基于PK15細(xì)胞的豬圓環(huán)病毒2型全懸浮培養(yǎng)工藝

王嘉琪，董育紅，姜菊玲，錢(qián)建寧，魏文濤，宋國(guó)亮，焦金波，關(guān)新新，姬郭彪，張業(yè)炘

基于PK15細(xì)胞的豬圓環(huán)病毒2型全懸浮培養(yǎng)工藝

1甘肅健順生物科技有限公司，蘭州 730070；2洛陽(yáng)惠中生物技術(shù)有限公司，河南洛陽(yáng) 471000

【】篩選1株適合PCV2病毒生產(chǎn)的懸浮細(xì)胞株，摸索PCV2懸浮生產(chǎn)工藝（病毒種毒來(lái)源、MOI及收獲時(shí)間），為大規(guī)模懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。使用有限稀釋法對(duì)PK15原細(xì)胞稀釋后接種于96孔板，每2 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)，待細(xì)胞90%長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞從96孔板陸續(xù)擴(kuò)至24孔板、12孔板、6孔板，最后到方瓶，篩選3株可貼壁生長(zhǎng)的、形態(tài)較好的PK15克隆。3株克?。≒K15-1C8、2F11、1E5）按照1×106細(xì)胞/mL的密度，直接接種在PK15的無(wú)血清培養(yǎng)基中，并置于37℃，5%二氧化碳，120 r/min的搖床培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和活率，每3 d傳代，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)懸浮環(huán)境，馴化為可全懸浮、無(wú)血清培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞株；細(xì)胞傳代穩(wěn)定并建庫(kù)后，接種PCV2病毒，通過(guò)對(duì)比3株懸浮克隆細(xì)胞培養(yǎng)PCV2病毒含量的差異，篩選1株克隆細(xì)胞，用于生產(chǎn)PCV2；針對(duì)不同種毒（來(lái)源于貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞），摸索感染MOI（0.1、0.2、0.5）及收獲時(shí)間（48、72、96、120h），確定PCV2最佳生產(chǎn)工藝。（1）貼壁細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中，適應(yīng)至第2代時(shí)細(xì)胞即可呈懸浮生長(zhǎng)，連續(xù)傳至11代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，按照1×106/mL接種細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)72h時(shí)細(xì)胞密度可達(dá)到10×106/mL，活率在95%以上，倍增時(shí)間為20h左右；（2）3株懸浮細(xì)胞使用相同條件，分別接種PCV2病毒后，PK15-1C8克隆細(xì)胞的病毒含量可達(dá)到106.4TCID50/mL，克隆PK15-2F11（105.5TCID50/mL）、PK15-1E5（105.6TCID50/mL），3株克隆細(xì)胞病毒含量均高于原克?。?04.7TCID50/mL），但PK15-1C8克隆細(xì)胞的病毒含量更高且更穩(wěn)定，確定為后續(xù)研究用細(xì)胞；（3）使用貼壁細(xì)胞來(lái)源的種毒（106.4TCID50/mL）感染PK15-1C8克隆細(xì)胞后，最優(yōu)工藝為接毒時(shí)細(xì)胞密度1×106/mL，以0.1MOI接毒，接毒后72h收獲，最高病毒含量為106.5TCID50/mL。以來(lái)源于懸浮細(xì)胞的種毒（106.3TCID50/mL）感染細(xì)胞后，病毒含量較貼壁細(xì)胞來(lái)源種毒更高，最高可達(dá)107.3TCID50/mL，其最優(yōu)工藝為接毒時(shí)細(xì)胞密度1×106/mL，以0.2MOI接毒，接毒后72h收獲。通過(guò)對(duì)PK15細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選，馴化懸浮、3株懸浮細(xì)胞接種PCV2后病毒含量的對(duì)比，確定一株病毒含量最高的懸浮細(xì)胞，并以此懸浮細(xì)胞為基礎(chǔ)進(jìn)行PCV2生產(chǎn)工藝摸索，建立了全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的PK15-1C8細(xì)胞增殖PCV2工藝，該工藝首次使用懸浮細(xì)胞擴(kuò)增PCV2病毒為種毒進(jìn)行接毒，最高病毒含量可達(dá)107.3TCID50/mL，可用于工廠化疫苗生產(chǎn)。

