張 穎，楊 悅，韋慶慧，趙 敏

(東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

Pseudomonaspaucimobil曾被定義為產(chǎn)黃色素、極性單鞭毛、非發(fā)酵的革蘭氏陰性棒狀桿菌，歸屬為假單胞菌屬(Pseudomonas),其細(xì)胞脂質(zhì)中含有大量獨(dú)特的鞘氨醇脂和2-羥基肉豆蔻酸。而Yabuuchi等[1]研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)具有特殊的膜外成分鞘氨醇，不同于假單胞菌屬，因此被重新定義為新屬。1994年，Takeuchi等[2]報(bào)道Sphingomonas屬于變形菌門(mén)的α亞類(lèi)，是第4組的一部分。Yamamoto等[3]首次在Sphingomonas中發(fā)現(xiàn)了一種新的鞘氨醇脂，結(jié)構(gòu)鑒定為N-2′-羥基肉豆蔻酰二羥鞘氨醇-1-葡萄糖醛酸(SGL-1)。根據(jù)16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，以及細(xì)胞脂質(zhì)中含有SGL-1和2-羥基肉豆蔻酸(發(fā)酵單胞菌中的非羥基肉豆蔻酸)，將其分類(lèi)于一個(gè)新的鞘氨醇單胞菌科。2001年，研究者根據(jù)16S rRNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)化分析，將鞘氨醇單胞菌分為四個(gè)簇，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育、化學(xué)分類(lèi)和生理學(xué)特征提出除Sphingomonas之外的三類(lèi)新屬：Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi，統(tǒng)稱(chēng)為Sphingomonads[4]。這三個(gè)屬的模式菌分別為Sphingobiumyanoikuyae、Novosphingobiumcapsulatum和Sphingopyxismacrogoltabida。不同屬所含多胺類(lèi)型不同，Sphingomonas中主要含同型高亞精胺，Sphingobium、Novosphingobium和Sphingopyxi中主要含亞精胺[5]。

1 鞘氨醇單胞菌的特性

鞘氨醇單胞菌隸屬于鞘氨醇桿菌目的鞘氨醇單胞菌科，需氧，革蘭氏陰性，桿狀，無(wú)芽孢，單鞭毛運(yùn)動(dòng)，能氧化戊糖、己糖和雙糖產(chǎn)酸。該菌接觸酶呈陽(yáng)性，產(chǎn)水溶性類(lèi)胡蘿卜素，使其菌落一般呈黃色，但不產(chǎn)黃單胞菌素。所有菌株可在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中利用H2、O2、CO2等營(yíng)化能自養(yǎng)生活，也可利用葡萄糖等作為碳源營(yíng)化能異養(yǎng)生活[6]。最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，最適pH值為6.5～7.5。鞘氨醇單胞菌除了革蘭氏反應(yīng)、賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧、精氨酸脫水、硝酸氣體和葡萄糖發(fā)酵外，沒(méi)有其它常見(jiàn)的生化特性。

此前鞘氨醇脂曾被認(rèn)為僅是真核生物細(xì)胞膜中的重要成分之一。Bauwens等[7]通過(guò)DNA-RNA雜交技術(shù)證明Flavobacteriumcapsulatum、Flavobacteriumdevoran細(xì)胞膜與鞘氨醇脂有密切關(guān)系，因此將該類(lèi)菌株獨(dú)立于假單胞菌屬分類(lèi)。迄今為止，尚未見(jiàn)其它細(xì)菌物種中含有鞘氨醇脂的相關(guān)報(bào)道，故鞘氨醇脂可作為鞘氨醇單胞菌鑒定的生物化學(xué)標(biāo)志物。這些物種中鞘氨醇脂的出現(xiàn)是確定其生物分類(lèi)位置的重要化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，它們的脂肪酸譜由作為主要脂肪酸的C18∶1ω7c和作為主要羥基化脂肪酸的C14O2-OH組成。它們以泛醌Q-10為主要呼吸道醌，以亞精胺為主要多胺[4]。

近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌能夠利用多種有機(jī)化合物，可在低營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)和繁殖，廣泛存在于自然生境中，包括湖泊、河流、海洋及陸地等[2](表1)。

Kosako等[17]根據(jù)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，對(duì)20株鞘氨醇單胞菌進(jìn)行了表型和抑菌試驗(yàn)，圖1是采用Kirby-Bauer法，利用MuellerHinton培養(yǎng)基Ⅱ和Sensi圓盤(pán)對(duì)36種抗菌藥物的敏感性評(píng)估結(jié)果。

