熊珍珍，畢永紅

1. 中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室，武漢 430072 2. 中國科學院大學，北京 100049

剛毛藻(Cladophora)隸屬于綠藻門(Chlorophyta)、剛毛藻屬(CladophoraKütz.)，是一種大型絲狀綠藻，細胞多呈核管狀，植物體為分枝或不分枝絲狀體，分布廣泛，在全球范圍內(nèi)的淡水水體和海水水體中均有分布[1]，在自然水體中，剛毛藻的生長一般遵循雙季節(jié)模式，在春季3月開始快速生長和增殖，夏季6月左右生物量達到最大，此后生物量會減少，但是到了秋季9月左右，又會重新生長[2]。環(huán)境條件適宜的情況下，剛毛藻會快速生長和繁殖，形成剛毛藻水華，這種現(xiàn)象在諸多水域中均有發(fā)生[3-4]。剛毛藻過度增殖會大量消耗水體中營養(yǎng)物質(zhì)，影響其他水生生物生長。藻體過度增殖和死亡后腐爛分解，影響水體中氧氣的動態(tài)平衡，產(chǎn)生有害物質(zhì)，導致水質(zhì)惡化，對養(yǎng)殖水體和飲用水等產(chǎn)生嚴重影響[5-6]。因此，如何有效控制剛毛藻的過度增殖成為目前水生生態(tài)系統(tǒng)的一個關(guān)注焦點。

酚酸類物質(zhì)是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，也是研究最多、被證實是化感活性較強的一類物質(zhì)[7]，對多種藻類生長具有較強的抑制效果[8-9]。且酚酸類物質(zhì)作為植物的次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)簡單，能在自然條件下被降解，不易在生態(tài)系統(tǒng)中積累，生態(tài)安全性較好[10]。Nakai等[11]從狐尾藻中分離出的鞣花酸、沒食子酸、焦性沒食子酸和(+)-兒茶素幾種酚酸類化感物質(zhì)，對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)均具有明顯的抑制效果。張庭延等[12]發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸和阿魏酸均對水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)具有明顯的抑制作用。目前，酚酸類化感物質(zhì)對藻類的抑制研究主要集中在銅綠微囊藻、水華魚腥藻和蛋白核小球藻等水華藻類，對剛毛藻這種大型絲狀綠藻的抑制研究鮮有報道。

水楊酸(salicylic acid, SA)，即鄰羥基苯甲酸，是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚酸類化合物，廣泛存在于高等植物[13]，也是藥物與個人護理品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)的一種重要組成成分，會通過各種人類活動進入到水體中。我國東江檢測到的20種PPCPs藥物中，水楊酸最高濃度達1 000 ng·L-1以上，廣州珠江三角洲河水中普遍檢出濃度為2 098 ng·L-1。已有研究顯示，水楊酸通常在自然水體中易發(fā)生降解，如光降解行為[14]。因此在水環(huán)境中不易積累，生態(tài)安全性良好。前人的研究表明，水楊酸能抑制多種藻類生長，對銅綠微囊藻和蛋白核小球藻混合體系具有一定抑制作用，半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為64.9 mg·L-1[15]。當水楊酸濃度為70～100 mg·L-1時，顯著抑制池塘水華混合藻類的生長[16]。吳安平等[17]的研究表明，0.6 mmol·L-1的水楊酸能有效抑制水華魚腥藻的生長繁殖。馬艷芝和王向東[18]研究不同除藻劑對青苔去除效果，發(fā)現(xiàn)0.4 g·L-1的水楊酸對青苔的去除效果最佳。濃度高于12 mg·L-1的水楊酸處理會抑制擬微綠球藻(Nannochloropsissp.)生長，2.5～40 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，水楊酸對三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)均具有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯[19]，50 mg·L-1外源水楊酸能明顯降低龍須菜(Gracilarialemaneiformis)的生長速率[20]，表明其具有開發(fā)成生物殺藻劑的巨大潛能。本研究根據(jù)前期的初步篩選試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)水楊酸對剛毛藻表現(xiàn)出良好的抑制效果，因此開展其對剛毛藻的抑制試驗，并初步探討其作用機理，以期為水楊酸作為抑制劑控制剛毛藻的過度增殖提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