PK15細(xì)胞；豬圓環(huán)病毒2型；克隆篩選；懸浮培養(yǎng)

0 引言

【研究意義】豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus diseases, PCVDs）是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要傳染病，其病原為豬圓環(huán)2型（porcine circovirus type 2, PCV2）。PCV2可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥，還與皮炎腎病綜合癥、增生性壞死性肺炎、豬繁殖與呼吸綜合征、仔豬傳染性先天性震顫等多種疾病相關(guān)，但臨床上以多系統(tǒng)衰竭綜合癥最為常見(jiàn)[1-6]，是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的疫情之一[7-8]。豬腎細(xì)胞（PK15）是目前用于PCV2病毒培養(yǎng)的主要細(xì)胞系，用于增殖PCV2和制備豬疫苗。但由于PCV2病毒的編碼區(qū)非常有限，對(duì)宿主細(xì)胞具有高度的依賴性[9]，且在PK15細(xì)胞系不同的細(xì)胞株上增殖的病毒含量不同, 難以達(dá)到制備疫苗的要求[10-12]，是制約PCV2全病毒滅活苗的技術(shù)瓶頸之一。同時(shí)PK15細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)存在需要血清、放大困難和成本高等問(wèn)題，需篩選出一株對(duì)PCV2敏感，且易于放大和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的病毒培養(yǎng)工藝?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PK15細(xì)胞現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒，但由于PCV2毒力弱，且不產(chǎn)生細(xì)胞病變，獲得高病毒含量PCV2難度較大，加之PK15細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)存在血清，而且放大困難，成本高等問(wèn)題，因此PCV2的培養(yǎng)病毒含量高低已成為制約現(xiàn)有疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵瓶頸之一[13-14]。劉俊斌等[15-18]報(bào)道了使用片狀載體和微載體在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)PK15貼壁細(xì)胞并感染PCV2的工藝研究，通過(guò)優(yōu)化微載體使用濃度、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞初始攪拌方式、生長(zhǎng)階段攪拌速度、培養(yǎng)基補(bǔ)給方式、接毒劑量和收獲時(shí)間等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，提高PCV2產(chǎn)量，確定了反應(yīng)器生產(chǎn)PCV2的最佳工藝；彭伍平等[19-21]報(bào)道了通過(guò)篩選貼壁單克隆，找到一株對(duì)PCV2敏感的克隆株，從而提高了PCV2病毒含量；劉天倫等[22-23]報(bào)道了經(jīng)貼壁降血清、低血清懸浮優(yōu)化傳代、無(wú)血清懸浮傳代培養(yǎng)，對(duì)一株貼壁PK15細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)血清全懸浮馴化，并可穩(wěn)定傳代，以期為傳代細(xì)胞系低血清馴化培養(yǎng)及圓環(huán)病毒在低血清培養(yǎng)細(xì)胞上的增殖研究奠定基礎(chǔ)；李雨慈[24]報(bào)道使用昆蟲(chóng)細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)，首次使用懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒病疫苗；郭玲花等[25-28]報(bào)道了豬圓環(huán)病毒2型懸浮培養(yǎng)工藝的研究進(jìn)展，對(duì)目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上PCV2疫苗的制備工藝及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，可利用全懸浮培養(yǎng)工藝培養(yǎng)PK-15細(xì)胞來(lái)增殖PCV2；此外，未見(jiàn)全懸浮培養(yǎng)工藝中以懸浮細(xì)胞制備種毒的研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】篩選出1株P(guān)CV2高產(chǎn)克隆細(xì)胞株，并建立起無(wú)血清全懸浮病毒培養(yǎng)工藝。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，制備出病毒含量高和適合豬圓環(huán)病毒病滅活疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 試驗(yàn)于2018年12月至2019年12月在甘肅健順生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 細(xì)胞株 試驗(yàn)所用細(xì)胞株為PK15（豬圓環(huán)病毒1型及2型陰性）[PK15, PK-15]ATCC? CCL-33?，甘肅健順生物科技有限公司保存。

