宣旭嫻，盛子璐，解振強(qiáng)，黃雨晴，鞏培杰，張川，鄭婷，王晨，房經(jīng)貴

vvi-miR172s及其靶基因響應(yīng)赤霉素調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育的作用分析

宣旭嫻1，盛子璐1，解振強(qiáng)2，黃雨晴1，鞏培杰1，張川1，鄭婷1，王晨1*，房經(jīng)貴1

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212499

【】miR172是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，闡釋vvi-miR172s及其靶基因應(yīng)答赤霉素在葡萄果實(shí)不同組織發(fā)育過程中的作用，從miRNA角度認(rèn)識(shí)GA調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育的作用機(jī)制。以‘白羅莎里奧’葡萄為材料，以miR-RACE和PCR技術(shù)克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟體和前體序列，由psRNA Target軟件預(yù)測(cè)vvi-miR172s的靶基因；利用RLM-RACE技術(shù)驗(yàn)證vvi-miR172s剪切靶基因的裂解作用及其作用位點(diǎn)；采用生物信息學(xué)軟件對(duì)靶基因、靶蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化、序列結(jié)構(gòu)分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；通過在線軟件PLANTCARE進(jìn)行啟動(dòng)子作用元件分析；通過qRT-PCR和芯片數(shù)據(jù)分析vvi-miR172s和靶基因在不同器官、不同發(fā)育階段的基因表達(dá)圖譜，以及應(yīng)答GA3在果實(shí)不同組織中的時(shí)空表達(dá)模式。克隆鑒定了vvi-miR172a/b/c/d的成熟體和前體序列，預(yù)測(cè)到和四個(gè)靶基因，驗(yàn)證到裂解產(chǎn)物及其裂解位點(diǎn)，證明它們?yōu)関vi-miR172s的真實(shí)靶基因。序列結(jié)構(gòu)分析顯示，均含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，其motif元件的種類和數(shù)量相似，均含有兩個(gè)排列順序相近的AP2蛋白結(jié)構(gòu)域，表明其結(jié)構(gòu)和功能具有一定的保守性；且、和與楊樹的親緣關(guān)系較近，與大豆具有較高的同源性；靶基因蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均為-螺旋，可進(jìn)一步折疊為穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)；4個(gè)靶蛋白亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞核內(nèi)。啟動(dòng)子作用元件分析發(fā)現(xiàn)vvi-miR172c和中含有赤霉素響應(yīng)元件，表明它們可能響應(yīng)赤霉素調(diào)控葡萄生長(zhǎng)發(fā)育；芯片數(shù)據(jù)分析顯示vvi-miR172c和靶基因的表達(dá)模式具有組織或器官特異性，且它們之間呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)，表明它們之間存在負(fù)調(diào)控作用；RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育，果皮中vvi-miR172a/b/d呈下降的表達(dá)趨勢(shì)，而靶基因的表達(dá)模式相反，表明vvi-miR172a/b/d對(duì)負(fù)調(diào)控；果肉中vvi-miR172d的表達(dá)水平降低，而靶基因的表達(dá)水平增加，表明vvi-miR172d與呈負(fù)相關(guān)性。另外，GA3處理改變了vvi-miR172s的靶模式，增強(qiáng)了果肉和果皮組織中vvi-miR172d與的負(fù)相關(guān)性，同時(shí)誘導(dǎo)了vvi-miR172c對(duì)的負(fù)調(diào)控作用。均為葡萄miR172a/b/c/d的真實(shí)靶基因，vvi-miR172家族可能通過vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172d分別介導(dǎo)靶基因和調(diào)控果皮和果肉組織的發(fā)育過程，而vvi-miR172c和vvi-miR172d及其靶基因可能是GA調(diào)控葡萄果皮與果肉組織發(fā)育的主要作用因子。