水楊酸購自中國國藥有限公司，分析純，純度>99.5%。實驗開始前將水楊酸配成一定濃度的母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。剛毛藻采自武漢市東湖綠道沿岸，經(jīng)形態(tài)學鑒定為寡枝剛毛藻(C.oligoclona)。取回實驗室后，先用自來水清洗數(shù)遍，挑選去除變老發(fā)黃的部分，于室內(nèi)預(yù)培養(yǎng)5 d后進行實驗，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光暗比12 h∶12 h，日光燈照射。

1.2 試驗處理

將預(yù)培養(yǎng)后的剛毛藻用自來水沖洗后，參照郭亮亮等[21]的方式獲取剛毛藻鮮質(zhì)量，剛毛藻初始濃度為(4±0.1) g·L-1(鮮質(zhì)量)，稱好的藻體放入1 L燒杯中，于人工氣候光照培養(yǎng)箱(PGX-350B，寧波萊福)中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照度40 μmol·m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h，每天定時調(diào)換燒杯在培養(yǎng)箱中的位置，使藻體受光均勻。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置水楊酸濃度梯度分別為0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 g·L-1，對照組用蒸餾水代替水楊酸溶液。每個處理(含對照組)設(shè)置3個平行，實驗周期為96 h。每隔24 h，取樣測定剛毛藻細胞葉綠素a(Chla)含量。用概率單位-濃度對數(shù)法計算96 h-EC50。以Chla含量的變化評估水楊酸對剛毛藻生長的抑制情況。抑制率(IR)按照公式計算：

IIR(%)=(1-N/N0)×100

式中：IIR表示抑制率，N0為對照組剛毛藻細胞Chla含量；N為水楊酸處理組剛毛藻細胞Chla含量。

1.3 指標測定

Chla含量的測定采用丙酮萃取-分光光度法，參照張志良[22]的方法，取(2±0.1) mg(鮮質(zhì)量)剛毛藻，采用90%丙酮研磨破碎細胞后，轉(zhuǎn)移至離心管中，于4 ℃浸提24 h后，3 000 r·min-1離心10 min后，取上清，采用紫外分光光度計(UV-1206，Shimadzu，日本)測定750、663、645和630 nm波長下的吸光值，參照公式計算Chla的含量：

mChl a(mg·g-1)=11.64(OOD663-OOD750)-2.16(OOD645-OOD750)+0.1(OOD630-OOD750)×B稀釋倍數(shù)

式中：mChl a表示Chla的含量，OOD750、OOD663、OOD645和OOD630表示750、663、645和630 nm波長下的吸光值，B稀釋倍數(shù)表示稀釋倍數(shù)。

利用植物效率分析儀(Handy PEA，Hansatech，英國)測定PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)，測樣前，樣品經(jīng)暗處理15 min后，于室溫黑暗條件下測定；超氧化物歧化酶活性(SOD)、過氧化物酶活性(POD)和蛋白含量采用南京建成公司相應(yīng)試劑盒測定；丙二醛(MDA)含量的測定參照硫代巴比妥酸比色法；細胞顯微結(jié)構(gòu)采用Nikon研究顯微鏡(Ni-U，Nikon，日本)在40×物鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1軟件(https://www.originlab.com)制圖，統(tǒng)計分析采用SPSS 25.0(IBM，USA)，對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，若有顯著差異則進行LSD多重比較來檢驗組間差異顯著性，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 水楊酸對Chl a含量的影響

水楊酸處理對剛毛藻細胞Chla含量影響如圖1所示。對照組Chla含量起初維持在穩(wěn)定水平，48 h后開始上升。與對照組相比，在試驗濃度范圍內(nèi)(0.2～0.4 g·L-1)，各處理組Chla含量均在初始24 h暴露時下降，且處理組濃度越高，其下降趨勢越明顯。隨處理時間延長，暴露96 h，各水楊酸處理組的Chla含量明顯低于對照組(P<0.05)，且水楊酸處理組濃度越高，剛毛藻細胞內(nèi)Chla含量越低，呈明顯劑量依賴關(guān)系。

