劉爽，郭雪蓮，鄭榮波，范峰華

1. 云南省高原濕地保護修復與生態(tài)服務重點實驗室，昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學，昆明 650224 3. 國家高原濕地研究中心，昆明 650224

納米材料是指任何一維幾何尺寸處于納米尺度(1～100 nm)，并具有特殊物理和化學性能的材料[1]。由于其特殊的物理化學性質(zhì)，如尺度效應、表面界面效應和量子隧道效應，它們被廣泛使用[2-3]。納米二氧化鈦(TiO2-NPs)是最常見的納米金屬氧化物，在平時的生產(chǎn)應用中無法避免地以各種途徑和方式流入到環(huán)境中[4]。研究表明，美國污泥中TiO2-NPs的含量約為137 mg·kg-1[5]，亞利桑那州污水中TiO2-NPs的含量為181～1 233 μg·L-1[6]。這些進入環(huán)境系統(tǒng)的TiO2-NPs將通過富集影響生物活性，引起潛在的生物毒性和危害生態(tài)環(huán)境等。

由于TiO2-NPs的加入，引起活性氧含量變化，超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫自由基這些活性氧(ROS)通過影響細胞內(nèi)的生理活動，對細胞和基因產(chǎn)生毒性作用[7-9]。目前，已有大量實驗證明TiO2-NPs會對生物產(chǎn)生毒性效應。哺乳動物細胞在不同濃度TiO2-NPs顆粒的作用下會發(fā)生基因突變、姐妹染色單體交換等異?，F(xiàn)象，表明TiO2-NPs會對哺乳動物細胞產(chǎn)生基因毒性[10-12]。其他的一些研究表明，TiO2-NPs也會加速哺乳動物的細胞凋亡，產(chǎn)生細胞毒性[11-13]。植物是生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，在生態(tài)系統(tǒng)中的作用至關重要，同時也是動物和人類的主要食物來源，是毒性物質(zhì)蓄積的起點[14]，植物的生長生理活動與納米顆粒的遷移轉(zhuǎn)化密切相關[15]。目前，關于TiO2-NPs在生物毒性方面的研究主要集中在其對動物的毒害效應，對植物的研究主要為考察TiO2-NPs對植物生長方面的影響，例如，王一翔[16]研究TiO2-NPs對三角褐指藻的毒性效應時發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs對三角褐指藻具有一定的生長抑制作用；蘭麗貞等[17]研究環(huán)境中TiO2-NPs對擬南芥生長及相關基因表達的影響時發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs可以減緩擬南芥種子的萌發(fā)，抑制擬南芥生長。而TiO2-NPs影響植物生長的相關機理鮮見研究報導。

水生植物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分和主要初級生產(chǎn)者，在環(huán)境化學物質(zhì)的積累、代謝等過程中具有不可忽視的作用。浮萍作為一種漂浮水生植物，具有個體小、繁殖快和數(shù)量大等優(yōu)點，廣泛存在于水環(huán)境。TiO2-NPs暴露對浮萍的影響尚不清楚。本研究選取浮萍作為研究對象，研究TiO2-NPs對葉片數(shù)和葉面積、葉綠素含量和酶活性的影響。掌握TiO2-NPs對浮萍生長和生理特征的影響，為納米顆粒對水生植物毒理研究提供理論基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料1.1.1 納米材料

本實驗選取的TiO2-NPs有3種晶型，即銳鈦礦型、金紅石型和P25混合型。本實驗采用的TiO2-NPs購于阿拉丁試劑官網(wǎng)，平均粒徑為21 nm；銳鈦礦型，平均粒徑10～25 nm，親水；金紅石型，25 nm，親水。

1.1.2 浮萍(Lemnaminor)

漂浮植物，褶皺對稱，綠色表面，背面通常淡黃色、或帶綠白色、或為紫色，近圓形、倒卵形或倒卵狀橢圓形；北方和南方省份均有分布，生于稻田、池塘或其他靜水中，經(jīng)常與紫萍(Spirodelapolyrrhiza)混合，在水面上形成一個漂浮群落。