葡萄；果實(shí)發(fā)育；赤霉素；miR172；靶基因

0 引言

【研究意義】葡萄（L.）是世界四大水果之一，在我國(guó)廣泛栽培。生產(chǎn)上，通常利用GA3調(diào)控葡萄花果發(fā)育，提高果實(shí)品質(zhì)從而增加其經(jīng)濟(jì)效益。miR172是一個(gè)重要的保守miRNA家族，其家族成員的功能具有多樣性，在植物成花作用[1]、種胚發(fā)育[2]以及非生物脅迫的響應(yīng)[3]等方面發(fā)揮重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR172可能響應(yīng)GA參與葡萄花果發(fā)育的調(diào)控[4]，但其對(duì)葡萄果實(shí)不同組織的調(diào)控作用尚不清楚。從miR172角度研究GA調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育的作用機(jī)制，為深入認(rèn)識(shí)vvi-miR172s的功能及其應(yīng)答GA的分子調(diào)控機(jī)制提供重要信息?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miR172廣泛存在于植物中，不同物種中具有多個(gè)，可以在不同的組織和不同的發(fā)育階段形成保守的成熟miR172序列。模式植物擬南芥中5個(gè)加工后形成3個(gè)miR172成熟體[5]；楊樹有9個(gè)和4個(gè)miR172成員[6]；水稻含4個(gè)和2個(gè)miR172[7]；油菜含有4個(gè)miR172成員[1]；玉米中僅包括一個(gè)miR172成員[8]。擬南芥中miR172的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致非正常花的發(fā)育，還會(huì)使植物提早開花[9]；miR172對(duì)擬南芥果實(shí)（長(zhǎng)角果）的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；miR172的過表達(dá)會(huì)使蘋果果實(shí)顯著變小[10]；麻瘋樹種JcmiR172a的過表達(dá)增強(qiáng)木質(zhì)部的發(fā)育，減少韌皮部的發(fā)育[7]；據(jù)報(bào)道，miR172調(diào)控小麥穗型和脫粒率研究中發(fā)現(xiàn)miR172的過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)穗的加長(zhǎng)和降低脫粒率[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)，OsmiR172b是調(diào)控水稻種子發(fā)育表型最顯著的成員[2]，對(duì)種子胚發(fā)育具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果表明，miR172家族在不同植物中的功能具有多樣性。成熟miR172可以通過序列互補(bǔ)靶向AP2基因家族的mRNA，并且可以通過抑制翻譯或引發(fā)靶mRNA的降解來(lái)抑制靶基因的表達(dá)。目前，在擬南芥[5]、水稻[3]、油菜[1]等植物中均發(fā)現(xiàn)AP2家族轉(zhuǎn)錄因子是miR172的靶基因。miR172及其靶基因在開花時(shí)間和花器官分化中起關(guān)鍵作用。在擬南芥中，除外的所有miR172靶基因過量表達(dá)均延遲開花[11-13]。相反，花椰菜中雙重突變體，四重突變體和六倍體突變體均導(dǎo)致提早開花，且開花時(shí)間隨突變基因數(shù)量的增加而延長(zhǎng)[14-15]。另有研究發(fā)現(xiàn)AP2類轉(zhuǎn)錄因子還參與番茄果實(shí)的轉(zhuǎn)色[16]、成熟[17]及類胡蘿卜素[18]積累過程，且擬南芥中、[19]可調(diào)控種子的發(fā)育。此外，AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子還被視為植物激素信號(hào)連接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，可參與赤霉素、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸、乙烯、脫落酸等多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】赤霉素（GA）是調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育如無(wú)核膨大等的關(guān)鍵生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但其相關(guān)分子機(jī)制尚不甚清晰[21]。如上所述，miR172和AP2的研究主要集中在植物開花時(shí)間和花器官的發(fā)育方面。在擬南芥[22-23]和大豆[24]的研究中已證明AP2類轉(zhuǎn)錄因子與種子發(fā)育相關(guān)，但其參與果皮、果肉發(fā)育的研究甚少，更未見miR172通過應(yīng)答GA靶向AP2類轉(zhuǎn)錄因子參與葡萄果皮、果肉等膨大發(fā)育關(guān)鍵組織調(diào)控的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，鑒定葡萄中miR172c家族成員及其靶基因，系統(tǒng)分析miR172成員及其靶基因的染色體定位、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和上游順式作用元件；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，結(jié)合芯片數(shù)據(jù)，明確vvi-miR172成員及其靶基因應(yīng)答GA3在葡萄果實(shí)不同組織中的表達(dá)特性，為深入研究其在果皮、果肉組織發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在江蘇省句容農(nóng)博園葡萄基地進(jìn)行。

1.1 材料與處理

本試驗(yàn)以6年生優(yōu)質(zhì)‘白羅莎里奧’葡萄為試驗(yàn)材料，于盛花前10 d用50mg·L-1的GA3浸蘸花穗30s，以清水處理為對(duì)照。每組處理隨機(jī)選定12株長(zhǎng)勢(shì)較為一致的植株，分別于幼果期（花后10 d，10 DAF）、硬核期（35 DAF）、第2次膨大期（60 DAF）、近成熟期（85 DAF）隨機(jī)采集生長(zhǎng)較為一致的葡萄果實(shí)，將果皮、果肉分離，用液氮速凍并保存于-80℃冰箱中。