1.1.3 病毒株 PCV2（豬圓環(huán)2型病毒分離株，PK15貼壁獲得P14病毒，病毒含量106.4TCID50/mL，支原體檢驗(yàn)、BVDV、CSFV、致細(xì)胞病變檢查及紅細(xì)胞吸附性外源病毒檢驗(yàn)均為陰性）由洛陽(yáng)惠中生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.4 主要試劑和耗材 DMEM高糖、CD PK15 259（PK15懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基）、PK15接毒培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA、接毒培養(yǎng)基A、接毒培養(yǎng)基B（以上試劑均由甘肅健順生物科技有限公司提供），F(xiàn)BS（蘭州榮曄生物科技有限公司），PCV2一抗、羊抗鼠二抗（南京華恩生物科技有限公司），熒光顯微鏡（OLYMPUS），Vi-Cell細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

1.2 方法

1.2.1 貼壁PK15細(xì)胞克隆 采用有限稀釋法，將細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第4天于顯微鏡下初步挑選單克隆，每?jī)商祜@微鏡下觀察，保證孔中細(xì)胞為單克隆團(tuán)，將克隆細(xì)胞逐步放大培養(yǎng)。

1.2.2 克隆細(xì)胞株懸浮馴化 待細(xì)胞擴(kuò)大至T225瓶時(shí)，消化，計(jì)數(shù)，離心，采用PK15懸浮生長(zhǎng)培養(yǎng)基CD PK15 259按1.0×106個(gè)細(xì)胞/mL密度重懸細(xì)胞，并于37℃、5%CO2搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)基可正常生長(zhǎng)。

1.2.3 PCV2高產(chǎn)細(xì)胞篩選 待馴化懸浮的PK15-2F11、1E5、1C8細(xì)胞生長(zhǎng)至第3天時(shí)，分別使用PK15接毒培養(yǎng)基A和PK15接毒培養(yǎng)基B將細(xì)胞稀釋至1.0×106個(gè)細(xì)胞/mL，工作體積30mL分別接于125mL搖瓶中，按體積比5%加入PCV2病毒，37℃、5%CO2于搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取樣計(jì)數(shù)，72h后收毒，采用測(cè)定病毒含量。并將收獲病毒液，對(duì)應(yīng)細(xì)胞第二次感染各克隆細(xì)胞。

1.2.4 接毒工藝優(yōu)化 接毒培養(yǎng)基A將培養(yǎng)至第3天的PK15-1C8細(xì)胞稀釋至1.0×106個(gè)細(xì)胞/mL，按0.1、0.2、0.5MOI（PCV2來(lái)源于貼壁細(xì)胞毒）接毒，試驗(yàn)重復(fù)3次，或按0.1、0.2、0.5MOI（PCV2來(lái)源于懸浮細(xì)胞毒）接毒，試驗(yàn)重復(fù)5次，不同時(shí)間段收獲病毒液，測(cè)定病毒含量（表1）。

1.2.5 病毒含量測(cè)定 用含2%血清的DMEM培養(yǎng)基將所取病毒液作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)稀釋度，分別接種在單層PK15細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度接種6孔，100μL /孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組，采用Reed-Müench法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果

2.1 PK15單克隆細(xì)胞馴化懸浮

將挑出來(lái)的4個(gè)單克隆貼壁細(xì)胞及PK15原細(xì)胞株馴化懸浮，成功馴化3株克隆和PK15細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖1所示，PK15、PK15-2F11和1C8 3株細(xì)胞均1代便從貼壁細(xì)胞馴化為懸浮細(xì)胞，且細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，PK15-1E5前5代生長(zhǎng)較慢，6代后細(xì)胞生長(zhǎng)變快漸漸生長(zhǎng)穩(wěn)定。4株細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定之后，3d生長(zhǎng)情況相似，密度幾乎都為10×106個(gè)細(xì)胞/mL，PK15、PK15-2F11、1E5、1C8細(xì)胞倍增時(shí)間為分別為21、21、20和21 h。

2.2 PCV2敏感細(xì)胞株篩選

將PK15細(xì)胞及PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8 4株細(xì)胞感染PCV2（種毒由懸浮細(xì)胞獲得），TCID50結(jié)果如圖2-A所示，3株克隆細(xì)胞毒價(jià)均高于原始細(xì)胞株，PK15-1C8試驗(yàn)組較其他2株克隆細(xì)胞毒價(jià)更高，病毒含量為106.0TCID50/mL，使用接毒培養(yǎng)基A接毒組（PK15-1C8-C1）與使用接毒培養(yǎng)基B接毒組（PK15-1C8-C2）病毒含量無(wú)差異。為了檢測(cè)第一次試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，將第一次所收獲病毒液，對(duì)應(yīng)細(xì)胞株進(jìn)行第二次接毒（圖2-B），3株克隆細(xì)胞感染PCV2后仍然是PK15-1C8更高，是2F11、1E5的10倍，病毒含量維持在106.0TCID50/mL。

