生產生物表面活性劑的能力，并且具有提高原油采收率的巨大潛力。

FAN等[32]從海上油藏采出的油水樣品中篩選出5株產生物表面活性劑的NRB菌，所有菌株都被鑒定為施氏假單胞菌，并研究了它們在以葡萄糖或甘油介質為碳源和能源時的產生物表面活性劑能力。其中施氏假單胞菌 CX3在葡萄糖或甘油培養(yǎng)基上生長時，分別將培養(yǎng)基表面張力降低至33.5mN/m和29.6mN/m。將CX3菌株進一步接種以檢測其生長代謝硝酸鹽的能力，在2種培養(yǎng)基中進行228h的監(jiān)測后，硝酸鹽消耗量分別為32.4%和94.5%。通過薄層色譜、帶火焰離子化檢測器的氣相色譜儀(FID)和傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)對施氏假單胞菌CX3生成的生物表面活性劑產物進行組成分析。經鑒定，生物表面活性劑產物為一小部分脂肽和一大部分糖脂的混合物，其臨界膠束濃度(CMC)低至35mg/L。 產生的生物表面活性劑在很寬的溫度(4～121℃)，pH(2～10)和鹽度(0～0.2g/mL)范圍內都顯示出高穩(wěn)定性。

油藏本源的NRB普遍存在，注硝酸鹽控制油藏酸敗在海上油田已得到廣泛應用，但關于NRB抑制SRB的分子機理還有待深入研究。最近關于NRB產生物表面活性劑的研究[9,31，32]，表明NRB在抑制SRB產硫化氫的同時，能產生物表面活性劑促進菌體自身生長，提高對SRB競爭能力，并且對于降解油溶性烴類碳源和提高原油采收率具有巨大應用潛力。今后的研究要加強產生物表面活性劑的NRB單菌提高原油采收率的模擬試驗研究，特別關注在模擬油藏高溫、高壓和高鹽度環(huán)境下的生存競爭能力和提高原油采收率的應用效果。

4 硝酸鹽還原菌提高原油采收率

MEOR在稠油油藏的應用一直面臨著挑戰(zhàn)，以往文獻報道的稠油MEOR，其黏度要求低于2000mPa·s，最佳為低于500mPa·s。2014年以來，卡爾加里大學的VOORDOUW教授和他的同事GASSARA等，一直致力于硝酸鹽還原介導的微生物提高稠油采收率研究，取得了很大的進展,主要研究結果如表1和圖1所示[33-38]。

表1 硝酸鹽還原菌提高原油采收率

圖1 硝酸鹽還原菌提高原油采收率過程Fig.1 Process of nitrate-reducing mediated MEOR

VOORDOUW選擇加拿大MHGC淺層稠油油田(原油API為16)進行NRB提高稠油采收率研究，溫度20℃時黏度為3400mPa·s，遠高于目前報道的MEOR稠油黏度。試驗壓力選擇常壓和高壓2.72MPa;通過富集培養(yǎng)分離出2類NRB菌，一類是假單胞菌屬，與施氏假單胞菌NBRC 12695菌株[21]的16SrRNA序列有99.0%相似性,能利用揮發(fā)性脂肪酸、苯甲酸鹽、甲苯、乙苯、甲酚和萘等芳香化合物進行硝酸鹽還原；另一類是陶厄氏菌屬，與陶厄氏芳香菌S100的16SrRNA序列相似性為99%[22]，能利用醋酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯和乙苯進行硝酸鹽還原。

采用低成本的水溶性電子供體如糖蜜、葡萄糖、醋酸鹽，以及較高濃度電子受體硝酸鹽80mmol/L，在模擬柱中溫度30℃下采稠油[34]。結果表明，激活的是以假單胞菌和陶厄氏菌為主的本源微生物，代謝水溶性碳水化合物電子供體和硝酸鹽電子受體，產生N2和CO2混合氣體，還可能產生有機酸和醇類、生物表面活性劑等，稠油被乳化為水包油乳狀液，乳化指數(shù)E24達到60以上，殘余油采收率達到14.4%～36.1%。此外，陶厄氏菌NRB還能利用比糖類電子供體更好的工業(yè)廢溶劑異丙醇和丙酮，在電子受體硝酸鹽存在下，在常壓和高壓下，提高稠油采收率18.2%[34]。

基于水溶性電子供體如碳水化合物[33,34]的MEOR的缺點是，該技術不使用油藏中可用的烴類底物，并且必須同時注入所有底物和發(fā)酵微生物。一旦所有組分混合在一起，發(fā)酵才開始，因此營養(yǎng)物滲透深度取決于其組成和運移特征，注營養(yǎng)物流速與反應半衰期之間的關系。相比之下，在烴和硝酸鹽介導的MEOR中，石油烴(如甲苯)用作底物，面臨稠油中輕質烴如甲苯等含量低，因此只需通過注水添加單環(huán)芳烴提高稠油中甲苯的濃度，從而提高MEOR效率[35-38]。

不添加水溶性電子供體，僅以硝酸鹽和原油從該稠油地層富集本源NRB，富集的NRB主要為固氮弓菌屬和陶厄氏菌屬[35]，能以正庚烷和殘余油為碳源和能源生長，產生氣體如N2和CO2，以及生物表面活性物質，細胞吸附在殘余油膜上，使殘余油乳化，驅替殘余油。固氮弓菌屬和陶厄氏菌屬NRB在以前文獻中已有報道[36]，能以原油為碳源和能源，尤其是降解碳5-12短鏈烴和甲苯。