2.2 水楊酸對生長的影響

水楊酸對剛毛藻生長的抑制率如表1所示。結(jié)果表明，水楊酸處理24 h，各濃度處理組對剛毛藻的

圖1 不同濃度水楊酸對剛毛藻細胞 葉綠素a(Chl a)含量的影響Fig. 1 Effect of salicylic acid at different concentration on chlorophyll a (Chl a) content of C. oligoclona

生長均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，且水楊酸濃度越高，抑制效果越明顯。暴露24 h，對剛毛藻的抑制率為3.42%～27.40%，經(jīng)過96 h暴露，抑制率升高至34.95%～73.64%，表明其抑制效果會隨處理時間的延長而增強。高濃度組0.4 g·L-1水楊酸處理對剛毛藻的抑制率最高，暴露96 h抑制率可高達73.64%。如表2所示，采用概率單位-濃度對數(shù)法計算得出，水楊酸對剛毛藻96 h-EC50為0.262 g·L-1。

2.3 水楊酸對葉綠素熒光活性的影響

如圖2所示，不同濃度水楊酸處理對剛毛藻PSⅡ的Fv/Fm具有顯著影響。對照組Fv/Fm始終保持在相對穩(wěn)定的水平，其值在0.73左右。水楊酸處理24 h，各濃度處理組的剛毛藻細胞Fv/Fm均顯著下降(P<0.01)，僅為對照組的1.37%～2.6%。這表明剛毛藻PSⅡ?qū)λ畻钏岬谋┞妒置舾?。隨處理時間延長，各濃度處理組之間剛毛藻的Fv/Fm差異不顯著(P>0.05)，均穩(wěn)定在較低水平，但各個處理組的Fv/Fm均顯著低于對照組(P<0.01)。

2.4 水楊酸對MDA含量的影響

不同濃度水楊酸對剛毛藻MDA含量的影響如圖3所示，隨水楊酸處理濃度的增加，MDA含量逐漸升高。最高濃度0.4 g·L-1處理時，MDA含量顯著增加，為對照組的4.5倍，顯著高于對照組(P<0.01)。MDA是衡量膜脂過氧化的一個指標，可反映藻細胞膜脂過氧化程度。結(jié)果表明，濃度為0.2～0.4 g·L-1水楊酸處理剛毛藻時，水楊酸濃度越高，對藻細胞膜系統(tǒng)損傷程度越高，膜系統(tǒng)通透性受到破壞。

2.5 水楊酸對抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的影響

不同濃度水楊酸暴露96 h后剛毛藻細胞SOD和POD活性如圖4(a)和圖4(b)所示。結(jié)果表明，各濃度處理組SOD活性均與對照組有顯著差異(P<0.01)。0.2 g·L-1處理96 h，SOD活性為對照組的34.76%，SOD活性顯著降低(P<0.01)，0.35～0.4 g·L-1處理，SOD活性僅為對照組活性的31.77%～32.77%。剛毛藻POD活性對水楊酸暴露十分敏感，各濃度處理組POD活性與對照組相比，均顯著降低(P<0.01)。在0.2 g·L-1水楊酸中暴露96 h后，POD活性僅為對照組的9.75%，表明水楊酸處理能顯著降低剛毛藻細胞POD活性。

圖2 不同濃度水楊酸對剛毛藻細胞光合 系統(tǒng)Ⅱ最大光化學效率(Fv/Fm)的影響Fig. 2 Effect of different concentration of salicylic acid on the maximum photochemical efficiency of photosynthetic systemⅡ (Fv/Fm) of C. oligoclona

表1 水楊酸對剛毛藻抑制率的影響Table 1 Inhibition rate of salicylic acid on C. oligoclona

表2 水楊酸處理對剛毛藻的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)Table 2 The median effect concentration (EC50) value of salicylic acid to C. oligoclona