1.2 研究方法

浮萍(Lemnaminor)采集于昆明市撈魚河濕地公園。

預培養(yǎng)：首先用0.05%的NaClO溶液浸泡5 min，然后用去離子水徹底清洗，再加入1/2 STEINBERG總營養(yǎng)液(表1)，培養(yǎng)15 d(恒溫培養(yǎng)箱內(nèi))。pH為5.5±0.2，晝夜溫度比為25 ℃∶25 ℃，晝夜時長比為12 h∶12 h，光照度為200 μE·m-2·s-1，相對濕度為65%。

培養(yǎng)：稱取3種不同晶型的TiO2-NPs各0.2 g分別移入2 L的容量瓶中，用已經(jīng)配好的營養(yǎng)液定容，作為儲備液備用。超聲45 min后稀釋至實驗所需濃度(0、25、50、75和100 mg·L-1，分為記為對照組、T25、T50、T75和T100)，再超聲45 min (200 V，50 kHz)，隨后準確量取300 mL倒入750 mL的培養(yǎng)容器中，每個濃度分別設3個平行組。挑選健康且大小一致的浮萍4株(12葉)放至培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)條件與預培養(yǎng)條件相同，每天攪動3次，每次均勻攪拌至培養(yǎng)液無沉淀物質(zhì)，每24 h更換一次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7 d。測定葉面積、葉片數(shù)、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性。

1.3 實驗測定1.3.1 葉面積和葉片數(shù)的測定

葉片數(shù)測定：將單反相機保持同一高度、同一焦距，每24 h對浮萍進行拍照，分別計數(shù)對照組和處理組的葉片數(shù)。葉面積測定采用Image J 軟件分析。

1.3.2 葉綠素含量的測定

待培養(yǎng)時間結束后取樣(約取葉片0.1 g，加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF))后在4 ℃下避光提取24 h，然后進行離心取上清液，以DMF為對照測定其在波長為647 nm和664.5 nm的吸光度(OD)值[18]。葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量計算公式如下：

m葉綠素a=[12.7×OOD664.5]-[2.79×OOD647]

(1)

m葉綠素b=[20.7×OOD647]-[4.62×OOD664.5]

(2)

m總?cè)~綠素=17.9×OOD647+8.08×OOD664.5

(3)

1.3.3 酶活性測定

SOD活性測定采用NBT光還原法[19]：SOD活性(U·g-1·h-1)=(A0-As)×Vt×60/A0×0.5×mFW×Vs×t

(4)

POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[20]：POD活性(μg·g-1·min-1)=(X-X0)×Vt/mFW×Vs×t

(5)

CAT活性測定采用紫外線吸收法[17]：CAT活性(U·g-1·min-1)=0.1×Vs×t×mFW

(6)

式中：mFW為樣品鮮質(zhì)量(g)；A0為對照組吸光度；As為實驗組吸光度；Vt為提取液總體積(mL)；Vs為測定用提取液體積；t為顯色反應時間；X為測定管四鄰甲氧基苯酚的含量；X0為對照管四鄰甲氧基苯酚的含量。

表1 STEINBERG全營養(yǎng)液成分Table 1 STEINBERG total nutrient contents

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、雙因素方差分析和顯著性檢驗，采用Origin 2018制圖。

2 結果(Results)

2.1 TiO2-NPs輸入對浮萍生長的影響

TiO2-NPs輸入對浮萍葉片數(shù)的影響如圖1(a)所示，T75銳鈦礦型處理組浮萍葉片數(shù)顯著增加(P<0.05)；T25、T50和T75金紅石型處理組浮萍葉片數(shù)均顯著增加(P<0.05)；不同濃度P25混合型處理組浮萍葉片數(shù)均顯著增加(P<0.05)。T25和T50處理組浮萍葉片數(shù)表現(xiàn)為金紅石型和P25混合型高于銳鈦礦型(P<0.05)，T75處理組浮萍葉片數(shù)表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs輸入對浮萍葉面積的影響如圖1(b)所示，不同濃度銳鈦礦型處理組浮萍葉面積均無顯著變化(P>0.05)；T25和T100金紅石型處理組浮萍葉面積均顯著降低(P<0.05)；P25混合型在T75處理組浮萍葉面積顯著增加(P<0.05)。T75處理組浮萍葉面積表現(xiàn)為P25混合型高于金紅石型和銳鈦礦型(P<0.05)，T100處理組浮萍葉面積表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs濃度和晶型均顯著影響浮萍葉片數(shù)和葉面積(P<0.01)；濃度和晶型交互作用顯著影響浮萍葉片數(shù)(P<0.01)(表2)，對浮萍葉面積影響不顯著(P>0.05)。