1.2 葡萄miR172s成熟體序列及前體序列的克隆鑒定

在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org/）搜索并下載葡萄miR172s（vvi-miR172a/b/c/d）前體及成熟體序列。基于成熟體序列，參考Wang等[25]的方法，設(shè)計(jì)特異性引物，利用miR-RACE技術(shù)在‘白羅莎里奧’果實(shí)組織中克隆vvi-miR172a/b/c/d的成熟體序列，測(cè)序后鑒定其精確序列。在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻（Japonica）、玉米（）、擬南芥（）、大豆（）、楊樹（）、煙草（）、馬鈴薯（）和番茄（）miR172家族的成熟體序列，與葡萄miR172s（vvi-miR172a/b/c/d）進(jìn)行序列比對(duì)。利用下載的vvi-miR172a/b/c/d前體序列，分別向上、向下擴(kuò)展約200 bp，預(yù)測(cè)葡萄miR172a/b/c/d的前體基因序列，并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。反應(yīng)體系為50 μL：上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL，dNTP Mixture 4 μL，Ex-Taq酶0.50 μL，ddH2O 34.5 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后回收目的片段，連接至pMD19T載體進(jìn)行TA克隆，克隆后的純化產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 葡萄miR172s靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

基于鑒定的vvi-miR172a/b/c/d成熟體序列，由在線軟件psRNA Target（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，運(yùn)行參數(shù)均為默認(rèn)值。根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果，從葡萄基因數(shù)據(jù)庫(kù)CRIBI（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php）獲得靶基因的功能注釋及基因序列。運(yùn)用在線工具M(jìn)G2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖；利用Gene Structure Display Server（GSDS）（http:// gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）進(jìn)行基因序列結(jié)構(gòu)分析，繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖；利用DNAMAN 6.0和Clustal X 2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)；使用MEGA37.0軟件，選用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用在線工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/tools/ meme）鑒定蛋白保守基序，基序數(shù)量設(shè)置為15，其余參數(shù)為默認(rèn)值；使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)CDD（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/cdd）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，采用IBS軟件作圖[26]；利用在線軟件PRABI（http://www.prabi. fr/）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；根據(jù)在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析；運(yùn)用在線軟件BUSCA（http://busca.biocomp.unibo.it）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 葡萄miR172s及其靶基因啟動(dòng)子作用元件分析

利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)CRIBI（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php）和Grape Genome Browse（http://www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）在線軟件，確定vvi-miR172a/b/c/d前體基因上游1 500 bp及4個(gè)靶基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ATG）上游1 500 bp序列，利用在線軟件PLANTCARE （http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.5 芯片數(shù)據(jù)分析

從NCBI Genesis Expression Omnibus（GEO）下載GSE36128系列（https://www.ncbi.nlm.nih.govlgeo/ query/acc.cgi?acc=GSE36128）中葡萄不同組織、不同發(fā)育階段的芯片表達(dá)譜[27]以及GSE59802系列（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE59802）中70個(gè)小RNA文庫(kù)數(shù)據(jù)。兩者表達(dá)數(shù)據(jù)都基于歐亞種葡萄品種‘Corvina’（clone 48）[28]，將葡萄不同組織、不同發(fā)育階段中每個(gè)基因的平均表達(dá)值進(jìn)行歸一化，按log2的值計(jì)算vvi-miR172s和靶基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.6 vvi-miR172家族成員及其靶基因的表達(dá)特性分析

采用CTAB法提取4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期葡萄果皮、果肉中的RNA，利用Primer 3 Input（http://bioinfo.ut. ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因，對(duì)vvi-miR172s前體基因及4個(gè)靶基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增體系及程序參考TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明書，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析（＜0.05）。

表1 引物序列及用途

下劃線部分AAGCTT和GGATCC分別指dIII和H I酶切位點(diǎn)

The underlined sequences AAGCTT and GGATCC in the primers represent restriction enzyme sites ofdIII andH I, respectively

2 結(jié)果

2.1 赤霉素處理對(duì)‘白羅莎里奧’葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的影響

GA3處理后，果實(shí)橫徑無(wú)明顯變化，果實(shí)縱徑在花后10、35及60 d顯著增長(zhǎng)，且各時(shí)期沒有明顯的果核出現(xiàn)，僅在種子區(qū)域留下一條木質(zhì)化的細(xì)線；而未經(jīng)GA3處理的對(duì)照組種子正常發(fā)育，在花后35 d可觀察到果核，說明GA3處理可以高效誘導(dǎo)‘白羅莎里奧’葡萄產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)。另外，也觀察到外源GA3處理誘導(dǎo)葡萄無(wú)核果實(shí)的同時(shí)，促進(jìn)了無(wú)籽果實(shí)的膨大，使其發(fā)育成正常商品果大小，甚至更大（圖1），表明GA3在果實(shí)發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。