由圖1可知，藥敏試驗(yàn)結(jié)果也各不相同,只有菌株S.macrogoltabidus對(duì)阿莫西林-克拉維酸呈中性，其它菌株對(duì)其皆呈敏感性；所有菌株對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米諾環(huán)素、丁氨卡那霉素均呈敏感性；只有菌株S.ursincola對(duì)慶大霉素、卡那霉素有抗性，其它菌株呈敏感性；菌株S.rosa、S.sanguinis、S.parapaucimobilis、S.macrogoltabidus對(duì)阿莫西林和氨芐西林有抗性；所有菌株均對(duì)甲氧安啶有抗性等。

表1 鞘氨醇單胞菌屬不同種屬信息

2 鞘氨醇單胞菌的應(yīng)用

由于鞘氨醇單胞菌卓越的生物降解和生物質(zhì)合成能力，在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品及工業(yè)生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值[1]。自然分布的某些鞘氨醇單胞菌種類(lèi)與人類(lèi)健康和環(huán)境安全息息相關(guān)[18]。

2.1 鞘氨醇單胞菌的環(huán)境污染物降解作用

2.1.1 對(duì)多環(huán)芳烴的降解

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以線(xiàn)形排列、彎接或簇聚的方式構(gòu)成的一類(lèi)有毒、稠合的苯環(huán)類(lèi)化合物。環(huán)境中的PAHs主要來(lái)源于煤和石油的燃燒，可隨煙塵粒子排入大氣，由于其自身的疏水性及低水溶性，可以迅速融入沉積環(huán)境，造成污染。在人體內(nèi)對(duì)PAHs的代謝過(guò)程中往往伴隨著大量自由基的產(chǎn)生，自由基具有很強(qiáng)的親電性，極易與各種生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致酶失活、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、DNA斷鏈、脂質(zhì)過(guò)氧化等一系列氧化損傷，引發(fā)人類(lèi)呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟等組織器官的疾病[19]。PAHs可被認(rèn)為是影響人類(lèi)健康的主要有機(jī)污染物，危害極大。

圖1 20株鞘氨醇單胞菌對(duì)36種抗菌藥物的敏感性Fig.1 Sensitivity of 20 Sphingomonas strains to 36 antibacterial drugs

研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌對(duì)土壤中萘、聯(lián)苯、間二甲苯及菲類(lèi)等芳香族化合物的降解效果顯著[20-23]，在PAHs生物修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。其中，菲因其具有3個(gè)相連的苯環(huán)而被作為PAHs的代表，可用于評(píng)價(jià)微生物對(duì)PAHs的降解能力。Pinyakong等[24]發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌對(duì)菲類(lèi)物質(zhì)的降解效率較高，并首次在鞘氨醇單胞菌的菲降解產(chǎn)物中分離到了苯并香豆素和l,5-二羥基-2-萘甲酸，證實(shí)了菲可被氫基化雙加氧酶在1,2位攻擊，其后的二元醇產(chǎn)物可在脫氫酶和間位裂解酶的催化下產(chǎn)生2-羥基-1-萘甲酸，經(jīng)水楊酸途徑進(jìn)一步降解[21]。此外，也有研究者提出細(xì)菌可以通過(guò)鄰苯二甲酸鹽途徑降解菲類(lèi)物質(zhì)[25-26]。如Gong等[27]發(fā)現(xiàn)菲與雙加氧酶和脫氫酶氧化反應(yīng)后，最初代謝為1-羥基-2-萘甲酸，繼而轉(zhuǎn)化為1-萘酚，進(jìn)一步反應(yīng)生成水楊酸和鄰苯二酚，后者通過(guò)三羧酸循環(huán)完全礦化[28-29](圖2[19])。

圖2 細(xì)菌降解菲的水楊酸途徑和鄰苯二酚途徑Fig.2 Salicylic acid pathway and catechol pathway for degradation of phenanthrene by bacteria

2.1.2 對(duì)農(nóng)藥殘留物的降解

人工化學(xué)合成的農(nóng)藥具有難降解、有毒等特點(diǎn)，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，破壞生態(tài)平衡，影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

氯乙酰苯胺類(lèi)除草劑(CH)是常用農(nóng)藥之一，對(duì)大豆、棉花或玉米田中的一年生草和闊葉雜草具有顯著的出苗前控制效果。在過(guò)去的幾十年中，CH已成為美國(guó)、歐洲和許多發(fā)展中國(guó)家最受歡迎的除草劑之一，其廣泛使用已引起土壤和地下水的非點(diǎn)源污染，可能引起人類(lèi)或其它動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷[30-31]。

