梁昕昕，辛亞平，賈雪，閆興富，魏玉清，趙會(huì)君

北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院國(guó)家民委生態(tài)系統(tǒng)建模及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021

鎘(cadmium, Cd)是一種毒性較強(qiáng)的重金屬，通過(guò)農(nóng)藥化肥等農(nóng)藝措施進(jìn)入土壤，進(jìn)而向植物體內(nèi)遷移，不但影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且可以通過(guò)食物鏈向人體遷移，影響人體健康。Cd在植物體內(nèi)的累積會(huì)導(dǎo)致植物組織器官的形態(tài)改變[1-4]，劉家豪[1]研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd濃度的增加，水稻葉肉細(xì)胞細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞，出現(xiàn)質(zhì)壁分離等現(xiàn)象；胡炎[2]發(fā)現(xiàn)Cd處理下的東南景天莖韌皮部細(xì)胞質(zhì)壁分離，細(xì)胞器變形；韓盼盼[3]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫嚴(yán)重破壞了龍葵葉肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁斷裂，細(xì)胞器受損；李仕友[4]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫的萬(wàn)年青葉片組織明顯被破壞。因此，研究Cd脅迫下植物葉片的形態(tài)組織變化，可以反映出植物對(duì)Cd的耐受適應(yīng)性。Cd在植物體內(nèi)的累積誘導(dǎo)產(chǎn)生并累積了大量的活性氧物質(zhì)，打破了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡機(jī)制，影響著植物體內(nèi)的抗氧化酶即過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性[5-7]。楊葉萍等[8]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下苧麻體內(nèi)的SOD、POD與CAT活性增加與Cd的耐受性呈顯著相關(guān)，因此研究Cd對(duì)植物抗氧化酶活性的影響，有助于揭示植物抗逆生理機(jī)制。

逆境環(huán)境下，氨基酸也參與了植物的抗逆反應(yīng)[9-14]，比如甘氨酸(glycine, Gly)能夠增加植物對(duì)磷鉀的吸收，提高植物的抗逆性，蘇氨酸(threonine, Thr)和丙氨酸(alanine, Ala)能夠抵抗植物根際病害，脯氨酸(proline, Pro)能調(diào)節(jié)植物水勢(shì)，能引起滲透壓下降，精氨酸(arginine, Arg)具有貯藏氮元素營(yíng)養(yǎng)的功能[10-12]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸也參與了植物耐受重金屬的過(guò)程，如具有滲透調(diào)節(jié)能力和重金屬螯合能力的脯氨酸、組氨酸(histidine, His)和植物螯合肽(phytochelatins)，具有清除過(guò)氧化物質(zhì)的谷胱甘肽(glutathione)等與重金屬解毒有重要的關(guān)系，有研究表明Cd能夠改變植物體內(nèi)氨基酸的含量和種類(lèi)[13-14]，Cd會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)脯氨酸大量累積而減輕毒害癥狀，脯氨酸的增加不但可以與重金屬形成脯氨酸螯合物，而且可以保護(hù)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和硝酸還原酶的活性免受鋅(Zn)、Cd的影響，組氨酸能與鎳(Ni)和Zn螯合而降低毒性，還有研究發(fā)現(xiàn)組氨酸增加了酵母菌對(duì)重金屬的耐受能力[15]，銅(Cu)主要與天冬氨酸(aspartic acid, Asp)和蘇氨酸絡(luò)合在一起。半胱氨酸(cysteine, Cys)參與甲硫氨酸(methionine, Met)和谷胱甘肽/植物螯合肽的合成，Cd脅迫能提高擬南芥合成半胱氨酸的能力[16]。