圖1 GA3和CK處理下‘白羅莎里奧’葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育情況

2.2 vvi-miR172家族成員成熟體及前體序列的克隆鑒定

為確定vvi-miR172家族成員在‘白羅莎里奧’葡萄中的真實(shí)序列，對(duì)其成熟體序列和前體序列進(jìn)行克隆鑒定。通過miR-RACE獲得vvi-miR172a/b/c/d的成熟體序列，克隆所得的序列與miRBase中的同源序列一致?？寺¤b定的vvi-miR172a/b/c/d前體基因分別為507、495、546和507 bp（圖2-A）。染色體定位結(jié)果顯示vvi-miR172家族成員分布在葡萄3條染色體上，vvi-miR172b和vvi-miR172c位于Chr13上，而vvi-miR172a和vvi-miR172d分別位于Chr6和Chr8上（圖2-B）。4種miRNA前體結(jié)構(gòu)顯示出一定差異，但均可形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且成熟序列均位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′臂上（圖2-C），表明vvi-miR172a/b/c/d在前體基因上的位置高度保守。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，除vvi- miR172d含23個(gè)堿基外，vvi-miR172a、vvi-miR172b以及vvi-miR172c均為21個(gè)堿基，且vvi-miR172a和vvi-miR172b僅存在1個(gè)堿基的差異（圖2-D）。vvi-miR172四個(gè)成熟體序列存在相對(duì)保守的區(qū)域，介于4—19 bp和21—22 bp，表明miR172成熟體高度保守。vvi-miR172c與ptr-miR172g和sly-miR172d的成熟體序列相同，表明其可能具有相似的生物學(xué)功能。

A：vvi-miR172a/b/c/d 前體基因的PCR克隆產(chǎn)物；1：vvi-miR172a；2：vvi-miR172b；3：vvi-miR172c；4：vvi-miR172d；B：vvi-miR172s及其靶基因在染色體上的定位；C：vvi-miR172s前體的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)；D：不同物種miR172成熟體序列比對(duì)

2.3 vvi-miR172s靶基因的鑒定

2.3.1 vvi-miR172s靶基因的預(yù)測(cè)及匹配程度分析 根據(jù)所獲得的vvi-miR172a/b/c/d成熟體序列，利用在線軟件psRNA Target預(yù)測(cè)到4條靶基因、、和，分別分布于葡萄基因組的4條染色體上（Chr7、Chr8、Chr13、Chr6）（圖2-B），分析發(fā)現(xiàn)vvi-miR172a/b/c/d的靶區(qū)都在其靶基因的CDS區(qū)，且均通過裂解作用于靶基因（表2）。對(duì)vvi-miR172a/b/c/d與其靶基因的匹配程度進(jìn)一步分析（圖3），發(fā)現(xiàn)vvi-miR172a、vvi-miR172b與預(yù)測(cè)所得靶基因的匹配程度相同，錯(cuò)配率均為2.5；vvi-miR172c與和的匹配程度最高，錯(cuò)配率為0.5，與和的錯(cuò)配率為1.0；vvi-miR172d與的錯(cuò)配率最高為2.5，與的錯(cuò)配率分別為0.5、1.5和2.0（表2），說明vvi-miR172家族成員與靶基因間的作用強(qiáng)度存在差異。

表2 葡萄vvi-miR172s及靶基因信息

圖3 vvi-miR172s與靶基因的匹配程度

2.3.2 vvi-miR172s靶基因驗(yàn)證 利用RLM-RACE技術(shù)對(duì)vvi-miR172s剪切靶基因的作用位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的4條靶基因（和）均被驗(yàn)證到裂解產(chǎn)物，表明它們?yōu)関vi- miR172s的真實(shí)靶基因（圖4）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)vvi-miR172s在和上均只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，4個(gè)靶基因的裂解位點(diǎn)位于vvi- miR172a/b 5′端的第9位堿基（U）和第10位堿基（A）之間，vvi-miR172c/d 5′端的第10位堿基（U）和第11位堿基（A）之間，表明miRNA切割位點(diǎn)的保守性。此外，切割頻率最低，表明其與vvi-miR172a/ b/c/d間的作用強(qiáng)度較弱（圖4）。

虛線代表裂解位點(diǎn)；數(shù)字代表mRNA片段5′末端克隆的頻率

2.3.3 靶基因序列結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化保守性分析 基于預(yù)測(cè)的4條靶基因cDNA編碼的氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件對(duì)同源比對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化分析（圖5-A），發(fā)現(xiàn)比對(duì)結(jié)果可分為3組，其中水稻成員和玉米成員分別聚集為一組；、和屬于同一組，而在另一組。且和與楊樹的親緣關(guān)系較近，與大豆具有較高的同源性。利用在線軟件GSDS對(duì)靶基因序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖5-B），發(fā)現(xiàn)4個(gè)靶基因所含的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量相同，均含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。其中，與其他3個(gè)靶基因的外顯子長(zhǎng)度相似，但內(nèi)含子長(zhǎng)度不同。通過MEME在線軟件預(yù)測(cè)motif元件（圖5-C），發(fā)現(xiàn)各物種內(nèi)蛋白基序存在一定差異，但各類元件的種類和數(shù)量較為穩(wěn)定，表明AP2及RAP2具有一定的功能保守性。