2.2 TiO2-NPs輸入對浮萍葉綠素含量的影響

TiO2-NPs輸入對浮萍葉綠素a含量的影響如圖2(a)所示，T25銳鈦礦型處理組浮萍葉綠素a含量顯著降低(P<0.05)，T75和T100金紅石型處理組浮萍葉綠素a含量均顯著增加(P<0.05)，不同濃度P25混合型處理組浮萍葉綠素a含量均顯著增加(P<0.05)。T25和T100處理組浮萍葉綠素a含量均表現(xiàn)為銳鈦礦型<金紅石型

TiO2-NPs輸入對浮萍葉綠素b含量的影響如圖2(b)所示，T25和T50銳鈦礦型處理組浮萍葉綠素b含量均顯著下降(P<0.05)，而T75和T100金紅石型處理組浮萍葉綠素b含量均顯著下降(P<0.05)，不同濃度P25混合型處理組浮萍葉綠素b含量均無顯著變化(P>0.05)。T25和T50處理組浮萍葉綠素b含量均表現(xiàn)為銳鈦礦型低于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T100處理組浮萍葉綠素b含量表現(xiàn)為銳鈦礦型>P25混合型>金紅石型(P<0.05)。

圖1 TiO2-NPs對浮萍生長的影響注：T25、T50、T75和T100表示25、50、75和100 mg·L-1 TiO2-NPs；大寫字母表示不同晶型TiO2-NPs處理組的差異顯著性，小寫字母 表示不同濃度TiO2-NPs處理組的差異顯著性；不同字母表示其統(tǒng)計差異達到顯著水平(P<0.05)，下同。Fig. 1 The effect of TiO2-NPs on the growth of Lemna minorNote: T25, T50, T75 and T100 stand for 25, 50, 75 and 100 mg·L-1 TiO2-NPs; the uppercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different crystalline TiO2-NPs, and the lowercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different concentrations of TiO2-NPs; different letters indicate that the statistical difference has reached a significant level (P<0.05); the same below.

圖2 TiO2-NPs對浮萍葉綠素含量的影響Fig. 2 The effect of TiO2-NPs on chlorophyll of Lemna minor

表2 TiO2-NPs對浮萍生長和生理指標影響的雙因素方差分析Table 2 Two-factor analysis of variance on the influence of TiO2-NPs concentration and crystal type on the growth and physiological indexes of Lemna minor

TiO2-NPs輸入對浮萍總?cè)~綠素含量的影響如圖2(c)所示，T25和T50銳鈦礦型處理組浮萍總?cè)~綠素含量均顯著降低(P<0.05)。T25、T50和T100金紅石型處理組浮萍總?cè)~綠素含量均顯著下降(P<0.05)。P25混合型在T25處理組浮萍總?cè)~綠素含量顯著增加(P<0.05)。T25和T50處理組浮萍總?cè)~綠素含量均表現(xiàn)為P25混合型高于銳鈦礦型和金紅石型(P<0.05)，T100處理組浮萍總?cè)~綠素含量表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs濃度、晶型、濃度和晶型交互作用均顯著影響浮萍葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量(P<0.05)。

2.3 TiO2-NPs對浮萍抗氧化酶活性的影響

TiO2-NPs輸入對浮萍SOD酶活性的影響如圖3(a)所示，不同濃度銳鈦礦型處理組浮萍SOD活性均顯著增加(P<0.05)。T50和T100金紅石型處理組浮萍SOD活性均顯著增加(P<0.05)。P25混合型在T50處理組浮萍SOD活性顯著增加(P<0.05)。不同濃度處理組浮萍SOD活性表現(xiàn)為3種晶型均無顯著差異(P>0.05)。