研究[32-33]表明，采用微生物法降解農(nóng)藥殘留物具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保及無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)，已得到廣泛應(yīng)用。Cheng等[34]首次報(bào)道了鞘氨醇單胞菌DC-6對(duì)CH具有有效的降解能力。Chen等[35]對(duì)CH的降解途徑進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌有一個(gè)共同的CH降解途徑，分上游、下游和環(huán)裂三個(gè)途徑(圖3)。菌株DC-6降解CH的上下游途徑是通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移和基因組合進(jìn)行的。在CH降解的上游途徑中，與苯胺基相連的兩個(gè)側(cè)鏈分別脫烷基和酰胺水解。N-脫烷基酶CndABC是一種三組分的Rieske非血紅素鐵加氧酶系統(tǒng)[36]，N-脫烷基后，乙草胺轉(zhuǎn)化為2-Cl-N-(2-甲基-6-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)，CmeH將其酰胺水解為2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)。乙草胺降解的下游途徑由MEA的對(duì)羥基化啟動(dòng)；在菌株中，相應(yīng)的基因被鑒定為雙組分黃素依賴(lài)單加氧酶系統(tǒng)MeaXY。脫氨后，4-OH-MEA自發(fā)或酶法轉(zhuǎn)化為2-甲基-6-乙基對(duì)苯二酚(MEHQ)[37-38]。MEHQ通過(guò)MeaAB羥基化為3-羥基-2-甲基-6-乙基對(duì)苯二酚(3-OH-MEHQ)，這是一種雙組分黃素依賴(lài)性單加氧酶。DC-6利用MEA作為生長(zhǎng)的唯一碳源，表明菌株都存在環(huán)裂生長(zhǎng)途徑。Dong等[38]研究表明，含有meaAB的惡臭假單胞菌KT2440可以利用3-OH-MEHQ作為生長(zhǎng)的碳源。因此，環(huán)切割酶可能不是保守的蛋白質(zhì)。由于3-OH-MEHQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)與羥基喹啉相似，因此在羥基喹啉的基礎(chǔ)上提出了乙草胺降解的環(huán)裂途徑。此外，環(huán)切割途徑的基因并不保守，可能是由細(xì)菌降解羥基喹啉直接進(jìn)化而來(lái)。該研究對(duì)微生物分解代謝途徑提供了新的見(jiàn)解。

圖3 鞘氨醇單胞菌降解CH機(jī)理Fig.3 Mechanism of degradation of CH by Sphingomonas

2.2 鞘氨醇單胞菌提取物的抗氧化衰老作用

生物抗氧化劑是指與可氧化底物相比，當(dāng)其濃度較低時(shí)，可顯著延遲或阻止該底物氧化任何物質(zhì)[39]。抗氧化劑能減弱活性氧的破壞作用，并能減輕或逆轉(zhuǎn)許多表皮毒性的疾病。因此，自由基作用的加強(qiáng)或延長(zhǎng)可以抑制活性氧防御機(jī)制，促進(jìn)對(duì)抗衰老。皮膚中存在各種有效的抗氧化劑，包括抗壞血酸、尿酸、類(lèi)胡蘿卜素和硫氫化物。除了植物和真菌等天然產(chǎn)物中含有抗衰老的活性物質(zhì)可制成生物抗氧化劑外，研究者發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌提取物也具有抗衰老作用[40]。其中，鞘氨醇單胞菌因胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶和氧化酶作用，產(chǎn)生獨(dú)特的類(lèi)胡蘿卜素，具有抗氧化和耐受環(huán)境脅迫作用。

2.2.1 類(lèi)胡蘿卜素的作用

類(lèi)胡蘿卜素是一種輔助的聚光色素，同時(shí)也是一種保護(hù)劑，可以抵御紫外線(xiàn)輻射和氧自由基的毒性影響，廣泛存在于多種細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌和植物中，是最顯著的膜結(jié)合抗氧化劑[41]。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞由于代謝而受到氧化應(yīng)激時(shí)，在細(xì)菌細(xì)胞膜中積累的類(lèi)胡蘿卜素可能會(huì)抑制活性氧，減少氧擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜[42]，從而降低其致死作用。據(jù)報(bào)道，在膜中積累的類(lèi)胡蘿卜素還可能減少雜環(huán)插入的空間，并減少相互作用的程度[43]。另一種假設(shè)是類(lèi)胡蘿卜素對(duì)膜流動(dòng)性有反應(yīng)，這一點(diǎn)有待研究證實(shí)。類(lèi)胡蘿卜素可以防止年齡相關(guān)性黃斑變性和腫瘤的形成，作為藥物具有很好的應(yīng)用前景。目前，類(lèi)胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是從植物組織中提取或化學(xué)合成。因此，類(lèi)胡蘿卜素微生物生產(chǎn)系統(tǒng)的大規(guī)模開(kāi)發(fā)具有很大的市場(chǎng)潛力。