2.3.4 靶蛋白的結(jié)構(gòu)分析與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用在線軟件PRABI對(duì)vvi-miR172s的靶蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)四者二級(jí)結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)形式均為-螺旋（圖6-A）。利用SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果表明其蛋白三維空間排列所形成的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象具有多樣性[26]，其中和的蛋白構(gòu)象更相似（圖6-B），表明其可能具有功能的相似性。利用在線軟件CDD對(duì)靶基因蛋白及其同源序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)各序列均含有兩個(gè)排列順序相近的AP2蛋白結(jié)構(gòu)域（圖6-C），由位置和數(shù)量相似的氨基酸編碼。對(duì)靶蛋白及同源序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（圖6-D），發(fā)現(xiàn)4條靶蛋白均位于細(xì)胞核中，而和編碼的蛋白還存在于線粒體中。

2.4 vvi-miR172s及其靶基因潛在功能分析

2.4.1 vvi-miR172s前體及靶基因的啟動(dòng)子作用元件分析 通過分析vvi-miR172s前體基因及其靶基因啟動(dòng)子作用元件，發(fā)現(xiàn)其作用元件大致可分為4類：光信號(hào)響應(yīng)（Gap-box、Box4、GAT-motif等）、激素相關(guān)響應(yīng)（ABRE、TGACG-motif、TATC-box等）、脅迫相關(guān)響應(yīng)（MBS、ARE、GC-motif等）和晝夜周期節(jié)律（circadian等）相關(guān)元件。葡萄vvi-miR172家族成員及靶基因中光信號(hào)響應(yīng)元件數(shù)量最多，作用位點(diǎn)最豐富；激素和脅迫相關(guān)響應(yīng)作用元件數(shù)量次之；晝夜周期節(jié)律相關(guān)元件數(shù)量最少（圖7-A）。此外，vvi-miR172s及其靶基因啟動(dòng)子作用元件的數(shù)量和類型也各不相同。在元件數(shù)量上，最多，次之，而vvi-miR172a最少；在作用元件類型上，除含有晝夜周期節(jié)律相關(guān)元件外，其他基因只含有3種作用元件（圖7-A）。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)vvi-miR172s及其靶基因應(yīng)答激素反應(yīng)的潛在機(jī)制，分析發(fā)現(xiàn)所有vvi-miR172家族成員及靶基因均含有激素響應(yīng)作用元件，主要包括赤霉素（gibberellin，GA）、生長(zhǎng)素（auxin，IAA）、水楊酸（salicylicacid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）及茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）響應(yīng)元件（圖7-B）。但與激素相關(guān)的順式作用元件的組成和數(shù)量在不同的vvi-miR172成員及其靶基因間均表現(xiàn)出一定的差異，其中，GA響應(yīng)元件僅存在于和vvi-miR172c中；IAA響應(yīng)元件僅存在于和中；ABA響應(yīng)元件存在于4個(gè)靶基因中；MeJA和SA響應(yīng)元件分布較為廣泛（圖7-B）。上述作用元件分析表明vvi-miR172s及其靶基因不僅能響應(yīng)光、脅迫和晝夜周期節(jié)律等外界環(huán)境信號(hào)，還可能通過參與不同激素信號(hào)途徑調(diào)控果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.4.2 vvi-miR172s及靶基因在葡萄不同器官組織中的時(shí)空表達(dá)模式分析 為認(rèn)識(shí)vvi-miR172家族及靶基因在葡萄不同器官不同組織的時(shí)空表達(dá)特征，本研究基于葡萄54個(gè)器官組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[27]和70個(gè)miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)[28]對(duì)vvi-miR172s及靶基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)vvi-miR172c及靶基因在13個(gè)不同組織或器官中均有表達(dá)。vvi-miR172c在花器官（心皮、花粉、雄蕊和花序）中的表達(dá)水平相對(duì)較高，在運(yùn)輸器官（穗軸和莖）和生殖器官（果實(shí)和種子）的表達(dá)相對(duì)較低；相比之下，靶基因在所有組織中具有較高的表達(dá)水平，和在不同組織中的表達(dá)水平較低（圖8-A）。進(jìn)一步分析vvi-miR172c及其靶基因在花、果實(shí)、莖、葉基本組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)vvi-miR172c在莖、葉和果實(shí)中低表達(dá)，而靶基因和呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式（圖8-B），表明vvi-miR172家族可能主要通過vvi-miR172c介導(dǎo)靶基因和調(diào)控葡萄莖、葉、果實(shí)的發(fā)育過程。