如圖4(c)所示，添加不同濃度水楊酸后剛毛藻細胞中的蛋白含量均顯著降低。對照組可溶性蛋白含量為0.45 mg·g-1，0.2 g·L-1和0.25 g·L-1處理96 h后，剛毛藻細胞可溶性蛋白含量分別降至對照組的39.11%和44%，高濃度0.4 g·L-1水楊酸暴露下，可溶性蛋白含量僅為對照組的36.22%。

2.6 水楊酸對剛毛藻細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響

水楊酸暴露后剛毛藻細胞顯微結(jié)構(gòu)如圖5所示，對照組剛毛藻細胞(圖5(a))整體結(jié)構(gòu)完整，細胞內(nèi)物質(zhì)均勻分布，色素體結(jié)構(gòu)完整，蛋白核清晰可見，細胞呈鮮綠色。

圖3 不同濃度水楊酸對剛毛藻丙二醛(MDA)含量的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 3 Effect of different concentration of salicylic acid on malondialdehyde (MDA) of C. oligoclonaNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖4 不同濃度水楊酸對剛毛藻超氧化物歧化酶(SOD)活性(a)、過氧化物酶(POD)活性(b)和蛋白含量(c)的影響注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effect of different concentration of salicylic acid on superoxide dismutase (SOD) activity (a), peroxidase (POD) activity (b) and protein content (c) of C. oligoclonaNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

圖5 不同濃度水楊酸(SA)對剛毛藻細胞顯微結(jié)構(gòu)的影響(比例尺10 μm) 注：(a) CK；(b) 0.2 g·L-1 SA；(c) 0.25 g·L-1 SA；(d) 0.3 g·L-1 SA；(e) 0.35 g·L-1 SA；(f) 0.4 g·L-1 SA。Fig. 5 Effects of salicylic acid (SA) at different concentrations on the cell microstructure of C. oligoclona (scale 10 μm)Note: (a) CK; (b) 0.2 g·L-1 SA; (c) 0.25 g·L-1 SA; (d) 0.3 g·L-1 SA; (e) 0.35 g·L-1 SA; (f) 0.4 g·L-1 SA.

暴露在0.2～0.4 g·L-1水楊酸下的剛毛藻細胞(圖5(b)～圖5(f))，隨處理濃度的增大，色素含量逐漸減褪；蛋白核數(shù)量減少，藻細胞顏色變黃發(fā)白。

3 討論(Discussion)

藻細胞生物膜中的不飽和脂肪酸會在活性氧物質(zhì)的脅迫下，發(fā)生過氧化，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量高低可反映細胞內(nèi)膜脂過氧化損傷程度[23-24]，還可作為細胞內(nèi)活性氧增多的衡量指標。前人的研究表明，酚酸物質(zhì)能影響藻細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，使藻細胞膜完整性和通透性發(fā)生改變。在香草酸、對羥基苯甲酸和焦性沒食子酸3種酚酸物質(zhì)作用下，中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)細胞發(fā)生膜脂過氧化，MDA含量明顯升高，生長受到顯著抑制[25]。銅綠微囊藻因受到鄰苯三酚和咖啡酸的脅迫，細胞內(nèi)MDA含量增加，細胞膜完整性受影響，顯著抑制藻類生長[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理后，剛毛藻細胞中MDA含量顯著升高，這是由于在水楊酸處理后，誘導產(chǎn)生活性氧等物質(zhì)，在活性氧的作用下，剛毛藻細胞膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化，導致MDA含量升高，膜系統(tǒng)完整性被破壞，使水楊酸更加容易進入到細胞內(nèi)，進一步作用藻細胞內(nèi)其他組織，加速藻細胞死亡。