2.2.2 鞘糖脂提取物的作用

衰老的最初階段是通過(guò)持續(xù)激活p53-p21或/和p16-Rb通路，從短暫的細(xì)胞周期停滯發(fā)展到穩(wěn)定的細(xì)胞周期停滯。由此產(chǎn)生的早期衰老細(xì)胞通過(guò)下調(diào)層粘連蛋白B1，從而觸發(fā)廣泛的染色質(zhì)重塑，從而產(chǎn)生衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)。Gervason等[44]發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌提取物可抑制SA-β-半乳糖苷酶的表達(dá)和細(xì)胞周期抑制劑(p21和p16)的表達(dá)，延緩細(xì)胞衰老。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)蛋白聚糖(versican)和原纖維蛋白-1(Fibrillin-1)經(jīng)鞘氨醇單胞菌提取物處理后可使表達(dá)量增加，有效延緩衰老，促進(jìn)細(xì)胞增殖以確保組織修復(fù)和吸水。Carrino等[45]比較了從胎兒到成年和衰老階段的不同年齡組的versican變化，隨著年齡的增加，versican的含量逐漸減少。而且，高含量的versican已被證明可以保護(hù)成纖維細(xì)胞免于凋亡。表明鞘氨醇單胞菌提取物具有促增殖和抗衰老作用。

2.3 鞘氨醇單胞菌與植物互作

Wang等[46]研究了鞘氨醇單胞菌(SaMR12)對(duì)非寄主植物芥菜的影響，發(fā)現(xiàn)在鉻處理下，鞘氨醇單胞菌能在根中定植、聚集并向芽移動(dòng)，提高植株耐鉻能力。與未接種的植株相比，接種鞘氨醇單胞菌后不僅降低了幼苗過(guò)氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量，而且降低了幼苗和根系脯氨酸含量。此外，鞘氨醇單胞菌的接種提高了超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的活性，提高了抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)中脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)的相關(guān)基因表達(dá)水平和催化活性。SOD、POD、CAT和APX均是植物抗重金屬脅迫的重要抗氧化酶[47-48]。在該研究中，鉻暴露提高了芽和根中的SOD和POD活性，降低了芽中的APX活性，在低濃度鉻時(shí)CAT活性升高，高濃度鉻時(shí)CAT活性反而降低。在許多研究中都報(bào)道了類(lèi)似的趨勢(shì)[49-53]。研究表明，用鞘氨醇單胞菌-鉻處理時(shí)影響AsA-GSH抗氧化系統(tǒng)[54]，鉻處理提高了東南紅豆杉根的GSH水平和GR水平[55]。結(jié)果表明，鉻暴露對(duì)GSH含量和GR、DHAR表達(dá)水平有影響，而鞘氨醇單胞菌的接種提高了GSH含量，促進(jìn)了GR、DHAR的表達(dá)。因此，在鉻脅迫下，接種鞘氨醇單胞菌可通過(guò)降低H2O2、MDA和脯氨酸含量，提高抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)AsA-GSH循環(huán)。這些研究為超積累植物內(nèi)生細(xì)菌作為修復(fù)劑在非寄主植物中提高重金屬耐性的潛在應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

3 展望

鞘氨醇單胞菌廣泛存在于自然生境中，與人類(lèi)生活息息相關(guān)，其在降解環(huán)境污染物、抗氧化衰老、與植物互作等領(lǐng)域的研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)。近些年，研究者已初步揭示了鞘氨醇單胞菌提取物在抗氧化方面的作用、對(duì)環(huán)境污染物降解的機(jī)理，證明了微生物應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌在抗氧化、抗重金屬等領(lǐng)域中能發(fā)揮明顯作用，具有開(kāi)發(fā)為微生物菌劑的市場(chǎng)價(jià)值。但原位生物修復(fù)作用、微生物復(fù)合菌劑構(gòu)建和生物安全性等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究闡明。由于該菌是近些年重新分離的新種，關(guān)于該菌細(xì)胞膜內(nèi)含酸性鞘氨醇脂的形成機(jī)制尚不明確，調(diào)控產(chǎn)鞘氨醇脂的基因也還未知，是否借鑒了真核生物基因等問(wèn)題還有待深入研究。鞘氨醇單胞菌耐受高度貧氧環(huán)境，有特殊的代謝機(jī)制，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用上具有獨(dú)特市場(chǎng)價(jià)值，其應(yīng)用前景不可估量。