2.4.3 vvi-miR172s及靶基因在果實(shí)不同組織中的時(shí)空表達(dá)圖譜分析 vvi-miR172a/b/d在其發(fā)育前期表達(dá)量高，在發(fā)育后期表達(dá)量低（圖9-A），其中，vvi-miR172a和vvi-miR172d呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，在幼果期（10 DAF）表達(dá)量最高，在近成熟期（85 DAF）表達(dá)量最低（圖9-A），而vvi-miR172b在硬核期（35 DAF）果皮中有最高的表達(dá)，表明前兩個(gè)成員可能與幼果期果皮發(fā)育相關(guān)，而后者可能與硬核期果皮發(fā)育相關(guān)性更強(qiáng)。而vvi-miR172c在果皮發(fā)育的各個(gè)階段都表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平（圖9-A）。相比之下，靶基因在果皮發(fā)育中呈現(xiàn)幼果期較高表達(dá)，而近成熟期最高表達(dá)的趨勢(shì)，與vvi-miR172a/b/d的表達(dá)趨勢(shì)相反；與vvi-miR172c呈相反的表達(dá)趨勢(shì)，從幼果果皮到成熟期逐漸降低（圖9-A）。這些結(jié)果表明，vvi-miR172s家族的不同成員可能分別參與葡萄果皮發(fā)育不同時(shí)期的調(diào)控

A：靶基因的系統(tǒng)進(jìn)化；B：靶基因基因結(jié)構(gòu)；C：靶基因保守基序

A：靶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B：靶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C：靶蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；D：靶蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

A：vvi-miR172s及其靶基因啟動(dòng)子不同類型順式作用元件匯總；B：vvi-miR172s及其靶基因激素相關(guān)順式作用元件

如圖9-B所示，與果皮中不同，果肉中vvi- miR172a/b具有相同的表達(dá)模式，均在果實(shí)第二次膨大期（60 DAF）表達(dá)水平最高，其他時(shí)期具有較低的表達(dá)；vvi-miR172d隨著果肉發(fā)育逐漸降低，在幼果果肉中有最高表達(dá)，成熟期表達(dá)最低，而vvi- miR172c在整個(gè)果肉發(fā)育期的表達(dá)均較低。對(duì)比相關(guān)靶基因發(fā)現(xiàn)，在果肉不同發(fā)育時(shí)期均呈現(xiàn)較高表達(dá)，與vvi-miR172c呈相反表達(dá)趨勢(shì)，而在果肉發(fā)育過程中表達(dá)逐漸升高，相反于vvi-miR172d的表達(dá)趨勢(shì)，表明vvi-miR172c/d可能負(fù)調(diào)控其靶基因介導(dǎo)葡萄果肉發(fā)育，而vvi-miR172a/b可能與葡萄果實(shí)膨大發(fā)育相關(guān)。

對(duì)比vvi-miR172s和靶基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，葡萄果皮中，vvi-miR172a/b/d與靶基因呈較顯著的負(fù)相關(guān)，與其他靶基因的相關(guān)性較差；而在葡萄果肉中，vvi-miR172d顯著負(fù)調(diào)控的表達(dá)（圖9-B），表明vvi-miR172s及其靶基因的表達(dá)存在時(shí)空特異性。且在果實(shí)不同組織和不同發(fā)育時(shí)期，vvi-miR172家族成員對(duì)靶基因的調(diào)控作用存在差異，果皮組織中vvi-miR172家族可能主要通過vvi-miR172a/b/d介導(dǎo)起調(diào)控作用，而果肉中vvi-miR172d靶向的調(diào)控作用更強(qiáng)。

2.4.4 vvi-miR172s及靶基因在果實(shí)不同組織發(fā)育過程中應(yīng)答GA3的模式分析 赤霉素處理可誘導(dǎo)葡萄產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)，為認(rèn)識(shí)vvi-miR172s及其靶基因在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中應(yīng)答GA3的模式，分析其在GA3處理下的表達(dá)水平。果皮中外源GA3的施用使vvi-miR172c在果實(shí)第二次膨大期（60 DAF）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，vvi-miR172a/b/d在幼果期和硬核期的表達(dá)量顯著下降（圖10-A）。GA3處理顯著下調(diào)了靶基因的表達(dá)，但的表達(dá)在果實(shí)第二次膨大期顯著上調(diào)。

相關(guān)性分析顯示，GA3處理增強(qiáng)了果皮組織中vvi-miR172d對(duì)的負(fù)調(diào)控作用（圖11-A）。GA3處理使果肉中vvi-miR172d在各個(gè)發(fā)育階段呈下降趨勢(shì)，但顯著增加vvi-miR172c在果實(shí)第二次膨大期（60 DAF）的表達(dá)。靶基因在60 DAF顯著下調(diào)，的表達(dá)在GA3處理下顯著上調(diào)（圖10-B）。對(duì)比赤霉素處理后vvi-miR172s和靶基因表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在果肉中GA3同樣增強(qiáng)了果實(shí)發(fā)育前期vvi-miR172d與的負(fù)相關(guān)性，同時(shí)誘導(dǎo)了vvi-miR172c對(duì)的負(fù)調(diào)控作用（圖11-B），表明vvi-miR172s及其靶基因可能存在不同的GA3應(yīng)答模式參與葡萄果皮和果肉的發(fā)育過程，其中vvi-miR172c可能通過應(yīng)答GA3介導(dǎo)相應(yīng)靶基因參與葡萄果實(shí)第二次膨大發(fā)育的調(diào)控，而vvi-miR172d可能響應(yīng)GA3介導(dǎo)其靶基因調(diào)控葡萄幼果期與硬核期果實(shí)的發(fā)育。