有研究表明，酚酸類化感物質(zhì)可以通過影響藻細胞內(nèi)葉綠素含量，降低其光合作用效率，使同化產(chǎn)物減少，從而抑制藻類生長[27-28]。胡利靜等[29]研究外源水楊酸對銅綠微囊藻生長和光合系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)0.12 g·L-1水楊酸能有效抑制銅綠微囊藻Chla的合成，阻礙其對光能的吸收和轉(zhuǎn)化，抑制藻類生長。本研究結(jié)果表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，水楊酸處理后，剛毛藻細胞Chla含量明顯降低，且暴露濃度越高，其效果越明顯，呈現(xiàn)出明顯劑量依賴關(guān)系。細胞顯微結(jié)構(gòu)也顯示出剛毛藻細胞色素含量隨水楊酸濃度升高逐漸減褪，證明一定濃度水楊酸處理能導致剛毛藻細胞Chla含量的明顯下降，這與諸多研究結(jié)果相一致[15,30]。PSⅡ是化感物質(zhì)作用于藻類細胞的位點之一[31]，F(xiàn)v/Fm是衡量藻類PSⅡ光合性能的主要參數(shù)，是表征藻類光合作用效率的重要指標[32]。Gao等[33]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸處理萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)后，其Fv/Fm迅速下降，PSⅡ光合活性顯著降低。Dziga等[34]認為焦桔酸、對苯二酚對銅綠微囊藻生長的抑制可能與藻細胞光合系統(tǒng)受到抑制有關(guān)。本試驗結(jié)果中，添加水楊酸處理后的剛毛藻細胞Fv/Fm均顯著低于對照組，可見添加一定量水楊酸能夠?qū)е略寮毎鸓SⅡ受損，降低剛毛藻光合作用效率，使同化產(chǎn)物減少，從而抑制其生長。

生物在進化過程中形成了一套完整的抵抗外界不良因素的抗氧化酶系統(tǒng)，SOD和POD是生物抗氧化酶系統(tǒng)中的2種重要的酶[35-36]，能消除植物體內(nèi)過量的氧自由基，使體內(nèi)的氧代謝處于一個動態(tài)平衡中[37]。當植物受到外界脅迫時，細胞內(nèi)氧自由基濃度上升，當其濃度超過一定范圍，抗氧化體系酶不能及時清除，過量的氧自由基會導致抗氧化體系酶活的降低[38-39]。在本試驗設(shè)定濃度范圍內(nèi)，水楊酸處理后剛毛藻SOD和POD活性明顯下降，蛋白含量顯著低于對照組，推測是剛毛藻在受到水楊酸脅迫后，誘導產(chǎn)生的活性氧劑量上升至或者是超過其細胞抗氧化體系酶的催化閾值，導致SOD和POD不能及時有效清除細胞體內(nèi)過剩的活性氧，代謝平衡被打破，過量的活性氧破壞了細胞內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子，表現(xiàn)出酶活性的下降和蛋白含量的減少，從而抑制藻類生長。

前人研究證明了酚酸類物質(zhì)是一類重要的化感物質(zhì)，可快速抑制多種藻類的生長，易降解，不易在生態(tài)系統(tǒng)中積累，在藻類控制方面具有良好的應(yīng)用前景[40]。由于不同藻類的細胞結(jié)構(gòu)和生理特性等存在差異，對水楊酸敏感程度不同，水楊酸對其抑制濃度也存在明顯差異。本研究證明了一定濃度的水楊酸能有效抑制剛毛藻生長，在0.2～0.4 g·L-1處置濃度范圍內(nèi)，隨水楊酸濃度增加，對剛毛藻抑制效果更明顯。通過擬合計算得出，水楊酸對剛毛藻96 h-EC50為0.262 g·L-1，結(jié)合光合活性、抗氧化酶活性和膜脂過氧化等生理指標測定結(jié)果可知，在半數(shù)抑制濃度0.262 g·L-1下，就能使剛毛藻光合色素和光合活性顯著降低，導致藻細胞PSⅡ失活，無法進行光合作用，同時使膜脂過氧化加劇破壞膜系統(tǒng)完整性，并抑制細胞抗氧化酶活性，對剛毛藻表現(xiàn)出了良好的抑制效果。這說明，水楊酸具有被開發(fā)成剛毛藻快速增殖抑制劑的潛力，具有一定應(yīng)用價值。結(jié)合本試驗結(jié)果并從經(jīng)濟成本角度綜合考慮，針對剛毛藻過度增殖、大量暴發(fā)的水域，建議添加使用濃度為0.262 g·L-1的水楊酸為輔助手段，同時聯(lián)用物理打撈和生物生態(tài)技術(shù)，可達到良好的處置效果。