TiO2-NPs輸入對浮萍POD酶活性的影響如圖3(b)所示，不同濃度銳鈦礦型和P25混合型處理組浮萍POD活性均顯著增加(P<0.05)。T50、T75和T100金紅石型處理組浮萍POD活性均顯著增加(P<0.05)。T50和T100處理組浮萍POD活性表現(xiàn)為銳鈦礦型高于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T75處理組浮萍POD活性表現(xiàn)為P25混合型高于銳鈦礦型和金紅石型(P<0.05)。

TiO2-NPs輸入對浮萍CAT酶活性的影響如圖3(c)所示，T75銳鈦礦型處理組浮萍CAT活性顯著增加(P<0.05)。T25金紅石型處理組浮萍CAT活性顯著下降(P<0.05)，T50金紅石型處理組浮萍CAT活性顯著增加(P<0.05)。P25混合型在T50處理組浮萍CAT活性顯著下降(P<0.05)。T25和T75處理組浮萍CAT活性表現(xiàn)為銳鈦礦型高于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T50處理組浮萍CAT活性表現(xiàn)為金紅石型高于銳鈦礦型和P25混合型(P<0.05)。

TiO2-NPs濃度顯著影響浮萍SOD和POD活性(P<0.01)，顯著影響浮萍CAT活性(P<0.05)。TiO2-NPs晶型對浮萍SOD和CAT活性影響顯著(P<0.05)，對浮萍POD活性影響顯著(P<0.01)。濃度和晶型交互作用對浮萍SOD活性影響不顯著(P>0.05)，顯著影響浮萍POD和CAT活性(P<0.01)。

圖3 TiO2-NPs對浮萍酶活性的影響注：SOD表示超氧化物歧化酶；POD表示過氧化物酶；CAT表示過氧化氫酶。Fig. 3 The effect of TiO2-NPs on enzyme activity of Lemna minorNote: SOD stands for superoxide dismutase; POD stands for peroxidase; CAT stands for catalase.

3 討論(Discussion)

3.1 TiO2-NPs對浮萍生長的影響分析

具有不同晶體結構的同種納米材料生物毒性不同。納米顆粒的生物毒性與納米顆粒的顆粒尺寸、比表面積等存在一定關聯(lián)。一般認為，相同納米顆粒的尺寸越小其生物毒性越強[21]。較小尺寸的納米材料可以直接穿透植物細胞壁，因為細胞壁可能會限制>20 nm的納米材料通過[22]。本研究發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型處理均對浮萍生長產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，而金紅石型和P25混合型處理對浮萍生長有促進作用。在成婕等[23]的研究中，銳鈦礦型TiO2-NPs在10、20和40 mg·L-1處理下抑制了斜生柵藻的生長，且文雙喜和王毅力[24]研究發(fā)現(xiàn)20 mg·L-1和100 mg·L-1銳鈦礦型TiO2-NPs均抑制了金魚藻的生長，這與本研究結果一致。這可能是由于銳鈦礦型的粒徑小于金紅石型和P25混合型，較容易通過植物細胞壁進入細胞，同時通過物理阻塞作用使植物細胞壁孔徑變小，從而影響植物細胞的正常生理功能，致使植物生長受到抑制[25]。而金紅石型和P25混合型可能被浮萍細胞識別為生物大分子如蛋白質(zhì)[26]，從而不被細胞排斥，且促進了植物生長。李雅潔等[27]的研究表明，金紅石型TiO2-NPs在5 mg·L-1處理下對斜生柵藻生長有顯著促進作用，可能是由于低濃度毒物的“刺激效應”或稱“興奮效應”所致[28-29]，對植物生長產(chǎn)生促進作用。