枸杞是寧夏的特色資源植物，但近年來(lái)，由于農(nóng)藥化肥的過(guò)度使用以及土壤污染日益嚴(yán)重，屢有枸杞及枸杞加工產(chǎn)品中重金屬Cd被檢出或者超標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道[17-20]；枸杞是寧夏當(dāng)?shù)刂匾?jīng)濟(jì)樹(shù)種，也因其優(yōu)異的抗逆性能，成為鹽堿地及礦區(qū)修復(fù)的主栽先鋒樹(shù)種，因此研究枸杞Cd脅迫下的葉片解剖結(jié)構(gòu)、抗氧化酶的活性變化和游離氨基酸的分配特征，挖掘氨基酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的功能，將有助于了解枸杞適應(yīng)外源性Cd脅迫和對(duì)Cd解毒的作用機(jī)理。因此本文通過(guò)對(duì)Cd脅迫下枸杞葉片石蠟切片的觀(guān)察、抗氧化酶活性的測(cè)定、游離氨基酸組成及分布的檢測(cè)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)模式的分析，以期揭示枸杞對(duì)Cd耐受的生理及分子機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取生長(zhǎng)健壯、大小基本一致的寧夏枸杞組培快繁苗，移栽在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃，光照時(shí)間12 h，濕度60%，每5 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。待苗子長(zhǎng)至10 cm高時(shí)，進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 枸杞幼苗的處理

經(jīng)過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，以1個(gè)月內(nèi)寧夏枸杞幼苗的生長(zhǎng)及生理變化情況為例，100 μmol·L-1的Cd脅迫下，枸杞生理及形態(tài)變化明顯而不出現(xiàn)嚴(yán)重致死表型，因此本實(shí)驗(yàn)選取生長(zhǎng)健康、大小一致的枸杞幼苗54株，分別配制含0 μmol·L-1和100 μmol·L-1CdCl2的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，每個(gè)處理9株，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 枸杞葉片組織石蠟切片、染色及觀(guān)察

選取無(wú)Cd處理和Cd處理后第72小時(shí)、第144小時(shí)的枸杞幼苗的成熟葉片，于FAA固定液中固定過(guò)夜，固定后的材料依次置于75%、85%、95%、95%和100%的乙醇中脫水1 h，脫水后的材料經(jīng)二甲苯溶液透明后浸蠟包埋。蠟塊用石蠟切片機(jī)切成厚度約為8 μm的切片，采用番紅-固綠進(jìn)行二重染色，用中性樹(shù)膠封片，具體步驟可參考Deng等[21]的植物石蠟切片技術(shù)。

將制成的石蠟切片放在光學(xué)顯微鏡下用20×目鏡觀(guān)察拍照，并測(cè)定葉片柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)度、海綿組織細(xì)胞長(zhǎng)度，為了體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，分別選取3株枸杞幼苗相同部位切片測(cè)量每項(xiàng)指標(biāo)，計(jì)算平均值，用Graphpad軟件進(jìn)行顯著性和方差分析。

1.2.3 枸杞苗葉片中SOD、POD和CAT酶活性的測(cè)定

選取長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的水培枸杞苗，在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中分別設(shè)置3種不同濃度梯度的CdCl2(0、100和200 μmol·L-1)，每個(gè)處理重復(fù)3組，于處理第24小時(shí)、第48小時(shí)和第72小時(shí)取樣，分別稱(chēng)取每個(gè)處理的新鮮成熟葉片各0.5 g，用加入5 mL酶提取液在冰浴研缽中研磨均漿，于4 ℃、11 400 r·min-1離心20 min，吸取的上清液即為酶粗提液。SOD、POD和CAT的活性參考Huang等[22]的方法測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3次，得到的數(shù)據(jù)用Graphpad軟件進(jìn)行顯著性和方差分析。

1.2.4 枸杞幼苗氨基酸含量的測(cè)定

枸杞幼苗經(jīng)0 μmol·L-1和100 μmol·L-1Cd處理72 h后，分別取地上部莖、葉組織，每個(gè)處理重復(fù)取樣3次，每次重復(fù)取3株苗，液氮速凍后用于組織中游離氨基酸含量的測(cè)定。