表1 接毒工藝優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)

A.PK15細(xì)胞馴化生長(zhǎng)曲線。B.PK15-2F11細(xì)胞馴化生長(zhǎng)曲線。C.PK15-1E5細(xì)胞馴化生長(zhǎng)曲線。D. PK15-1C8細(xì)胞馴化生長(zhǎng)曲線。其中，實(shí)線為細(xì)胞生長(zhǎng)密度曲線，虛線為細(xì)胞活率曲線。淺色線為3種單克隆和PK15貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，深色線條為3種單克隆和PK15細(xì)胞馴化懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

A.PK15、PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8四株細(xì)胞分別感染PCV2后TCID50。B.PK15-2F11、PK15-1E5、PK15-1C8三株細(xì)胞分別對(duì)應(yīng)感染圖A收獲PCV2病毒。其中，C1為使用接毒培養(yǎng)基A接毒實(shí)驗(yàn)組，C2為使用接毒培養(yǎng)基B接毒實(shí)驗(yàn)組。

2.3 接毒工藝優(yōu)化

2.3.1 貼壁細(xì)胞收獲病毒為感染種毒工藝優(yōu)化 如表1所示進(jìn)行試驗(yàn)，不同MOI感染細(xì)胞重復(fù)3次試驗(yàn)后，3種不同MOI感染的細(xì)胞毒價(jià)差異不大均在106.5TCID50/mL左右（表2），因此選取病毒添加較少的0.1MOI接毒。

選取接毒計(jì)量(MOI)為0.1的感染條件，于培養(yǎng)48、72、96、120 h取樣，檢測(cè)病毒含量，綜合3次試驗(yàn)結(jié)果72 h收獲病毒含量lgTCID50/mL較高且更穩(wěn)定。

表2 不同MOI、不同時(shí)間的PCV2感染PK15-1C8病毒含量

2.3.2 懸浮細(xì)胞收獲病毒為感染種毒來(lái)源相關(guān)工藝確認(rèn) 接毒計(jì)量及收毒時(shí)間摸索, 如表3所示，分別按0.1、0.2、0.5MOI將由懸浮PK15細(xì)胞所獲PCV2病毒感染PK15-1C8細(xì)胞，0.2MOI感染后，病毒含量更穩(wěn)定。因此當(dāng)種毒來(lái)源于懸浮細(xì)胞時(shí)，0.2MOI接毒更佳。

以0.2MOI的接毒量，相同試驗(yàn)方法接毒，檢測(cè)48、72、96 h病毒含量。48 h病毒含量低于72與96 h，但72與96 h病毒含量差異不大，從病毒含量和生產(chǎn)的時(shí)間效率考慮，以懸浮細(xì)胞制備的病毒為種毒，接毒量為0.2MOI 72h收獲更佳。

表3 不同MOI、不同時(shí)間的PCV2感染PK15-1C8病毒含量

3 討論

PK15細(xì)胞作為PCV2主要感染細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于PCV2疫苗的生產(chǎn)，但由于PCV2 DNA的合成依賴于細(xì)胞周期S期表達(dá)的酶，隨宿主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制，因此病毒的復(fù)制周期更長(zhǎng)，使得PCV2體外增值能力較差[29-31]。彭伍平等[19-21]通過(guò)對(duì)PK15貼壁細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋后，挑選出的單克隆細(xì)胞表現(xiàn)出了對(duì)PCV2的高敏感性，提示我們可以通過(guò)該方法提高病毒產(chǎn)量，但貼壁細(xì)胞生產(chǎn)放大采用的細(xì)胞工廠或轉(zhuǎn)瓶工藝，勞動(dòng)強(qiáng)度大，可使用的細(xì)胞密度低[18]，而微載體技術(shù)雖然可以有效提高細(xì)胞密度，但仍存在生產(chǎn)成本高等弊端，且血清的使用對(duì)產(chǎn)品的可控性、安全性、批間差產(chǎn)生一定影響[22-23]。而懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可以在較小的空間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度，同時(shí)無(wú)血清培養(yǎng)基的使用，使得細(xì)胞培養(yǎng)成本低、產(chǎn)品可控、重復(fù)性高。因此本文采用有限稀釋法挑選出單克隆細(xì)胞，并將其馴化懸浮，篩選出對(duì)PCV2高敏感的PK15懸浮細(xì)胞，以期解決PCV2在生產(chǎn)中病毒含量低的問(wèn)題。同時(shí)通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，病毒感染時(shí)補(bǔ)料的添加、不同感染MOI及收獲時(shí)間也是影響病毒產(chǎn)量的原因[16,32]，因此在挑選出單克隆懸浮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了工藝優(yōu)化，確定了最佳的病毒感染MOI及收獲時(shí)間。