A：vvi-miR172c及其靶基因在葡萄不同器官、組織和發(fā)育階段的表達(dá)譜；B：vvi-miR172c及其靶基因在葡萄不同組織的表達(dá)水平。Stamen：雄蕊；Bud-AB：萌發(fā)后的芽；Inflorescence-WD：發(fā)育良好的花序；Flower-FB：始花期；Flower-F：盛花期；Carpel：心皮；Pollen：花粉；Rachis-PFS：坐果后的穗軸；Stem-G：綠色的莖；Stem-W：木質(zhì)化的莖；Seed-G：綠果的種子

*、**分別代表差異顯著（<0.05）和極顯著（<0.01）。下同

*,** represented significant difference (<0.05) and extremely significant difference (<0.01), respectively. The same as below

圖9 vvi-miR172a/b/c/d及其靶基因在葡萄果皮（A）和果肉（B）中的表達(dá)水平

Fig. 9 Expression levels of vvi-miR172a/b/c/d and its target genes in berry pericarp (A) and flesh (B) of grape

圖10 GA3處理下vvi-miR172a/b/c/d及其靶基因在葡萄果皮（A）和果肉（B）中的表達(dá)水平

3 討論

MicroRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平起重要的調(diào)控作用。其中，高度保守的miR156和miR172被認(rèn)為是植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段變化的主要調(diào)控因子[8]。而miR172最早是在擬南芥中通過小RNA測(cè)序獲得，由于其具有高度保守性，目前已在許多植物中鑒定到miR172的存在。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄中miR172有4個(gè)成員（miR172a/b/c/d），和水稻、油菜中的成員數(shù)量相同，擬南芥miR172有5個(gè)成員，麻瘋樹有2個(gè)成員，表明miR172家族成員在不同物種中存在很大的差異。miR172是第一個(gè)主要通過抑制翻譯來(lái)調(diào)節(jié)其靶標(biāo)的植物miRNA，但在葡萄中vvi-miR172s通過裂解作用介導(dǎo)其靶基因的表達(dá)。miR172s的靶基因主要為AP2轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員，AP2/ERF蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子大家族，在生物和非生物脅迫以及發(fā)育階段起關(guān)鍵的作用，目前已在擬南芥[29]、水稻[30]、大麥、小麥[31]、油菜[1]、楊樹[32]和花生[33]中鑒定到其存在。MiR156-miR172-AP2被認(rèn)為是一種調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的途徑，進(jìn)而影響植物開花時(shí)間和花的發(fā)育[34]。AP2蛋白含有一到兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，AP2域包括60—70個(gè)高度保守的氨基酸（aa）和兩個(gè)保守的YRG和RAYD motif元件，分別在AP2域的N和C末端[1]。本研究中葡萄miR172s的4條靶基因（、和），均含有兩個(gè)AP2蛋白結(jié)構(gòu)域，但不同物種中靶基因存在差異，油菜和擬南芥中分別含有19和6個(gè)AP2類靶基因。靶基因的進(jìn)化分析顯示，相比于擬南芥和水稻，葡萄中miR172靶基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)葡萄中miR172靶基因的進(jìn)化程度較大，其功能可能更加多樣化。

MicroRNA及其靶基因在不同組織中的表達(dá)具有時(shí)空特異性。Jofuku等[35]指出，與其他花同源基因不同，AP2在擬南芥的非花組織（莖和葉）和花組織（萼片、花瓣、雄蕊、心皮、發(fā)育中的胚珠和花序分生組織）中均有表達(dá)。GIL-HUMANES等[31]研究了AP2類基因在小麥和大麥不同發(fā)育階段根、莖、幼葉和穗中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AP2類基因在所有組織中都有表達(dá)，在穗發(fā)育的早期達(dá)到高峰，并隨著穗的成熟而逐漸減少。油菜中的研究表明大部分在花器官中高表達(dá)，推測(cè)其在花發(fā)育過程中具有特殊的功能；且、和在晚花材料中的表達(dá)水平均高于早花材料，表明它們可能具有抑花作用[1]。本試驗(yàn)的熒光定量分析顯示，vvi-miR172s及其靶基因在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)存在顯著差異，vvi-miR172c在果皮和果肉中的表達(dá)水平較低，在擬南芥中，miR172a/b/c的表達(dá)在生殖生長(zhǎng)階段升高，而miR172d/e基因的表達(dá)很低，并且不會(huì)隨著植物的發(fā)育而改變[34]；在水稻中，miR172c在幼苗中表達(dá)，但在發(fā)育中的谷物中不表達(dá)[36]，表明在不同物種中miR172c的表達(dá)存在顯著差異。本研究發(fā)現(xiàn)，外源GA3增強(qiáng)了果皮和果肉組織中vvi-miR172d對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)誘導(dǎo)了果肉組織中vvi-miR172c對(duì)//的負(fù)調(diào)控作用。該研究結(jié)果初步表明vvi-miR172c/d可能介導(dǎo)調(diào)控葡萄果實(shí)的發(fā)育，為深入研究vvi-miR172s及其靶基因響應(yīng)GA信號(hào)調(diào)控葡萄果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制奠定了重要的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