稱(chēng)取一定量的樣品于EP管中，加入1 000 μL提取液(V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)為2∶2∶1，含400 nmol·L-1內(nèi)標(biāo)混合液，-20 ℃)，渦旋30 s混勻并研磨處理，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min后取80 μL上清液至LC進(jìn)樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析，另取上清稀釋10倍后4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取80 μL上清液至LC進(jìn)樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析，本項(xiàng)目使用Agilent 1290 Infinity Ⅱ series (Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離，液相色譜A相為1%甲酸水溶液，B相為1%甲酸乙腈，柱溫箱溫度為35 ℃，樣品盤(pán)設(shè)為4 ℃，進(jìn)樣體積為1 μL，流速0.2～0.4 mL·min-1。所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及目標(biāo)化合物定量分析工作，均通過(guò)Agilent MassHunter Work Station Software (B.08.00, Agilent Technologies)來(lái)完成。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及氨基酸代謝、合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的篩選

選取生長(zhǎng)健康、大小一致的枸杞幼苗，以無(wú)Cd處理的幼苗為對(duì)照，經(jīng)100 μmol·L-1的Cd處理12 h和48 h后，收集對(duì)照和各處理的葉片組織，液氮速凍后用干冰輔助保存運(yùn)輸?shù)缴钲谌A大公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。所獲得的數(shù)據(jù)利用GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)攸c(diǎn)篩選參與氨基酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝相關(guān)的基因并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的表達(dá)變化模式

1.2.6.1 枸杞組織中RNA的提取及cDNA的合成

取生長(zhǎng)大小一致的枸杞幼苗，經(jīng)100 μmol·L-1的CdCl2處理，于處理后的第0小時(shí)、第2小時(shí)、第8小時(shí)、第12小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)和第72小時(shí)取成熟葉片組織，液氮速凍后用于RNA的提取。每0.1 g枸杞組織于液氮中充分研磨后，加入1 mL invitrogen trizol試劑，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟提取總RNA，用甲醛變性膠檢測(cè)RNA的完整性，取1 μg總RNA經(jīng)DNaseI (Thermo Fisher Scientific, USA)處理后，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。

1.2.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

為進(jìn)一步研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝相關(guān)基因在Cd脅迫下的表達(dá)變化情況，篩選了6個(gè)相關(guān)基因，引物采用primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)，采用美國(guó)MX3000pTMqPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以寧夏枸杞的β-actin基因作為內(nèi)參基因[23]，SYBR Green Universal Master mix kit (Toyobo, Osaka, Japan)為熒光染料，模板為稀釋20倍的cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，(95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s)，每個(gè)基因設(shè)置3組重復(fù)，45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，所需引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd對(duì)枸杞幼苗葉片顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，與對(duì)照相比，隨著Cd處理時(shí)間的增加，枸杞葉片上表皮細(xì)胞逐漸致密，細(xì)胞變小。100 μmol·L-1Cd處理第72小時(shí)時(shí)，柵欄組織細(xì)胞的長(zhǎng)度平均在70.93～85.59 μm左右，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.0001)；處理第144小時(shí)時(shí)，柵欄組織細(xì)胞的長(zhǎng)度平均在51.27～77.41 μm，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.0001)。此外，海綿組織的細(xì)胞也在變小，100 μmol·L-1Cd處理第72小時(shí)時(shí)，海綿組織細(xì)胞長(zhǎng)度大約在64.25～71.88 μm，與對(duì)照相比差異不顯著(P>0.05)；處理第144 小時(shí)時(shí)海綿組織細(xì)胞的長(zhǎng)度平均在52.92～60.78 μm，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.0001)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物Table 1 The primers for qRT-PCR