3.2 TiO2-NPs對浮萍葉綠素含量的影響分析

葉綠體是活性氧產(chǎn)生和積累的位點[30]，葉綠素是植物光合作用中吸收光能和傳遞光能的重要載體，對植物生長起著十分重要的作用。當植物暴露于納米材料氧化脅迫下，葉綠素a和葉綠素b的含量會降低[31-32]，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度銳鈦礦型處理降低了浮萍葉綠素的含量。已有研究表明，銳鈦礦型TiO2-NPs在40 mg·L-1處理下降低了斜生柵藻葉綠素a的含量[23]，100 mg·L-1銳鈦礦型處理顯著降低普生輪藻葉綠素a含量[33]，這可能是TiO2-NPs脅迫直接破壞植物體內(nèi)生成的解毒物質(zhì)，形成大量的活性氧自由基，這些自由基直接把葉綠素作為靶分子，從而破壞植物生長[34]。武鵬鵬[35]研究發(fā)現(xiàn)30 mg·L-1銳鈦礦型(10～25 nm)處理降低了斜生柵藻葉綠素a的含量，這與本研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加銳鈦礦型處理對浮萍葉綠素b含量抑制作用減弱，可能是濃度處理達到防御系統(tǒng)的刺激閾值時，藻體的防御機制啟動，生成了相應的解毒物質(zhì)[16]。銳鈦礦型TiO2-NPs比金紅石型TiO2-NPs有更強的毒性[36]，本研究中銳鈦礦型處理降低了浮萍葉綠素a含量，而金紅石型處理提高了浮萍葉綠素a的含量，且Hong等[37]的研究也顯示了金紅石型能加快希爾反應FeCy的氧化還原過程，增加了葉綠體活性，這可能是因為TiO2-NPs進入葉綠體，其氧化還原反應會加速電子傳輸和氧的釋放。

3.3 TiO2-NPs對浮萍酶的影響分析

當植物體內(nèi)的ROS積累到一定程度而沒有被及時清除時，ROS便會對植物體造成不可逆的損傷[38-39]。SOD、POD和CAT都是抗氧化酶，當植物體內(nèi)受到氧化脅迫作用時，3種酶會通過協(xié)同作用一起清除植物體內(nèi)多余的ROS，減輕氧化脅迫影響[40]。本研究發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型、金紅石型和P25混合型處理均導致浮萍SOD和POD的活性增強。這是因為TiO2-NPs刺激浮萍細胞產(chǎn)生了更多的ROS，SOD和POD活性受到相應刺激而升高，消除過量的O2-，防止氧化損傷。高嫄[1]的研究結果表明，在濃度為50 mg·L-1的TiO2-NPs處理時，青萍(Lemnaminor)的SOD活性顯著升高，濃度為100 mg·L-1時，青萍SOD酶活性達到最大值，與本研究結果一致。王震宇等[41]的研究結果也表明，金紅石型TiO2-NPs可以使植物體內(nèi)ROS升高、SOD和POD活性增強。已有研究表明，當生物體受到脅迫時，SOD活性增強，而CAT活性降低[42]。本研究中銳鈦礦型T50處理組導致浮萍CAT活性降低，在高嫄[1]的研究中也發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型TiO2-NPs在50 mg·L-1處理下青萍CAT活性下降。本研究結果表明金紅石型和P25混合型處理均降低了浮萍的CAT活性。POD和CAT都是清除過氧化氫的酶，它們作為植物體內(nèi)抗氧化脅迫的第二層防線，POD已經(jīng)清除了過多的過氧化氫，減少了機體內(nèi)過氧化氫的含量，而CAT作用于過氧化氫的機理實質(zhì)上是過氧化氫的岐化，必須有2個過氧化氫分子先后與CAT相遇且碰撞在活性中心上才能發(fā)生反應，所以導致了CAT活性降低?？寡趸傅幕钚圆环€(wěn)定，并隨培養(yǎng)時間而變化。很難證明植物是否可以通過在一定時間使用幾種抗氧化酶來保護自己免受環(huán)境壓力。但是，抗氧化防御酶的活性通常在有機體遇到低水平壓力時增加，而在高壓力條件下降低[43]。