由于稠油中輕質烴類含量低，尤其是甲苯含量低，不利于陶厄氏菌生長，因此在NRB提高稠油采收率中時，需要補充加入甲苯。在稠油中加入甲苯，稠油黏度有所降低，增強了NRB對硝酸鹽的還原作用，由此提出了一種新的硝酸鹽+輕質烴MEOR技術[37]。在含有0.5倍孔隙體積剩余油的高壓、水濕砂柱生物反應器中，進行了甲苯和硝酸鹽介導的生物反應器(ROR)的測試。與對照生物反應器相比，在原油中添加11～12mmol/L甲苯(直接加或加入水相中)和在水相中添加80mmol/L硝酸鹽可增加16.5%±4.4%的采收率。由于甲苯是一種廉價的工業(yè)化學品，因此即使在目前的低油價環(huán)境下，NRB-MEOR仍有可能成為增加原油產量的一種成本效益高的方法[37]。SURI等[38]通過高壓模擬柱試驗，進一步驗證了硝酸鹽+甲苯提高稠油采收率的效果。在11.2mmol/L甲苯和80mmol/L硝酸鹽介導下，陶厄氏菌和假單胞菌在稠油模擬高壓驅油試驗中(溫度25℃，壓力2.72MPa)，硝酸鹽還原率60%左右，提高稠油采收率11.2%。

疏水性電子供體中，乙苯和甲苯是硝酸鹽還原的重要電子供體[39-47]，硝酸鹽電子受體可能參與烷基苯底物的活化，但兩者的代謝途徑不同。甲苯通過富馬酸加成進行厭氧代謝，而乙苯的氧化涉及乙基側鏈的脫氫，醋酸鹽和苯甲酸是這些代謝途徑的中間產物[48]。在模擬驅油使用的批量和連續(xù)培養(yǎng)試驗中，陶厄氏菌和假單胞菌是最主要的本源NRB類群，在反硝化條件下均能在醋酸、苯甲酸鹽、乙苯和甲苯上生長。陶厄氏菌屬是目前研究比較多的NRB，它還可以利用苯乙酸、吲哚、對甲酚、苯酚和其他電子供體[49-51]。β-變形桿菌Azoarcus/“Aromatoleum”/Thauera菌群含有多種能夠厭氧降解芳香化合物和碳水化合物的NRB?；蚪M學和蛋白質組學與靶向代謝產物分析的應用已被證明有助于發(fā)現(xiàn)各種新的反應和途徑，重建復雜的芳烴厭氧降解代謝網絡，以及了解后者是如何適應環(huán)境變化的。在過去的二十年里，在3個主要的NRB有機體/方法的特定方向上取得了重大進展：

1)ThaueraaromaticaK172和AromoilumaromaticumEBN1的新型酶促反應的生物化學；

2)A.aromaticumEBN1的生理學和蛋白質基因組學；

3)Azoarcussp.菌株 CIB轉錄因子的分子機制[51]。

5 結論與建議

通過對近年來硝酸鹽還原介導的MEOR研究進行總結和回顧，得出如下結論：

1)原位油藏環(huán)境廣泛分布著本源微生物NRB，厭氧條件下以硝酸鹽作為電子受體，原油輕質烴作為電子供體生長，其中代表種屬主要有陶厄氏菌和假單胞菌。

2)在油藏高溫高壓條件下，硝酸鹽能誘導產生碳酸鐵或碳酸鈣沉淀，降低高滲透層滲透性，封堵裂縫，通過改善波及效率途徑提高原油采收率。

3)在硝酸鹽還原介導下，油藏本源NRB如施氏假單胞菌能產生物表面活性劑，改變巖石礦物潤濕性，降低油水界面張力，乳化原油，通過改善驅油效率途徑提高原油采收率。

4)稠油油藏NRB，在添加硝酸鹽和水溶性碳水化合物或者油溶性單環(huán)芳香烴化合物后，能產生N2和CO2混合氣體，增加地層壓力，降低原油黏度，乳化原油，通過烴-硝酸鹽代謝途徑提高原油采收率。

盡管NRB的EOR機理比較明確，也開展了部分NRB驅油模擬試驗，并取得了良好的驅油效果，但還存在一些問題亟待解決，如原位油藏NRB資源多樣性，以及與其他本源菌的協(xié)同作用或競爭作用，油藏高壓條件對NRB生長和代謝產生物表面活性劑的影響、原油被乳化驅動的機理、NRB驅油的分子機制等，還需要進一步研究。建議全面調查不同溫度和地質條件油藏中本源NRB資源分布和多樣性，加強油藏高溫高壓高鹽等環(huán)境條件下，開展原位油藏下NRB誘導礦物沉淀和產生物表面活性劑研究，NRB驅油的二維或者三維模擬驅油試驗研究，考察各種油藏環(huán)境因素和營養(yǎng)組分對提高原油采收率的影響，優(yōu)化驅油參數(shù)；并借助CT掃描、XRD巖石礦物分析、核磁共振NMR等手段，表征巖心驅油前后孔滲和礦物組成變化，殘余油分布。此外，通過色質聯(lián)用儀器和傅里葉變換離子回旋共振質譜等手段，表征NRB驅油前后原油組成變化、代謝物結構特征以及對驅油效果影響，從分子水平上揭示NRB的驅油機理，為NRB提高原油采收率工業(yè)化應用提供基礎數(shù)據(jù)和指導作用。