圖1 不同處理時(shí)間下鎘(Cd)對(duì)枸杞葉解剖結(jié)構(gòu)的影響注：E表示表皮細(xì)胞，P表示柵欄組織，S表示海綿組織；**、***、****表示與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平(P<0.01、P<0.001、P<0.0001)； (a)未處理的葉片解剖結(jié)構(gòu)圖(×20)，(b)Cd處理72 h的葉片解剖結(jié)構(gòu)圖(×20)，(c)Cd處理144 h的葉片解剖結(jié)構(gòu)圖(×20)， (d)Cd處理后葉片柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)度，(e) Cd處理后葉片海綿組織細(xì)胞長(zhǎng)度。Fig. 1 Effects of cadmium (Cd) on anatomical structure of Lycium barbarum L. leaves under different treatment timeNote: E represents epidermis; P represents palisade parenchyma; S represents spongy parenchyma; **denotes P<0.01, ***denotes P<0.001 and ****denotes P<0.0001, compared with the control (CK); (a) Anatomical structure of untreated leaves (×20 magnification); (b) Anatomical structure of leaves treated with Cd for 72 h (×20 magnification); (c) Anatomical structure of leaves treated with Cd for 144 h (×20 magnification); (d) Cell length of palisade tissue of leaves treated with Cd; (e) Cell length of spongy tissue of leaves treated with Cd.

2.2 抗氧化酶活性變化

如圖2所示，隨著Cd脅迫濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性呈現(xiàn)上升—下降—上升的趨勢(shì)，與對(duì)照相比，在第72小時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.01)；POD活性整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在受200 μmol·L-1Cd處理的第48小時(shí)，與對(duì)照組差異已達(dá)到顯著水平(P<0.01)；SOD活性在第24小時(shí)隨著Cd脅迫濃度的增加有下降的趨勢(shì)，但并不顯著，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯的上升趨勢(shì)，與對(duì)照相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.01)。數(shù)據(jù)表明在Cd脅迫早期，CAT、POD和SOD參與了枸杞對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。

2.3 Cd脅迫對(duì)枸杞不同組織中游離氨基酸含量的影響

如表2所示，與對(duì)照相比，經(jīng)100 μmol·L-1的CdCl2處理72 h后，葉片和莖段中的氨基酸含量發(fā)生了一些改變，葉片中氨基丁酸、脯氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和丙氨酸等含量上升，與對(duì)照相比，氨基丁酸和脯氨酸含量上升達(dá)到顯著水平(P<0.05)，瓜氨酸和丙氨酸含量上升達(dá)到顯著水平(P<0.01)，葉片中谷氨酸含量也上升，但不顯著；而部分氨基酸的含量卻顯著下降，如纈氨酸下降達(dá)顯著水平(P<0.05)、精氨酸與賴(lài)氨酸下降達(dá)顯著水平(P<0.001)、絲氨酸下降達(dá)顯著水平(P<0.01)；在莖段中，苯丙氨酸、纈氨酸和組氨酸下降達(dá)到顯著水平(P<0.01)，甘氨酸、天門(mén)冬氨酸和精氨酸下降達(dá)到顯著水平(P<0.05)，蘇氨酸和谷氨酰胺下降達(dá)到顯著水平(P<0.001)，而脯氨酸的含量卻顯著增加(P<0.01)，在短期脅迫下枸杞不同組織中的氨基酸含量都發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明Cd脅迫影響了枸杞苗體內(nèi)的氨基酸代謝與合成。

圖2 不同處理時(shí)間、不同Cd濃度對(duì)枸杞酶活性的影響注：*、**表示與對(duì)照相比達(dá)到顯著水平(P<0.05、P<0.01)。Fig. 2 Effects of different concentrations of Cd on the enzyme activity of Lycium barbarum L. under different treatment timeNote: *, **denote P<0.05, P<0.01, compared with the control (CK).