葡萄miR172家族含有vvi-miR172a/b/c/d四個(gè)成員，均可通過裂解、四條靶基因參與調(diào)控葡萄果皮、果肉發(fā)育。其中，vvi-miR172a/b/d和vvi-miR172c可能分別介導(dǎo)靶基因和在果皮和果肉組織發(fā)育中起著更為重要的作用，而vvi-miR172c可能主要響應(yīng)GA3信號(hào)介導(dǎo)調(diào)控葡萄果實(shí)膨大期果皮、果肉的發(fā)育。

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Function Analysis of vvi-miR172s and Their Target Genes Response to Gibberellin Regulation of Grape Berry Development

XUAN XuXian1, SHENG ZiLu1, XIE ZhenQiang2, HUANG YuQing1, Gong PeiJie1, ZHANG Chuan1, ZHENG Ting1, WANG Chen1*, FANG JingGui1

1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry, Jurong 212499, Jiangsu

【】 miR172 is an important regulator of plant growth and development. The purpose of this research was to clarify the roles and modes response to gibberellin (GA) of the miR172 family and its target genes in development of different tissues of grape berry. 【】The mature and precursor sequences of vvi-miR172a/b/c/d were cloned and identified by miR-RACE and PCR techniques from grapevine cv. Rosario Bianco. The target genes of vvi-miR172s were predicted by psRNA Target software, and the phylogenetic, structure analysis and subcellular localization were performed by bioinformatics tools. RLM-RACE verified the cleavage roles of four target genes by vvi-miR172s. The cis-elements analysis of their promoters was predicted by PLANTCARE software. The qRT-PCR method was used to detect the temporal and spatial expression patterns of vvi-miR172s and target genes in different tissues of grape berry induced by exogenous GA3application.【】The mature and precursor sequences of vvi-miR172a/b/c/d were cloned, and four target genes (,,and) were identified from grape genome. The cleavage sites of vvi-miR172s on target genes were detected by RLM-RACE, which proved that,,andwere the true target genes. Gene structure analysis result showed that all target genes contained 10 exons, 9 introns and 2 AP2 domains. The type and number of motif elements were similar, indicating that gene structures were highly conserved. Phylogenetic analysis showed thatandwere closer to poplar, andhad high homology with soybean. The secondary structure prediction of target proteins indicated that they existed in the form of alpha-helix and further folded into the stable tertiary structure. Subcellular localization results showed that all target proteins were mainly located in the nucleus. Both vvi-miR172c andhad the hormone related cis-elements response to GA3, suggesting that they might be involved in the regulation of grape berry development by responding to corresponding hormones. Microarray data analysis revealed that the expression patterns of vvi-miR172c and target genes were tissue or orGA3n specific. RT-qPCR analysis showed that vvi-miR172a/b/d showed a decrease expression trend in pericarp, whileexhibited a reverse expression trend to the former, indicating that vvi-miR172a/b/d neGA3tively regulatedHowever, in flesh,was contradictory to vvi-miR172d, with the increased expression during grape development, suggesting that there was a significant neGA3tive correlation between vvi-miR172d andInterestingly, GA3treatment promoted the neGA3tive regulation of vvi-miR172d onand induced the neGA3tive regulation of vvi-miR172c on//. 【】andwere the real target genes of vvi-miR172s. Among the vvi-miR172 family, vvi-miR172 a/b/d might mediateregulation of pericarp development, whereas vvi-miR172d might mediateinvolved in the development of grape flesh. vvi-miR172c/d and their target genes might participate in the regulation of grape pericarp and flesh development in response to exogenous GA.

grape; fruit development; gibberellin; miR172; target gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.011

2020-06-01；

2020-11-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000106）、江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20181318）、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31972373）、大學(xué)生國(guó)家創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃（S20190012）

宣旭嫻，E-mail：2019804199@njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）