劉天倫等[22]的研究，通過(guò)貼壁細(xì)胞逐漸降血清，到懸浮細(xì)胞低血清，再到懸浮細(xì)胞無(wú)血清的過(guò)程，經(jīng)過(guò)了23代傳代，將PK15貼壁細(xì)胞馴化為懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞72h最高生長(zhǎng)密度為4.0×106/mL。而本文通過(guò)將貼壁PK15使用有限稀釋法稀釋獲得單克隆細(xì)胞，并從貼壁細(xì)胞含10%血清直接馴化為懸浮無(wú)血清，馴化后第二代即可高密度生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，以3d按1﹕10的比例進(jìn)行擴(kuò)大，生長(zhǎng)密度可達(dá)到10× 106/mL，活率均在95%以上。相較劉天倫[22]等的研究，本文細(xì)胞馴化時(shí)間更短，且馴化懸浮后的細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定倍增時(shí)間短，可大大縮短生產(chǎn)周期，為工業(yè)的放大生產(chǎn)提供有力支持；同時(shí)本文對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行了單克隆篩選，篩選出的克隆細(xì)胞PCV2病毒含量較原克隆從105.0TCID50/mL提高至106.5TCID50/mL，可大大提高PCV2病毒疫苗的生產(chǎn)效率，但該懸浮克隆細(xì)胞PCV2病毒產(chǎn)量仍未達(dá)到理想結(jié)果，因此我們進(jìn)一步進(jìn)行了工藝優(yōu)化。

福州大北農(nóng)與成都天邦開(kāi)發(fā)的DBN-SX07 株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量105.5TCID50/mL以上；武漢中博，科前生物等開(kāi)發(fā)的WH株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量在107.0TCID50/mL以上；江蘇南農(nóng)高科等開(kāi)發(fā)的SH株滅活疫苗，滅活前半成品病毒含量在106.0TCID50/mL以上；哈維科等開(kāi)發(fā)的LG株滅活疫苗,滅活前半成品病毒含量105.5TCID50/mL以上[33]。為了進(jìn)一步提高該P(yáng)CV2敏感克隆懸浮細(xì)胞的病毒產(chǎn)量，針對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行了接毒工藝的摸索，確定了不同種毒（來(lái)源于貼壁細(xì)胞或者懸浮細(xì)胞）來(lái)源接毒MOI及收獲時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用懸浮細(xì)胞種毒、按照0.2MOI接毒72h收獲病毒含量從106.5TCID50/mL提高至107.3TCID50/mL；較傳統(tǒng)貼壁工藝和現(xiàn)有的無(wú)血清培養(yǎng)基工藝[15-17,23]相比，收獲時(shí)間縮短，接毒劑量低且首次接種懸浮細(xì)胞制備的種毒，病毒含量提高了10倍，可提高生產(chǎn)效率，縮短生產(chǎn)周期，同時(shí)整個(gè)生產(chǎn)工藝采用無(wú)血清培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本和純化難度，提高產(chǎn)品質(zhì)量和批間一致性。此工藝經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，確定了工藝的穩(wěn)定性，為后期的PCV2病毒疫苗的研究和生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)細(xì)胞克隆、懸浮馴化、高產(chǎn)細(xì)胞株篩選及PCV2生產(chǎn)工藝摸索，建立了全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的PK15-1C8細(xì)胞增殖PCV2工藝，為疫苗企業(yè)采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)工藝提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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Based on PK15 Cell Line for PCV2 Fully Suspension Culture Process