表2 氨基酸在莖葉中的含量Table 2 The amino acid contents in leaf and stem tissues (nmol·g-1)

2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中氨基酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的篩選及其注釋

以無(wú)Cd脅迫的幼苗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為對(duì)照，在Cd脅迫第12小時(shí)、第48小時(shí)的根系和葉片中，分別篩選到了一些參與氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及合成代謝的相關(guān)基因，并利用Mev軟件對(duì)這些基因進(jìn)行了熱圖聚類(lèi)分析，如圖3、表3和表4所示。在葉片及根系中高效表達(dá)的基因主要有部分氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、氨基酸通透酶、轉(zhuǎn)氨酶等，而另外一些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)氨酶和合成酶卻呈現(xiàn)抑制狀態(tài)，這可能受氨基酸種類(lèi)的影響。

2.5 基因的表達(dá)模式分析

如圖4所示，AMT基因在Cd脅迫下的第72小時(shí)表達(dá)量達(dá)到顯著水平(P<0.01)，是對(duì)照的2.6倍，BAD基因在脅迫第2、12、24和48小時(shí)表達(dá)倍數(shù)達(dá)到顯著水平(P<0.05、P<0.01)，GST基因在脅迫的第12小時(shí)表達(dá)倍數(shù)達(dá)為對(duì)照的40倍，達(dá)到顯著水平(P<0.01)；NAT基因表達(dá)也受Cd的誘導(dǎo)，在處理第12、48小時(shí)達(dá)到顯著水平(P<0.001)，分別是對(duì)照的10倍和15倍。而PAP基因在脅迫的第8小時(shí)為對(duì)照的4.5倍，達(dá)到顯著水平(P<0.001)，之后表達(dá)水平回落，TAT的表達(dá)在第8、12和24小時(shí)也有所上升，但是表達(dá)不顯著。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，這些參與氨基酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)與合成的基因，都受到Cd的脅迫而上調(diào)表達(dá)，參與了Cd脅迫下氨基酸的代謝合成及轉(zhuǎn)運(yùn)。

3 討論(Discussion)

近年來(lái)，關(guān)于植物在Cd脅迫下生長(zhǎng)與代謝的研究已成為植物逆境生理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Cd是重金屬，在植物體內(nèi)的累積量越多，對(duì)植物的影響越大[24]。已有研究表明，為了降低脅迫對(duì)植物造成的損傷，減少植物體內(nèi)水分的散失，提高植物的抗脅迫能力，葉片表皮細(xì)胞會(huì)致密化[25]，葉肉組織細(xì)胞也會(huì)皺縮[26]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著Cd脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，植物葉片的表皮細(xì)胞逐漸致密化，柵欄組織細(xì)胞與海綿組織細(xì)胞不斷縮小，這一結(jié)果與劉來(lái)[27]的研究發(fā)現(xiàn)基本一致，因此我們推測(cè)枸杞葉片細(xì)胞的縮小與致密化可能會(huì)提高枸杞對(duì)Cd的耐受性。

表3 葉片中篩選的氨基酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Table 3 The genes related to amino acid metabolism and transport selected from leaf

表4 根系中篩選的氨基酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Table 4 The genes related to amino acid metabolism and transport selected form root tissue

重金屬會(huì)誘導(dǎo)植物生成大量的活性氧，而抗氧化酶則會(huì)清除活性氧，抵抗重金屬對(duì)植物的毒害作用[28]，因此在一定程度上抗氧化酶活性的高低可反映植物對(duì)重金屬的耐受能力。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞中CAT和SOD酶活性在處理第48小時(shí)時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，有文獻(xiàn)報(bào)道，CAT和SOD是金屬酶，Cd在一定程度上會(huì)替換金屬酶的金屬離子，導(dǎo)致酶活性下降[29]，但是CAT、SOD和POD總體上呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這一研究結(jié)果與李仕友[4]的研究結(jié)果較一致，說(shuō)明Cd脅迫早期，枸杞能保持較高的抗氧化酶活性，從而對(duì)Cd脅迫產(chǎn)生一定的耐受性。

有研究表明，嚴(yán)重的逆境脅迫會(huì)顯著影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與水解系統(tǒng)，即蛋白質(zhì)會(huì)趨向水解，而合成降低。降解后的游離小分子物質(zhì)或氨基酸在滲透調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)保護(hù)和代謝調(diào)控方面的作用和意義也越來(lái)越受到重視[10]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)脯氨酸含量的增加與重金屬脅迫有顯著的相關(guān)性[12-13]，脯氨酸不但可以調(diào)控植物適應(yīng)由于重金屬脅迫造成的水分缺乏，清除氧化自由基，而且還可以通過(guò)調(diào)控氣孔關(guān)閉來(lái)限制重金屬離子的轉(zhuǎn)移[26-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞幼苗的莖葉在受到Cd脅迫后第72小時(shí)，脯氨酸均有顯著累積趨勢(shì)，暗示脯氨酸在Cd脅迫下可能起到重要的調(diào)控作用。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道可知，外源氨基丁酸的浸泡處理可以顯著性提高植物種子萌發(fā)期POD和CAT的活性及發(fā)芽指數(shù)[33]，也可以促進(jìn)鹽脅迫下白刺葉片的光合參數(shù)[34]，表明氨基丁酸能顯著性提高植物體內(nèi)POD和CAT活性，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，Cd脅迫誘導(dǎo)了枸杞葉片中氨基丁酸含量顯著增加(P<0.05)，因此推測(cè)這可能與葉片對(duì)Cd的耐受性相關(guān)。丙氨酸在葉片中的含量顯著增加(P<0.01)，由于丙氨酸能增加葉綠素的合成，調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)放，對(duì)逆境有一定的抵抗作用[11]，因此，可能是Cd脅迫下枸杞葉片的一種保護(hù)措施。瓜氨酸具有通過(guò)一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸生成一氧化氮(NO)的功能，而NO具有減緩逆境脅迫對(duì)質(zhì)膜的傷害，促進(jìn)脯氨酸的累積，提高抗氧化活性等功能[35]，因此推測(cè)葉片中瓜氨酸含量顯著增加間接提高了植物對(duì)逆境的適應(yīng)性，而游離狀態(tài)的組氨酸卻在莖稈中顯著下降，究竟是由于組氨酸與重金屬形成絡(luò)合物而導(dǎo)致含量下降，還是其他的原因，需要進(jìn)一步的研究。

逆境脅迫還會(huì)引起植物體內(nèi)氨基酸的分配和轉(zhuǎn)運(yùn)，ATF(amino acid transporter family)和APC(amino acid polyamine and choline transporters)家族的基因是目前研究報(bào)道的植物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究結(jié)果充分證實(shí)了部分氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(如NAT、TAT、PTS和PAP)對(duì)Cd的響應(yīng)，可能參與了Cd脅迫下相關(guān)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)是位于細(xì)胞膜上與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的載體蛋白，將AAP基因轉(zhuǎn)入玉米中后能顯著增加玉米籽粒中游離氨基酸含量，提高植物對(duì)氮素的利用效率[36]，AAP基因不但在莖葉中高效表達(dá)，而且還參與了莖和根的發(fā)育[37]，本研究通過(guò)熱圖聚類(lèi)發(fā)現(xiàn)，一些氨基酸通透酶的表達(dá)量顯著增加，實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了PAP基因受Cd調(diào)控而上調(diào)表達(dá)，這些基因的表達(dá)，可能會(huì)提高Cd脅迫下枸杞對(duì)氮素的利用效率。

總之，由于Cd脅迫下枸杞葉片組織細(xì)胞的致密與縮小減少了水分子蒸發(fā)，保持著較強(qiáng)的抗氧化酶活性、同時(shí)在莖葉中大量累積參與Cd解毒和螯合作用的脯氨酸、氨基丁酸、瓜氨酸和丙氨酸等氨基酸來(lái)調(diào)節(jié)地上部對(duì)Cd的耐受性，在期間，一些氨基酸通透酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在氨基酸吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)分配中起到重要作用，這些措施可能是枸杞Cd脅迫下的重要保護(hù)機(jī)制。