WANG JiaQi1，DONG YuHong1，JIANG JuLing1，QIAN JianNing1，WEI WenTao1，SONG GuoLiang2，JIAO JinBo2，GUAN XinXin2，JI GuoBiao2，ZHANG YeXin1

1Gansu Jianshun Biotechnology Co., Ltd, Lanzhou 730070;2Luoyang Huizhong Biotech Co.,Ltd., Luoyang 471000, Henan

【】Selected one suspension PK15 cell line which is suitable for PCV2 virus , and then developed the production process for PCV2 vaccines(source of virus, MOI and harvest time ), to provide basic theory and guarantee for large-scale production use suspension culture instead of adherent culture.【】The PK15 primary cells were diluted using the limiting dilution method and seeded in 96-well plates. The cell growth and morphology were observed every 2 days. After 90% of the cells were overgrown, the cells were gradually expanded from 96-well plates to 24-well plates，to 12-well plates, to 6-well plate, and finally to the square flask, three PK15 clones with good morphology that can grow adherently were selected. Three PK15 clones with good morphology that can grow adherently were selected. Three clones (PK15-1C8, 2F11, 1E5) were directly seeding in PK15 serum-free medium at a density of 1×106cells/mL and placed in a shaker incubator at 37 ℃, 5% carbon dioxide, and 120 r/min to continue culture. Monitor the cell density and viability every day, passage every 3 days, make the cells gradually adapt to the suspension environment, the PK15 clone can culture as a fully suspension cell line and can growth well in serum free media. After suspension cells stability passage and cell bank, compared the PCV2 virus content with three suspension clone cells, one clone cell was selected for PCV2 production. For different kinds of viruses (source from adherent cells or suspension cells), explore the infection MOI (0.1, 0.2, 0.5) and harvest time (48, 72, 96, 120h), determine the best production process of PCV2.【】(1)The results showed that when the adherent cells passage to second generation in serum media CD PK15 259, the cells can suspended growth, continuous passage for eleven generation, suspension cells can growth stable, when seeding with 1×106/mL cells, cells can reach 10×106/mL cells when growth at 72h, viability rate is above 95%, and the doubling time is about 20h; (2) The three suspension cells use the same condition to infection PCV2 virus, the virus content of PK15-1C8 cloned cells can reach 106.4TCID50/mL, clone PK15-2F11 (105.5TCID50/mL), PK15-1E5 (105.6TCID50/mL), the virus content of the three cloned cells was higher than that of the original clone (104.7TCID50/mL), however, the virus content of PK15-1C8 cloned cells is higher and more stable, so it is determined as a cell for follow-up research; (3) After infecting PK15-1C8 cloned cells with seed virus (106.4TCID50/mL) from adherent cells, the optimal process is 1×106/mL cell density with 0.1MOI and harvest at 72h the virus content can reach 106.5TCID50/mL. After infecting PK15-1C8 cloned cells with seed virus (106.3TCID50/mL) from suspension cells, the optimal process is 1×106/mL cell density with 0.2MOI and harvest at 72h the virus content can reach 107.3TCID50/mL. 【】Through the monoclonal screening of PK15 cells, adapted to suspension cells compared the PCV2 virus content of 3 suspension cells, a suspension cell with the highest virus content was determined, and based on this suspension cell, explored the process of PCV2 virus, and then established the PCV2 fully suspension, serum-free culture process. The SV15-1C8 cell proliferation PCV2 process of full suspension serum-free culture was established. This process used suspension cells to amplify PCV2 virus for seed poisoning for the first time. The highest virus content can reach 107.3TCID50/mL, which can be used for factory vaccine production. According selection sensitive clones and optimized the process for PCV2, can increase the virus titer, and realizes full suspension culture without serum, improved the production process of PCV2, improve the production efficiency, reduce the cost and improve the quality of the production. This process first use suspension cells to amplify the PCV2 virus. The highest virus content can reach 107.3TCID50/mL, which can be used for large-scale PCV2 virus production.

PK15 cells; PCV2; clone selection; suspension culture

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.017

2020-03-20；

2020-06-30

蘭州市2019年度重點(diǎn)人才項(xiàng)目

王嘉琪，E-mail：wangjiaqi@jianshunbio.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）